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Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Abstract

Macrófagos y células dendríticas son células cruciales que forman la primera línea de defensa contra patógenos. También juegan papeles importantes en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa. Trabajo experimental con estas células es más bien un desafío. Su abundancia en órganos y tejidos es relativamente baja. Como resultado, no puede ser aislados en grandes cantidades. También son difíciles de transfectar con construcciones de cDNA. En el modelo murino, estos problemas pueden superarse parcialmente por en vitro la diferenciación de progenitores de médula ósea en presencia de M-CSF para macrófagos GM-CSF de las células dendríticas. De esta manera, es posible obtener grandes cantidades de estas células de muy pocos animales. Por otra parte, progenitores de médula ósea pueden ser transduced con vectores retrovirales que construcciones de cDNA durante etapas tempranas del cultivo antes de su diferenciación en la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos. Por lo tanto, transducción retroviral seguida de diferenciación en vitro puede utilizarse para expresar diversas construcciones de cDNA en estas células. La habilidad de expresar proteínas ectópicas substancialmente amplía la gama de experimentos que se pueden realizar en estas células, incluyendo células vivas imágenes de proteínas fluorescentes, purificaciones de tándem para interactoma análisis, análisis de la estructura y función, seguimiento de las funciones celulares con biosensores y muchos otros. En este artículo, describimos un protocolo detallado para la transducción retroviral de murino la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos con vectores que codifica para las proteínas con etiqueta fluorescente. En el ejemplo de dos proteínas, OPAL1 y PSTPIP2, demostramos su aplicación práctica en microscopia y citometría de flujo. También discutimos las ventajas y limitaciones de este enfoque.

Introduction

Las células mieloides representan una parte imprescindible de nuestros mecanismos de defensa contra patógenos. Son capaces de rápidamente eliminar microbios, así como las células moribundas. Además, también están involucrados en la regulación de la reparación y desarrollo de tejido y en el mantenimiento de la homeostasis1,2,3. Todas las células mieloides se diferencian de la común progenitores mieloides de la médula ósea. Su diferenciación en muchos subconjuntos funcionalmente y morfológicamente distintos es en gran parte controlada por citoquinas y sus diversas combinaciones4. Los subconjuntos de células mieloides más intensamente estudiadas son granulocitos, macrófagos y células dendríticas. Defectos en cualquiera de estas poblaciones llevan a consecuencias potencialmente peligrosas para la vida y causa graves disfunciones del sistema inmunitario en humanos y ratones1,2,3,5, 6.

A diferencia de los granulocitos, macrófagos y células dendríticas son células residentes del tejido y su abundancia en los órganos inmunes es relativamente baja. Como resultado, el aislamiento y purificación de primarias células dendríticas y macrófagos para experimentos que requieren un gran número de estas células es costoso y a menudo imposible. Para resolver este problema, se han desarrollado protocolos para obtener grandes cantidades de homogéneos macrófagos o células dendríticas in vitro. Estos enfoques se basan en la diferenciación de células de médula ósea murina en presencia de citoquinas: factor de estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) de macrófagos y el factor colonia-estimulante del granulocyte-macrófago (GM-CSF) o el ligando Flt3 para 8,7,9,10,de las células dendríticas de11,12. Células generadas por este método comúnmente se describen en la literatura como la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs) y la médula ósea derivados de células dendríticas (BMDCs). Tienen propiedades fisiológicas más en común con primarios macrófagos o células dendríticas que con líneas celulares correspondientes. Otra gran ventaja es la posibilidad de obtener estos forman células genéticamente modificados ratones13. Estudios comparativos entre las células de tipo salvaje y las células derivadas de ratones genéticamente modificados son a menudo críticas para descubrir nuevas funciones de genes o proteínas de interés.

