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Biology

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Abstract

Macrófagos e células dendríticas são células cruciais que formam a primeira linha de defesa contra patógenos. Eles também desempenham papéis importantes no início de uma resposta imune adaptável. Trabalho experimental com estas células é bastante desafiador. Sua abundância em órgãos e tecidos é relativamente baixa. Como resultado, eles não podem ser isolados em grandes números. Eles também são difíceis de transfect com construções de cDNA. No modelo murino, estes problemas podem ser parcialmente superados por diferenciação em vitro de progenitores da medula óssea na presença de macrófagos de M-CSF ou GM-CSF para células dendríticas. Desta forma, é possível obter grandes quantidades dessas células de poucos animais. Além disso, os progenitores da medula óssea podem ser transfectadas com vetores retrovirais carregando do cDNA construções durante as fases iniciais de cultivo antes da sua diferenciação em células dendríticas derivada de medula óssea e macrófagos. Assim, a transdução retroviral seguida de diferenciação em vitro pode ser usada para expressar várias construções de cDNA nestas células. A habilidade de expressar proteínas ectópica substancialmente amplia a gama de experiências que podem ser executadas nessas células, incluindo a imagem de célula viva de proteínas fluorescentes, purificações em tandem para interactome análises, análises de estrutura-função, monitoramento de funções celulares com biosensores e muitos outros. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para retroviral transdução de murino medula óssea derivada de células dendríticas e macrófagos com vetores que codifica para proteínas fluorescente-etiquetadas. O exemplo de duas proteínas do adaptador, OPAL1 e PSTPIP2, vamos demonstrar sua aplicação prática em citometria de fluxo e microscopia. Também discutimos as vantagens e as limitações desta abordagem.

Introduction

Células mieloides representam uma parte indispensável dos nossos mecanismos de defesa contra patógenos. Eles são capazes de eliminar rapidamente os micróbios, bem como células morrendo. Além disso, também estão envolvidos na regulação da reparação e desenvolvimento do tecido e na manutenção da homeostase1,2,3. Todas as células mieloides diferenciarem dos progenitores mieloides comuns na medula óssea. Sua diferenciação em vários subconjuntos funcionalmente e morfologicamente distintos é em grande medida controlada por citocinas e suas várias combinações de4. Os subconjuntos de células mieloides mais intensivamente estudadas incluem neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas. Defeitos em qualquer dessas populações levam a consequências potencialmente fatais e causa graves disfunções do sistema imunológico em humanos e ratos1,2,3,5, 6.

Ao contrário de neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas são células residentes do tecido e sua abundância em órgãos imunes é relativamente baixa. Como resultado, o isolamento e purificação de primárias células dendríticas e macrófagos para experimentos que exigem um grande número dessas células é caro e muitas vezes impossível. Para resolver este problema, foram desenvolvidos protocolos para obter grandes quantidades de homogêneos macrófagos ou células dendríticas em vitro. Essas abordagens baseiam-se a diferenciação das células da medula murino na presença de citocinas: macrófago colônia-estimulando fator (M-CSF) por macrófagos e fator colônia-estimulando de granulócitos macrófagos (GM-CSF) ou Flt3 ligante para células dendríticas7,8,9,10,11,12. As células geradas por esse método são comumente descritas na literatura como medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e medula óssea derivadas de células dendríticas (BMDCs). Eles têm propriedades fisiológicas mais em comum com o primários macrófagos ou células dendríticas do que com linhas de célula correspondente. Outra grande vantagem é a possibilidade de obter estes formam células geneticamente modificadas ratos13. Comparativo de estudos entre o selvagem-tipo pilhas e células derivadas de camundongos geneticamente modificados são muitas vezes críticas para descobrindo novas funções dos genes ou proteínas de interesse.

Análise de Localização subcellular das proteínas nas células vivas requer o acoplamento de uma etiqueta fluorescente à proteína do interesse na vivo. Isto é conseguido mais comumente expressando a construção de fusão geneticamente codificado, composta por uma proteína analisada acoplada (geralmente através de um curto vinculador) a uma proteína fluorescente (EG., verde proteína fluorescente (GFP))14,15 , 16. a expressão de proteínas fluorescente etiquetadas em células dendríticas ou macrófagos é um desafio. Estas células são geralmente difíceis de transfect por procedimentos de transfeccao padrão e as eficiências tendem a ser muito baixa. Além disso, o transfection é transitório, ele gera estresse celular e alcançou a intensidade de fluorescência pode não ser suficiente para microscopia17. A fim de obter uma fração razoável destas células, com um nível suficiente de expressão do transgene, a infecção de células progenitoras de medula óssea com retroviral vetores e sua posterior diferenciação em BMDMs ou BMDCs tornou-se um muito eficiente abordagem. Isso permitiu a análise das proteínas de origem mieloide em seu ambiente nativo de celular, em um estado estável ou durante os processos que são críticos para a resposta imune, tais como a fagocitose, formação de sinapse imunológica ou migração. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a expressão estável de proteínas fluorescente etiquetadas um interesse de murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comité de peritos sobre o bem-estar de animais experimentais do Instituto de Genética Molecular e pela Academia de Ciências da República Checa.