Análisis de la localización subcelular de las proteínas en las células vivas requiere el acoplamiento de una etiqueta fluorescente de la proteína de interés en vivo. Esto comúnmente se logra expresando construcción genéticamente codificados fusión compuesta por una proteína analizada juntada (a menudo vía un enlazador corto) a una proteína fluorescente (por ej., proteína fluorescente (GFP) de verde)14,15 , 16. la expresión de fluorescencia etiquetas proteínas en las células dendríticas o macrófagos es un reto. Estas células son generalmente difíciles de transfectar por procedimientos estándar de la transfección y la eficiencia tiende a ser muy baja. Por otra parte, la transfección es transitoria, genera estrés celular y alcanzado intensidad de la fluorescencia puede no ser suficiente para microscopia17. Para obtener una fracción razonable de estas células con un suficiente nivel de expresión de transgenes, la infección de células progenitoras de médula ósea con retroviral vectores y su posterior diferenciación en BMDMs o BMDCs se ha convertido en un muy eficiente enfoque. Ha permitido el análisis de las proteínas de origen mieloide en su entorno celular nativo, en un estado estacionario o en procesos que son críticos para la respuesta inmune tales como fagocitosis, formación de la sinapsis inmunológica o migración. Aquí, describimos un protocolo que permite la expresión estable de fluorescencia etiquetas proteínas de interés en murinos la médula ósea derivado de macrófagos y células dendríticas.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de expertos sobre bienestar de animales de experimentación del Instituto de Genética Molecular y por la Academia de Ciencias de la República Checa.

1. preparación del reactivo

  1. Preparar el tampón amonio cloruro de potasio (ACK). Añadir 4,145 g de NH4Cl y 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de ddH2O, añada 100 μl de 0.5m ácido etilendiaminotetracético (EDTA) y esterilizar filtro.
  2. Preparar solución de polietilenimina (PEI). Añadir 0.1 g de PEI a 90 mL de ddH2O. Mientras que revuelve, agregue 1 M HCl gota a gota hasta que el pH es inferior a 2.0. Remover durante 3 h hasta que se disuelva el PEI y luego ajustar el pH a 7.2 con 1 M NaOH. Ajustar el volumen a 100 mL con ddH2O y esterilizar por el filtro. Hacer alícuotas de 1 a 2 mL y almacenar a-20 ° C.
    Nota: Después de descongelar, PEI puede almacenarse a 4 ° C hasta por 2 semanas pero no debe volver a congelarse.
  3. Preparación de sobrenadantes de cultivo celular que contiene M-CSF o GM-CSF. Estos sobrenadantes pueden ser adelantados y almacenados a-80 ° C. Para hacer estos sobrenadantes, crecen las células productoras de citoquinas (células J558 para GM-CSF 18 ) o CMG 14-12 para el M-CSF 19en una placa de Petri en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) de 10 cm a confluencia. Luego se transfieren todas las células a 200 mL de medio en frasco de cultivo de tejidos T150 y cultura durante 4 días adicionales en el 5% CO237 ° C. Recoger el sobrenadante y el filtro sobre 0,2 μm filtro de esterilización. Hacer alícuotas y almacenar a-80 ° C.
  4. Preparar 100 mL de medio de cultivo celular: DMEM suplementado con 10% SFB inactivado de calor y sobrenadantes de cultivo de células secretoras de GM-CSF (por diferenciación de BMDC) o el M-CSF (para la diferenciación de BMDM) de la célula.
    Nota: Puede variar la cantidad de citoquinas en los sobrenadantes y la concentración del trabajo debe determinarse empíricamente. Normalmente, se utiliza el sobrenadante 2 – 3% de líneas celulares de producción de GM-CSF (la concentración inicial recomendada es de 2%) o 5-10% de sobrenadante de CMG 14 – 12 células productoras M-CSF (la recomendada concentración inicial es 10%). Por otra parte, purificada comercialmente disponible M-CSF 10 ng/ml y GM-CSF a 20 ng/mL pueden utilizarse con resultados prácticamente idénticos a los sobrenadantes del cytokine-que contienen, es decir., sin ningún efecto sobre la tasa de diferenciación, la eficiencia de la infección y localización subcelular de construcciones EGFP-marcados con etiqueta. Antibióticos, incluyendo penicilina G (100 UI/mL) y estreptomicina (100 μg/mL), gentamicina (40 μg/mL), pueden utilizarse para el cultivo celular en cualquier paso del Protocolo a menos que se indique lo contrario.

2. producción de Retrovirus

PRECAUCIÓN: Aunque los vectores retrovirales son relativamente seguros comparado con otros tipos de vectores virales, ellos todavía plantean un peligro de seguridad potencial. Por lo tanto, es fundamental trabajar con el máximo cuidado y equipo de protección adecuado y cumplir con todas las normativas y requisitos legales para trabajar con partículas virales.