1. preparação do reagente

  1. Prepare o tampão de amônio-cloreto-potássio (ACK). Adicionar 4,145 g de NH4Cl e 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de DDQ2O, em seguida, adicionar 100 µ l de 0,5 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e filtro-esterilizar.
  2. Prepare o polyethylenimine (PEI) solução. Adicionar 0,1 g de PEI a 90 mL de DDQ2O. Agitação, adicione 1 M de HCl gota a gota até que o pH é inferior a 2.0. Mexa para até 3 h até PEI é dissolvido e depois ajustar o pH para 7.2 com 1 M de NaOH. Ajustar o volume a 100 mL com DDQ2O e filtro-esterilizar. Alíquotas de 1 a 2 mL de produzir e armazenar a-20 ° C.
    Nota: Após o descongelamento, PEI pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 semanas mas não deve ser congelado novamente.
  3. Prepare os sobrenadantes de cultura de células contendo M-CSF ou GM-CSF. Estes sobrenadantes podem ser feitas com antecedência e armazenados em-80 ° C. Para tornar estes sobrenadantes, crescem as células produtoras de citocinas (células J558 para GM-CSF 18 ) ou CMG 14-12 M-CSF 19em uma placa de Petri em meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) de 10 cm a confluência. Então, transfira todas as células para 200 mL de mídia em T150 frasco de cultura de tecidos e cultura para dias adicionais de 4 a 5% de CO237 ° C. Recolha o sobrenadante e filtro sobre filtro de esterilização 0,2 µm. Fazer alíquotas e armazenar estas a-80 ° C.
  4. Preparar 100 mL de meio de cultura celular: DMEM suplementado com 10% inactivadas FBS de calor e sobrenadantes de células secretoras de GM-CSF (para diferenciação de BMDC) ou M-CSF (para diferenciação de BMDM).
    Nota: A quantidade de citocinas nestes sobrenadantes pode variar e a concentração de trabalho tem de ser determinado empiricamente. Normalmente, o sobrenadante de 2 – 3% de linhagens celulares, GM-CSF (a concentração inicial recomendada é de 2%) ou sobrenadante de 5 – 10% do CMG 14 – 12 células produtoras produzindo M-CSF (a concentração inicial recomendada é de 10%) é usado. Alternativamente, purificado comercialmente disponível M-CSF em 10 ng/mL e GM-CSF a 20 ng/mL podem ser usado com resultados praticamente idênticos à citocina contendo sobrenadantes, i. e., sem qualquer efeito sobre a taxa de diferenciação, eficiência de infecção e Localização subcellular das construções com tag EGFP. Antibióticos, incluindo penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), podem ser usados para cultura de células em qualquer etapa do protocolo, a menos que indicado o contrário.

2. produção de retrovírus

Atenção: Embora vetores retrovirais são relativamente seguros quando comparado a outros tipos de vetores virais, eles ainda apresentam um risco potencial de segurança. Portanto, é fundamental para trabalhar com o maior cuidado e equipamento de protecção e aderir a todos os regulamentos de segurança e os requisitos legais para trabalhar com partículas virais.

  1. Uma suspensão de célula única de células de empacotamento Platinum-Eco (Plat-E) em uma placa de Petri de 10 cm da placa e cultivar em 15 mL de DMEM contendo 10% FBS até 50-60% de confluencia (24h). As células devem crescer em um monolayer e não devem formar grupos na cultura.
  2. Pipeta de 20 µ g de construção retroviral (EG., construção de expressar a proteína fluorescente etiquetada de interesse do vetor de pMSCV) e 10 µ g de pCL-Eco embalagem vector20 em 1 mL de DMEM (sem o soro e antibióticos) e misture suavemente.
  3. Para um segundo tubo, adicione 75 µ l de PEI em 1 mL de DMEM (sem o soro e antibióticos). Incubar a 5 min à temperatura ambiente (RT) e então misture o conteúdo de ambos os tubos e incube por adicional 10 min a RT
    Nota: A adição de pCL-Eco é opcional. Isso é que codifica para o receptor viral ecotropic e pode aumentar a concentração de vírus.
  4. Cuidadosamente, substituir o medium em células Plat-E com 8 mL de DMEMsupplemented fresco com 2% FBS. Pré-aquecer a médio e a 37 ° C antes do uso. Não utilize antibióticos durante a transfeccao, desde que os antibióticos podem reduzir a eficiência do transfection.
  5. Cuidadosamente adicione (em gotas) a mistura preparada no passo 2.3 nas células Plat-E e incube por 4 h a 37 ° C.
  6. Após a incubação, trocar o meio em células Plat-E para 10 mL de DMEM pré-aquecido contendo 10% FBS e cultivar as células por 24 h a 37 ° C. Durante esta incubação, as células Plat-E irão produzir vírus na mídia.
  7. Após 24h, recolher o meio contendo partículas retrovirais de platina Eco células usando uma pipeta de 5 mL e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL (= "sobrenadante 1", que contém partículas retroviral ecotropic).
  8. Para evitar contaminação por células Plat-E em sobrenadantes virais, girar o vírus coletado em 1250 × g por 5 min a 4 ° C. Para os melhores resultados, o vírus deve ser usado imediatamente para a infecção.
    Nota: Alíquotas de vírus também podem ser armazenadas a-80 ° C para uso posterior. No entanto, resultará em certa redução na eficiência de transdução. Evite congelamento/descongelamento repetitiva do vírus, uma vez que leva à degradação do vírus.
  9. Adicionar 10 mL de DMEM previamente aquecido com 10% FBS para Plat-E células e cultivar para outro 24h a 37 ° C.
  10. Repita os passos de 2.7. e 2.8. para obter "sobrenadante 2".

3. isolamento de célula de medula murino

  1. Sacrifica o mouse usando o deslocamento cervical ou outro método aprovado. Pulverize o mouse com etanol a 70%.
  2. Usando uma pinça e tesoura, retire a pele, bem como parte dos músculos da pernas traseiras. Cuidadosamente, desalojar o acetábulo da articulação do quadril sem quebrar o fêmur. Cortou a pata na articulação do tornozelo. Pulverize os ossos (fêmur conectado ao tibia) com 70% de etanol e remova o resto dos músculos usando uma toalha de papel.
  3. Coloque os ossos em um prato de Petri de 5 cm contendo solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) com 2% FBS (PBS-FBS).  Se preparando mais ossos, mantenha o prato de Petri no gelo até processada.
  4. Para garantir a esterilidade de cultivo, execute todas as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos.
  5. Separe o fêmur a tíbia sem quebrar as extremidades ósseas (curva no joelho comum e cuidadosamente corte com tesoura).
  6. Processe os ossos um por um. Corte uma parte muito pequena das epífises (aproximadamente 1-2 mm) com uma tesoura, mantendo o osso em pinça.
  7. Use uma agulha de 30g e um 2 ou seringa de 5 mL de PBS-FBS para lavar as células da medula óssea de ambos os lados do osso em um tubo de centrífuga de 15 mL. Mova a agulha dentro do osso durante a descarga a fim de remover todas as células. Se a agulha fica entupida, mudá-lo.
    Nota: Ossos devem virar de vermelho para branco durante a lavagem. Isso indica que a maioria das células foram retirada do osso. Use aproximadamente 2-3 mL de PBS-FBS por osso.
  8. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
  9. Desprezar o sobrenadante e lisar os glóbulos vermelhos por resuspending a pelota em 2,5 mL de tampão ACK para 2-3 min à temperatura ambiente. Durante a Lise, filtre as células de medula óssea através de um filtro de célula de 100 μm em um tubo de centrifug de 15 mL. Restaure a tonicidade adicionando 12 mL de PBS-FBS.
    Nota: Não exceda a 5 min do lysis hipotônica com buffer ACK para evitar a morte celular.
  10. Centrifugar imediatamente a 500 x g por 5 min a 4 ° C.