  1. Una suspensión unicelular de células de platino-Eco (Plat-E) envasado en una caja de Petri de 10 cm de la placa y cultivar en 15 mL de DMEM con 10% FBS hasta 50-60% confluente (24 h). Las células deben crecer en una monocapa y no deben formar grumos en la cultura.
  2. Pipeta 20 μg de construcción retroviral (e.g., la construcción, expresando la proteína fluorescente etiquetada de interés en el vector de pMSCV) y 10 μg de pCL-Eco packaging vector20 en 1 mL de DMEM (sin suero y antibióticos) y mezclar suavemente.
  3. A un segundo tubo, agregar 75 μl de PEI en 1 mL de DMEM (sin suero y antibióticos). Incubar 5 min a temperatura ambiente (RT) y luego mezclar el contenido de ambos tubos e incubar adicional 10 min a TA.
    Nota: Además de pCL-Eco es opcional. Codificación para el receptor viral ecotropic y puede aumentar la concentración de virus.
  4. Vuelva a colocar cuidadosamente el medio en las células de Plat-E con 8 mL de DMEMsupplemented fresco con 2% FBS. Pre-calentar el medio a 37 ° C antes de usar. No utilice antibióticos durante la transfección, puesto que los antibióticos pueden reducir la eficacia de transfección.
  5. Cuidadosamente Añadir (en gotas) la mezcla preparada en el paso 2.3 sobre las células de Plat-E e incubar durante 4 h a 37 ° C.
  6. Después de la incubación, cambio medio en las células de Plat-E para 10 mL de DMEM precalentado que contiene 10% FBS y cultivar las células durante 24 h a 37 ° C. Durante la incubación, las células de Plat-E producirán virus en los medios de comunicación.
  7. Después de 24 h, recoger el medio que contiene partículas retrovirales de platino Eco las células usando una pipeta de 5 mL y transferir a un tubo de centrífuga de 15 mL (= "sobrenadante 1" que contiene las partículas retrovirales ecotropic).
  8. Para evitar la contaminación por células Plat-E en sobrenadante viral, girar el virus recogido en 1250 × g por 5 min a 4 ° C. Para mejores resultados, el virus debe utilizarse inmediatamente para la infección.
    Nota: Alícuotas de virus también pueden almacenarse a-80 ° C para su uso posterior. Sin embargo, dará lugar a cierta reducción en la eficiencia de la transducción de señales. Evitar la congelación/descongelación repetido del virus, puesto que conduce a la degradación del virus.
  9. Añadir 10 mL de DMEM con 10% FBS Plat-e células y cultivar por otro 24 h a 37 ° C.
  10. Repita los pasos del 2.7. y 2.8. para obtener "sobrenadante 2".

3. aislamiento de células de médula ósea murino

  1. Sacrificar el ratón mediante dislocación cervical u otros métodos aprobados. Rocíe el ratón con etanol al 70%.
  2. Utilizando pinzas y tijeras, quite la piel así como parte de los músculos de las patas traseras. Con cuidado sacar el acetábulo de la articulación de la cadera sin romper el fémur. Corte la pata en la articulación del tobillo. Rociar los huesos (fémur conectado a tibia) con etanol al 70% y eliminar el resto de los músculos usando una toalla de papel.
  3. Colocar los huesos en un plato de Petri de 5 cm que contiene tamponada de fosfato estéril salino (PBS) con 2% FBS (PBS-FBS).  Si preparando más huesos, mantener la caja Petri sobre hielo hasta procesado.
  4. Para asegurar la esterilidad del cultivo, realizar los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos.
  5. Separar el fémur la tibia sin romper los extremos del hueso (curva en la rodilla conjunta y cuidadosamente cortada con las tijeras).
  6. Proceso los huesos uno por uno. Corte una parte muy pequeña de las epífisis (aproximadamente 1-2 mm) con unas tijeras mientras mantiene el hueso en pinzas.
  7. Utilizar una aguja de 30 G y un 2 o jeringa de 5 mL con PBS-FBS para eliminar las células de la médula ósea de ambos extremos del hueso en un tubo de centrífuga de 15 mL. Mover la aguja dentro del hueso durante el lavado para eliminar todas las células. Si la aguja se atasca, cambiarlo.
    Nota: Deben girar los huesos de rojo a blanco durante el lavado. Esto indica que la mayoría de las células fueron quitada del hueso. Utilice aproximadamente 2 – 3 mL de PBS-FBS por hueso.
  8. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
  9. Deseche el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por Resuspender el pellet en 2,5 mL de tampón ACK para 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. Durante la lisis, filtrar las células de la médula ósea a través de un tamiz celular de 100 μm en un nuevo tubo 15 mL centrifug. Restaurar la tonicidad añadir 12 mL de PBS-FBS.
    Nota: No exceda 5 min de lisis hipotónica con tampón de ACK para evitar la muerte celular.
  10. Centrifugar inmediatamente a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.

4. médula diferenciación celular en la médula ósea derivados de macrófagos

  1. Resuspender el precipitado de células de médula ósea en DMEM suplementado con 10% FBS y antibióticos (ver la nota después del paso 1.4. para la concentración del antibiótico) y contar las células. Para la diferenciación en BM derivados macrófagos, placa 5-10 x 106 células de médula ósea en una 10 cm no-cultivo de tejidos tratados (bacteriana) placa de Petri con 10 mL de preparados medios DMEM con suero y M-CSF de paso 1.4.
    Nota: El rendimiento de las células de la médula ósea es de aproximadamente 4 x 107 por 6 – 8 semanas-viejo ratón C57BL/6J.
  2. Incubar las células en la incubadora de la célula cultura días 3 a 5% CO2, 37 ° C.
    Nota: Durante los primeros 2 días, las células no se ven muy vitales, como un gran número de células apoptóticas es presente (células capaces de diferenciarse en células mieloides y las células terminalmente diferenciadas).
  3. Después de 3 días, el cultivo de células de la médula ósea empieza a ver vital y se forman grupos de división de las células. Ya se observan las primeras células adherentes. Suplemento en este punto, las células con medios frescos del cytokine.
  4. Añadir 10 mL de precalentado medio DMEM con suero y M-CSF (de paso 1.4) en cada placa de Petri de 10 cm y vuelva a colocarla en la incubadora de la cultura de célula. No hay ninguna necesidad de quitar los viejos medios de comunicación durante este paso.
    Nota: los macrófagos de la médula ósea se diferencian completamente después de 5 – 7 días en la cultura. El mejor momento para la cosecha es en el día 6-8, donde la mayoría de las células son adherentes y la placa de Petri se cubre totalmente.
  5. En el día 5, tomar la caja Petri en la campana de la cultura de célula y incline el plato hasta que los medios de comunicación casi está alcanzando el borde del plato. Cuidadosamente saque 15 mL del medio de la superficie cerca del borde, y las células tienden a permanecer en el centro del plato. Añadir el mismo volumen de medios precalentados con el M-CSF y coloque el plato en la incubadora.
    Nota: Si los medios de comunicación se aspiración lentamente y con cuidado, casi ninguna célula se pierden. Sin embargo, también es posible para los medios aspirados de centrífuga y añadir las células a la cultura, para no asegurarse de que no adherente (es decir., incompletamente diferenciado) las células se pierden.
  6. Para los experimentos, se utilizan solamente las células adherentes (macrófagos). Para cosechar las células, el día 6 o 7, quite todos los medios y las células flotantes. Lavar el plato una vez con PBS precalentada sin suero.
  7. Añadir 5 mL de EDTA 0,02% en PBS e incubar durante 3 – 5 min a 37 ° C en incubadora de cultivo de tejidos.
  8. Con una pipeta de 5 mL, saque el plato por una corriente de PBS-EDTA a las células y colocarlos en un tubo de centrífuga de 50 mL con 25 mL de PBS. Si es necesario, la piscina más platos juntos.
  9. Centrifugar inmediatamente a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
  10. Resuspender el precipitado de macrófagos en medio DMEM y contar las células. Verificar la expresión de marcadores de diferenciación superficial del macrófago (CD11b y F4/80) por citometría de flujo.
  11. Para los experimentos que requieren las células en suspensión, por ej., flujo cytometry experimentos, qPCR o análisis de western blot, los macrófagos se pueden utilizar directamente. Para experimentos con macrófagos adherentes, las células en la placa de cultivo de tejidos según la configuración experimental de la placa.
  12. Distinguen a las células ya completamente. Mantenerlos en los medios de comunicación adecuados para el experimento previsto o en el medio original de crecimiento y la diferenciación con el M-CSF.
    Nota: Para trabajar con los macrófagos adherentes, transferirlos en una nueva placa de al menos 6 h antes de utilizar (idealmente durante la noche) para permitir la adhesión completa a la nueva superficie. La pequeña fracción de células de flotación puede eliminarse antes de experimento.