4. medula óssea diferenciação de células na medula óssea derivada de macrófagos

  1. Resuspenda o pellet de células de medula óssea em DMEM suplementado com 10% FBS e antibióticos (consulte a observação após etapa 1.4. para a concentração de antibiótica) e contar as células. Para diferenciação em BM derivada de macrófagos, placa 5 – 10 x 106 de células da medula óssea em 10 cm não-cultura de tecido Tratado (bacteriana) placa de Petri com 10 mL de pré-preparados mídia DMEM com soro e M-CSF de passo 1.4.
    Nota: O rendimento das células da medula óssea é aproximadamente de 4 x 107 por semana de 6-8-rato velho C57BL/6J.
  2. Incubar as células na incubadora de cultura celular dias 3 a 5% CO2, 37 ° C.
    Nota: Durante os primeiros 2 dias, as células não olhe muito vital, como um grande número de pilhas apoptotic é presente (células incapazes de se diferenciar em células mieloides e células terminalmente diferenciadas).
  3. Depois de 3 dias, a cultura de células de medula óssea começa a olhar vital e formam-se aglomerados de dividir células. Primeiras células aderentes já podem ser observadas. Neste ponto, completar as células com mídia de citocina fresco.
  4. Adicionar 10 mL de mídia previamente aquecida de DMEM com soro e M-CSF (da etapa 1.4) em cada placa de Petri de 10 cm e devolvê-lo na incubadora de cultura celular. Não há nenhuma necessidade de remover a velha mídia durante esta etapa.
    Nota: os macrófagos da medula óssea são totalmente diferenciados após 5-7 dias em cultura. A melhor época para colheita é no dia 6-8, onde a maioria das células são aderentes e o prato de Petri é completamente coberto.
  5. No dia 5, leve o prato de Petri ao subúrbio de cultura celular e incline o prato, até que a mídia está quase alcançando a borda do prato. Retire cuidadosamente a 15 mL de mídia da superfície perto da borda, e as células tendem a ficar no meio do prato. Adicione o mesmo volume de mídia previamente aquecido com M-CSF e coloque o prato de volta para a incubadora.
    Nota: Se a mídia for aspirada lentamente e com cuidado, quase nenhuma célula é perdida. No entanto, também é possível centrifugar a mídia aspirada e adicionar as células de volta para a cultura, para não garantir que nenhum não-aderente (IE., incompleta diferenciada) células são perdidas.
  6. Para experiências, são usadas apenas pilhas aderentes (macrófagos). Para colher células, no dia 6 ou 7, remova todas as mídias e células flutuantes. Lave o prato uma vez com PBS pré-aquecido sem soro.
  7. Adicionar 5 mL de EDTA 0,02% em PBS e incubar durante 3-5 min a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos.
  8. Utilizando uma pipeta de 5 mL, remova as pilhas do prato por um fluxo de PBS-EDTA e colocá-los em um tubo de centrífuga de 50 mL com 25 mL de PBS. Se necessário, juntar mais pratos.
  9. Centrifugar imediatamente a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
  10. Ressuspender o macrófago na mídia DMEM e contar as células. Verifique se a expressão de marcadores de diferenciação de superfície do macrófago (CD11b e F4/80) por citometria de fluxo.
  11. Para experimentos que requerem as células em suspensão, por exemplo., fluxo cytometry experimentos, qPCR ou análise ocidental do borrão, usar os macrófagos diretamente. Para experimentos com macrófagos aderentes, as células da placa de cultura de tecidos de acordo com a instalação experimental da placa.
  12. As células estão já totalmente diferenciadas. Mantê-los nos meios de comunicação adequados para o experimento pretendido ou da mídia original do crescimento e diferenciação com M-CSF.
    Nota: Para trabalhar com macrófagos aderentes, transferi-los para uma nova chapa de pelo menos 6 horas antes do uso (idealmente durante a noite) para permitir a plena adesão à superfície nova. A pequena fração de células de flutuação pode ser removida antes do experimento.

5. medula óssea diferenciação de células na medula óssea derivadas de células dendríticas

  1. Siga o protocolo para BMDMs com ajustes específicos para BMDCs descritos abaixo em etapas 5.2 – 5.4.
  2. Resuspenda o pellet obtido de células de medula óssea no DMEMsupplemented com 10% FBS e antibióticos e contar as células (pelo seguinte passo 4.1 do protocolo de macrófagos). Para diferenciação em células dendríticas, placa 1 – 1,5 x 107 células de medula óssea em 10 cm não-cultura de tecido Tratado (bacteriana) placa de Petri em 10 mL de pré-preparados mídia DMEM com soro e GM-CSF (da etapa 1.4.).
  3. Siga as mesmas etapas de cultivo como no protocolo de BMDM (passos 4.3 – 4.5. protocolo de macrófagos). Use mídia DMEM com soro e GM-CSF em vez de M-CSF. Desde que para BMDCs o tempo de cultivo é mais longo (tipicamente 10-12 dias), adicione 1 – 2 alimentações adicionais em intervalos de 3 dias (remover o sobrenadante e adicionar uma nova mídia de cultivo, conforme descrito no passo 4.5.).
  4. Esta parte do protocolo é praticamente o mesmo que a parte correspondente do protocolo macrófago (passos 4.6 – 4.12. do protocolo de macrófagos). Para experiências use apenas pilhas aderentes. No dia 10-12, coletar as células usando EDTA, contar e placa-los sobre uma superfície nova. Verifique se a expressão de marcadores de superfície de diferenciação de células dendríticas (CD11c +, CD11b +, F4/80-) por citometria de fluxo.

6. produção de BMDMs e BMDCs expressando EGFP-etiquetado proteína do interesse

  1. Ressuspender o precipitado de células de medula óssea obtido na etapa 3.10. em DMEM suplementado com 10% FBS e antibióticos e contar as células. Para a infecção, usar 2 – 5 x 106 de células de BM por poço de cultura de tecido 6-bem tratada a placa.
  2. Placa, as células em 1 mL da mídia DMEM preparada por bem, complementadas com M-CSF para diferenciação em BMDMs ou com GM-CSF para diferenciação em BMDCs... manter as células para 4-6 h em uma incubadora de cultura de tecidos com 5% CO2 a 37 ° C.
  3. Adicione 2 mL de vírus recém coletado ("sobrenadante 1") suplementado com polybrene (12 µ g/mL, concentração final 8 µ g/mL após adição às células).
    Nota: Congelada alíquota do sobrenadante contendo vírus também pode ser usada, mas a eficácia será menor.
  4. Centrifugue a placa em 1.250 x g, durante 90 minutos a 30 ° C (com lenta aceleração e desaceleração). Em seguida, incubar durante 4 h com 5% CO2 a 37 ° C.
  5. Opcional: Substituir 2 mL dos meios de cultura com fresca média contendo respectiva citocina (M-CSF ou GM-CSF) e cultura com 5% CO2 a 37 ° C. No segundo dia, remover 2 mL de meio de cultura e repita o procedimento de toda infecção (etapa 6.3 – 6.4) com 2 mL de vírus recém coletados ("sobrenadante 2").
    Nota: Este passo pode aumentar a eficácia de infecção. Melhoria após a segunda infecção é dependente da proteína de tipo e alvo de célula e em nossa experiência pode variar de aumento de 30% em eficiência para nenhuma melhoria em tudo.
  6. Recolher as células não-aderentes, transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL e girar a 500 x g por 5 min (4 ° C). Desprezar o sobrenadante.
  7. Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura com M-CSF ou GM-CSF, colocar as células em um prato de Petri de 10 cm cultura de não-tecidos tratados e cultura a 37 ° C, 5% de CO2. Número ideal de células para um prato de 10 cm é de 5 – 10 x 106 para BM-derivada de macrófagos e 10 – 15 x 106 para BM-derivado de células dendríticas.
    Nota: Pratos ou placas menores podem ser usadas, mas números de telemóvel devem ser ajustados em conformidade.
  8. Siga o macrófago e protocolo de cultivo e diferenciação de células dendríticas descrito na etapa 4 e 5.

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Representative Results

Sinalização de adaptador de proteínas é geralmente pequenas proteínas sem qualquer atividade enzimática. Eles possuem vários domínios de interação ou motivos, que mediam a ligação a outras proteínas envolveram na transdução de sinal, incluindo tirosina quinases, fosfatases, ubiquitina ligases e outros21. Para a demonstração da funcionalidade do presente protocolo, adaptadores de células mieloides, PSTPIP2 e OPAL1 foram selecionados. PSTPIP2 é uma bem caracterizadas proteínas envolvidas na regulação da resposta inflamatória22. É uma proteína citoplasmática, que também pode ser recrutada para as membranas celulares através de seu domínio de F-bar. Segunda proteína é um adaptador do transmembrane OPAL1, esperado para ser associado com membranas celulares. Sua função fisiológica ainda é desconhecida. No entanto, na leucemia linfoblástica aguda, expressão de OPAL1 está associado com melhor prognóstico23.

cDNA constrói a codificação para PSTPIP2 ou OPAL1 fundido através de um curto vinculador (GSGGGS ou Myc-tag, respectivamente) para EGFP no C-terminal foram clonados no vetor retroviral pMSCV usando métodos padrão de clonagem do cDNA. Essa construção foi então transfectada em células Plat-E juntamente com a embalagem vector pCL-Eco. Os sobrenadantes resultantes contendo retrovírus foram usados para a transdução de células de medula óssea, seguido de diferenciação em BMDMs e BMDCs. A eficácia do transfection Plat-E foi avaliada por citometria de fluxo após a coleta do sobrenadante contendo vírus segundo. Eficiência média do transfection foi 62% para PSTPIP2-EGFP e 53% para OPAL1 e os resultados foram altamente reprodutível (figura 1A, B). OPAL1 construção parecia ser mais tóxico para Plat-E células (avaliadas pelo aparecimento de células flutuante/morrendo em cultura), resultando em uma redução das percentagens de células transfectadas.