5. médula diferenciación celular en la médula ósea derivados de células dendríticas

  1. Seguir el protocolo de BMDMs con ajustes específicos para BMDCs se describe a continuación en pasos 5.2-5.4.
  2. Resuspender el precipitado obtenido de células de médula ósea en DMEMsupplemented con 10% FBS y antibióticos y cuente las células (por siguiente paso 4.1 del Protocolo de macrófagos). Para la diferenciación en células dendríticas, placa 1 – 1,5 x 107 células de médula ósea en un 10 cm no-cultivo de tejidos tratados de Petri (bacteriana) en 10 mL de preparados medios DMEM con suero y GM-CSF (de paso 1.4.).
  3. Siga los mismos pasos de cultivo como en protocolo BMDM (pasos de 4.3 – 4.5. Protocolo de macrófagos). Utilizar medios DMEM con suero y GM-CSF en lugar de M-CSF. Puesto que para BMDCs el tiempo de cultivo es más largo (típicamente 10-12 días), agregar 1 – 2 alimentaciones adicionales en intervalos de 3 días (retirar el sobrenadante y agregar un nuevo medio de cultivo como se describe en el paso 4.5).
  4. Esta parte del protocolo es prácticamente igual a la parte correspondiente del protocolo macrófago (pasos 4.6 – 4.12. Protocolo de macrófagos). Experimentos Utilice solamente las células adherentes. Día 10-12, recoger las células utilizando EDTA, contar y placa sobre una superficie nueva. Verificar la expresión de marcadores de diferenciación superficial de las células dendríticas (CD11c +, CD11b + F4/80-) por citometría de flujo.

6. producción de BMDMs y BMDCs expresan la proteína EGFP-marcados con etiqueta de interés

  1. Resuspender el precipitado de células de médula ósea obtenidos en paso 3.10. en DMEM suplementado con 10% FBS y antibióticos y contar las células. Para la infección, use de 2 a 5 x 106 células BM por pozo de una cultura de tejido bien 6 lámina tratada.
  2. Placa las células en 1 mL del medio DMEM preparado por, complementadas con el M-CSF para la diferenciación en BMDMs o con GM-CSF para la diferenciación en BMDCs. mantener las células de 4 – 6 h en una incubadora de cultivo de tejidos con 5% CO2 a 37 ° C.
  3. Añadir 2 mL de virus recién recogidas ("sobrenadante 1) complementado con polibreno (12 μg/mL, concentración final 8 μg/mL después de la adición a las células).
    Nota: Alícuota congelada del sobrenadante que contiene el virus puede también utilizarse, pero la eficacia será menor.
  4. Centrifugar la placa a 1.250 x g durante 90 minutos a 30 ° C (con lenta aceleración y desaceleración). A continuación, incubar durante 4 h con 5% CO2 a 37 ° C.
  5. Opcional: Vuelva a colocar 2 mL de los medios de cultivo con citoquinas respectivas con medio fresco (M-CSF o GM-CSF) y de la cultura con 5% CO2 a 37 ° C. En el segundo día, retirar 2 mL del medio de cultivo y repetir el procedimiento toda infección (paso 6.3-6.4) con 2 mL de virus recién recogidas ("sobrenadante 2").
    Nota: Este paso puede aumentar la eficacia de la infección. Mejora después de la segunda infección es dependiente en el tipo y objetivo de la proteína de la célula y en nuestra experiencia puede variar de 30% de aumento en eficiencia a ninguna mejora en absoluto.
  6. Recoger las células no adherentes, transferir a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos (4 ° C). Deseche el sobrenadante.
  7. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo M-CSF o GM-CSF, colocar las células en un plato de Petri de 10 cm cultura del tejido tratado y la cultura a 37 ° C, 5% CO2. Número óptimo de células para un plato de 10 cm es de 5 – 10 x 106 por macrófagos derivados de BM y 10 – 15 x 106 células dendríticas BM.
    Nota: Pequeños platos o placas se pueden utilizar, pero un número de células debe modificarse en consecuencia.
  8. Siga el macrófago y Protocolo de cultivo y diferenciación de células dendríticas describe en el paso 4 y 5.