Status de diferenciação da medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas (transfectadas com construções retrovirais PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP) foi avaliada por citometria de fluxo. População de macrófagos maduros é definida pela expressão de CD11b e F4/80, enquanto células dendríticas expressam o marcador de linhagem CD11c. Mais de 90% das células em ambos os tipos de cultura foram positivas para seus respectivos marcadores (Figura 2A, B). Finalmente, determinamos que o nível de expressão de PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP constrói em BMDMs e BMDCs por uma medição de citometria de fluxo simples de fluorescência EGFP. A percentagem média de macrófagos EGFP-positivo foi de 71% para PSTPIP2-EGFP e 62% para OPAL1-EGFP (Figura 3A). No caso de células dendríticas, a eficiência era baixa, 32% para PSTPIP2 e 9% para OPAL1 (Figura 3B). Os resultados de vários experimentos demonstram a reprodutibilidade do método (Figura 3).

Nós normalmente não determinar a concentração de vírus nos sobrenadantes que usamos em infecções. Nós preferimos usar o vírus sobrenadantes fresco, imediatamente após a colheita, enquanto a determinação do título de vírus requer três dias adicionais. Como resultado, as informações sobre o título do vírus só podem ser obtidas ex post. No entanto, ainda pode ser útil quando resolver problemas e questões técnicas. Para avaliar a concentração de vírus em sobrenadantes de Plat E células transfectadas com PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP constrói, nós incubadas células NIH-3T3 com serialmente diluídas contendo vírus sobrenadantes coletados destas células transfectadas de Plat-E e determinado título vírus exatamente como descrito por Zjablovskaja et al . artigo publicado anteriormente JoVE24. Em três experimentos independentes, o título de vírus variou de 1,1 x 106 a 4.4 x 106 TU/mL. Nós não observaram diferenças substanciais entre PSTPIP1-EGFP e construções OPAL1-EGFP e sobrenadantes de dia 1 e dia 2. Quando estes sobrenadantes foram utilizados para infecções de célula da medula óssea de acordo com o protocolo que estamos descrevendo neste artigo, a multiplicidade de infecção (MOI) variou de 1,1 a 4,4. Curiosamente, dentro desse intervalo, nós não observaram qualquer correlação entre eficiência MOI e infecção.

Na Figura 4, PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP, expressado em BMDMs e BMDCs foram visualizados por microscopia confocal. Totalmente diferenciado de macrófagos e células dendríticas têm uma forma característica. A mudança na morfologia de células progenitoras arredondado pequeno para as grandes células de formas irregulares confirma diferenciação bem-sucedida. Em macrófagos, PSTPIP2 era citoplasmática com localização parcial na membrana plasmática. OPAL1 apareceu para ser também parcialmente direcionados para a membrana plasmática. O resto foi provavelmente associado com membranas intracelulares, como o retículo endoplasmático e complexo de Golgi. No entanto, para confirmar esta localização, marcadores específicos organela teria de ser usado. Em células dendríticas, a localização da membrana foi menos aparente.

Figure 1
Figura 1: eficiência do transfection da pilha Plat-E. Para transfeccao de células Plat-E, duas construções codificação proteínas do adaptador PSTPIP2 e OPAL1 fundidas com EGFP (PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP) foram clonadas no vetor pMSCV. Realizou-se o padrão transfeccao de PEI. A eficácia do transfection foi avaliada por citometria de fluxo das células Plat-E após a coleta do sobrenadante viral segundo. (A). lote de citometria de fluxo representativo. (B). gráfico mostrando os resultados de quatro experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: avaliação do estado de diferenciação das BMDMs (A) e BMDCs (B). Expressão de superfície de macrófagos específicos e marcadores de linhagem de células dendríticas foi medida por citometria de fluxo no dia 8 de cultivo. Células mortas foram fechadas para fora com base em seu lado e propriedades de dispersão para a frente e coloração com Hoechst 33258. Os resultados são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: avaliação da expressão de PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP. Fluorescência da EGFP em BMDMs (A) e BMDCs (B) retrovirally transfectada com construções PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP foi medida por citometria de fluxo no dia 8 de cultivo. (C) . Gráfico mostrando os resultados de vários experimentos independentes. BMDMs e BMDCs foram bloqueados como ilustrado na Figura 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: imagens representativas de macrófagos e células dendríticas expressando PSTPIP2 ou OPAL1. BMDMs (A) e BMDCs (B) expressando PSTPIP2 e OPAL1 foram visualizados por microscopia confocal de imagens ao vivo. Fluorescência de EGFP em verde é mostrada no lado esquerdo de cada painel, imagem de campo brilhante à direita. Barra de escala = 10 µm. Os resultados são representativos pelo menos três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A expressão da proteína de interesse em células-alvo é uma etapa chave em muitos tipos de estudos biológicos. Diferenciada de macrófagos e células dendríticas são difíceis de transfect por transfecção padrão e técnicas de transdução retroviral. Ignorando o transfeccao dessas células diferenciadas com retroviral transdução da medula óssea progenitores, seguido de diferenciação, quando eles já carregam a construção desejada, é um passo crítico, permitindo a expressão dos cDNAs ectópica nestes tipos de células. Um exemplo de utilização bem sucedida deste método pode ser encontrado em nossa recente publicação25. Aqui, nós fornecemos um protocolo cost-effective para alcançar expressão estável da construção de escolha na medula óssea-derivado de células dendríticas e macrófagos usando esta abordagem. O procedimento que apresentamos é relativamente barato e simples, ainda, entregando resultados muito bons. Os reagentes utilizados neste protocolo permitem seu uso rotineiro, mesmo sob um orçamento relativamente restritivo. O protocolo para transfeccao Plat-E emprega PEI como um reagente de transfeccao. Comparado a outros agentes químicos transfeccao, PEI é de um custo muito baixo, enquanto sua eficiência é semelhante à maioria dos outros amplamente utilizados compostos. No entanto, o PEI pode ser substituído com muitos diferentes reagentes de transfecção comercialmente disponíveis nesta etapa sem perda de eficiência. Como um princípio orientador, protocolos de transfeccao, conhecidos por trabalhar com células HEK293 comumente usados normalmente executam bem com células Plat-E, também. Outra medida de custo-benefício é a utilização de citocina-contendo sobrenadantes em vez de citocinas recombinantes purificadas. O uso destes sobrenadantes requer alguma otimização. No entanto, quando o protocolo padrão para a sua preparação é estabelecido e seguido, a variabilidade entre lotes individuais destes sobrenadantes torna-se muito baixa, não exigindo geralmente nenhuma alteração em concentrações entre lotes individuais de trabalhar. As eficiências de diferenciação BMDM e BMDC com estes sobrenadantes são, em nossa experiência, idêntica às citocinas purificadas.

Além de transdução retroviral, outros métodos bem estabelecidos de transfecção de células de mamíferos existem, incluindo transfection químico (tipicamente usando lipídios catiônicos ou polímeros cationic, formando complexos com o DNA), eletroporação e o uso de outros tipos de vetores virais, principalmente sistemas de adenovírus e Particulas de Lentivirus26,,27,28,29,30. Embora as eficiências e muito altos títulos podem ser conseguidas com a entrega do gene baseados em adenovírus, a preparação de plasmídeos correspondentes e partículas virais são mais difícil e demorado do que no caso de sistemas retroviral29. Além disso, adenovírus provoca resposta inflamatória em células dendríticas e macrófagos29,31,32 e para um ótimo desempenho em células hematopoiéticas murino rato tensão carregando transgênicos o receptor de adenovírus é necessário33. Por outro lado, a geração de particulas de Lentivirus carreg o gene de interesse é um processo relativamente simples, praticamente idêntico ao utilizado para os retrovírus. Em contraste com os vetores retrovirais ecotropic utilizados neste protocolo, lentivírus são capazes de infectar células de não-proliferação de várias espécies, incluindo seres humanos34. Isto pode ser uma vantagem importante nas condições experimentais específicas. No entanto, esse recurso também muito compromete a segurança destes vetores. Em nossa opinião, para a entrega do gene BMDMs e BMDCs, retrovírus fornecem o melhor equilíbrio de eficiência, segurança e facilidade de uso. Construções de DNA retrovirais podem ser facilmente preparadas usando técnicas de clonagem moleculares padrão simples. Vírus é produzido por linhas celulares diretamente para a sobrenadante de cultura de empacotamento e depuração adicional de vírus geralmente não é necessária. Ecotropic retrovírus também não prontamente infectar células humanas, o que faz com que seu uso relativamente seguro. No entanto, também existem algumas desvantagens gerais associadas com o uso dos vetores retrovirais. O principal fator limitante é que estes vírus infectam somente se proliferando células35. Este recurso não afeta significativamente o protocolo descrito aqui, mas limita a gama de aplicações onde os vetores retrovirais podem ser usados. O tamanho do gene de interesse que pode ser clonado nestes vetores também é limitado e o título de partícula viral diminui com o aumento de tamanho de inserção. Com vetores de pMSCV, geralmente começamos vendo efeitos de inserção de tamanho em cerca de 3 kbp. Com novos aumentos no tamanho de inserção, a eficiência da infecção gradualmente declina.

O transfection químico e eletroporação são mais fáceis de usar, mais seguro e menos demorado do que qualquer um dos procedimentos baseados no vírus27,26,28,30. No entanto, em BMDMs e BMDCs, podem estimular respostas para estrangeiros ácidos nucleicos31 e eles geram stress mais celular. Além disso, alguns reagentes químicos transfeccao aumentam celular autofluorescência que pode interferir com a citometria de fluxo ou microscopia analisa. Devido a natureza transitória de expressão, só pode ser usados com maduras diferenciadas BMDMs ou BMDCs. Em contraste, as sequências introduzidas com vetores retrovirais são permanentemente integradas ao genoma das células alvo e permitam um expressao de longa duração compatíveis com a escala de tempo de protocolos de diferenciação,34, 35. no entanto, esse recurso também aumenta o risco de mutagênese insercional. Devido à natureza relativamente aleatória da integração vector, limitam-se aos seus efeitos sobre as grandes populações de células. No entanto, podem ser visíveis ao nível das células individuais. Problemas adicionais podem surgir quando uma construção expressada do vetor retroviral afeta células dendríticas ou diferenciação de macrófagos, resultando em falha ao gerar diferenciada BMDMs ou BMDCs dos progenitores infectados. Em certa medida, isto pode ser superado, ajustando as condições de infecção para atingir níveis baixos de expressão (EG., reduzindo a concentração de vírus) ou através da utilização de um sistema de expressão inducible. O uso de EGFP fundida à proteína de interesse ou como repórter também permite para classificação de células com nível de expressão correspondente a limitações e os objetivos do experimento. Finalmente, devemos também mencionar problemas comuns a todos os procedimentos de transfeccao/transdução. Estes incluem principalmente artefatos de superexpressão, tais como proteínas, enrolamento, toxicidade e mislocalization36. Toxicidade de proteína pode ser a razão por que o OPAL1 era relativamente difícil de expressar. Seu exemplo ilustra claramente que a natureza da proteína expressa pode afectar substancialmente a eficácia deste método. No entanto, apesar disso, fomos capazes de obter quantidades suficientes de OPAL1-EGFP expressando as células para análise de microscopia com este método, demonstrando a sua utilidade, mesmo quando lidando com alvos difíceis. Além disso, seria possível aumentar as percentagens de células transduzidas classificando FACS se necessário por um aplicativo específico. A eficiência baixa infecção também pode ser parcialmente superada pelo aumento da concentração de partículas virais usando vários métodos ou kits prontos para uso. Em nossas mãos, ultrafiltração do sobrenadante viral em filtros centrífugos com um peso molecular cortar fora 100 kDa provou-se para fornecer o melhor equilíbrio entre eficiência e esforço necessário.

Medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas são ferramentas amplamente utilizadas em Imunologia do fagócito. Eles são fisiologicamente mais relevantes do que a linha celular disponível. Eles podem ser gerados em números relativamente elevados e, ao mesmo tempo, faltam a característica de heterogeneidade e a instabilidade genética de linhas celulares. Outra vantagem é que eles podem ser gerados de camundongos geneticamente modificados para estudar os efeitos da modificação genética em uma população de células relativamente abundante e homogénea. Isto é particularmente útil em estudos bioquímicos, onde relativamente grandes quantidades de células são normalmente necessárias. A capacidade de transduce estas células com construções de cDNA abre possibilidades adicionais de pesquisa baseada na reconstituição ou complementação de defeitos genéticos nestas células e análise de estrutura-função.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Checa Science Foundation (GACR) (número do projeto 16-07425S), por Charles University Grant agência (SAUNG) (número do projeto 923116) e pelo financiamento institucional do Instituto de Genética Molecular, Academia de Ciências da República Checa República (RVO 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

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