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Representative Results

Proteínas señales son proteínas generalmente pequeñas sin ninguna actividad enzimática. Poseen varios dominios de interacción o motivos, que median la Unión a otras proteínas involucradas en transducción de señales, incluyendo tirosina quinasas, fosfatasas, ligasas de ubiquitina y otros21. Para la demostración de la funcionalidad de este protocolo se seleccionaron adaptadores de células mieloides PSTPIP2 y OPAL1. PSTPIP2 es una proteína bien caracterizada en la regulación de la respuesta inflamatoria22. Es una proteína citoplásmica que también puede ser reclutada a las membranas celulares a través de su dominio de F-bar. La segunda proteína es un adaptador transmembrana OPAL1, esperada a estar asociada con las membranas celulares. Su función fisiológica es aún desconocida. Sin embargo, en la leucemia linfoblástica aguda, expresión de OPAL1 se asocia con mejor pronóstico23.

cDNA construye codificación para PSTPIP2 o OPAL1 fusionados mediante un corto enlazador (GSGGGS o etiqueta de Myc, respectivamente) a EGFP en el C-terminal se clonaron en el vector retroviral pMSCV usando métodos estándar de clonación de cDNA. Esta construcción fue entonces transfected en las células de Plat-E junto con el packaging vector pCL-Eco. Los sobrenadantes resultantes que contienen retrovirus fueron utilizados para la transducción de las células de la médula ósea, seguida por la diferenciación en BMDMs y BMDCs. La eficacia de la transfección de Plat-E se evaluó por citometría de flujo después de la colección del segundo sobrenadante que contiene el virus. Eficiencia de transfección promedio fue 62% para PSTPIP2-EGFP y el 53% de OPAL1 y los resultados fueron altamente reproducibles (figura 1A, B). Construcción de OPAL1 parece ser más tóxica para células de Plat-E (determinadas por la aparición de células flotantes/muerte en la cultura), resultando en una reducción en los porcentajes de células transfected.

Estado de diferenciación de la médula ósea derivado de macrófagos y células dendríticas (transduced con construcciones retrovirales PSTPIP2-EGFP y OPAL1-EGFP) fue evaluado mediante citometría de flujo. Población de macrófagos maduros se define por la expresión de CD11b y F4/80, mientras que las células dendríticas expresan el marcador de linaje de CD11c. Más del 90% de células en ambos tipos de cultura eran positivo para sus respectivos marcadores (figura 2A, B). Finalmente, determinamos que el nivel de expresión de EGFP PSTPIP2 y OPAL1-EGFP construye en BMDMs y BMDCs por una medida de la citometría de flujo simple de fluorescencia de EGFP. El porcentaje promedio de macrófagos positivos EGFP fue 71% para PSTPIP2-EGFP y el 62% de OPAL1-EGFP (Figura 3A). En el caso de las células dendríticas, la eficacia fue menor, 32% para PSTPIP2 y 9% para OPAL1 (figura 3B). Los resultados de múltiples experimentos demuestran la reproducibilidad de este método (figura 3).

Por lo general no determinamos la concentración de virus en los sobrenadantes que utilizamos en las infecciones. Preferimos utilizar el virus sobrenadantes fresco, inmediatamente después de la colección, mientras que la determinación del título de virus requiere tres días adicionales. Como resultado, la información sobre título de virus sólo puede obtenerse ex post. Sin embargo, puede todavía ser útil cuando se abordan problemas y cuestiones técnicas. Para evaluar la concentración del virus en sobrenadantes de Plat E las células transfected con PSTPIP2-EGFP y construye OPAL1-EGFP, incubamos las células NIH-3T3 con sobrenadantes que contiene virus diluidos en serie de estas células transfected Plat-E y determinado título de virus exactamente según lo descrito por Zjablovskaja et en el previamente publicado JoVE artículo24. En tres experimentos independientes, el título del virus entre los 1.1 x 106 a 4.4 x 10 6/mL TU. No observamos diferencias sustanciales entre PSTPIP1-EGFP y construcciones OPAL1-EGFP y sobrenadantes de día 1 y día 2. Cuando estos sobrenadantes fueron utilizados para las infecciones de células de médula ósea según el protocolo que estamos describiendo en este artículo, la multiplicidad de infección (MOI) varió desde 1.1 hasta 4.4. Curiosamente, dentro de esta gama, no observamos ninguna correlación entre la eficacia MOI y de la infección.

En la figura 4, PSTPIP2-EGFP y OPAL1-EGFP expresado en BMDMs y BMDCs fueron visualizados por microscopia confocal. Completamente diferenciado de los macrófagos y las células dendríticas tienen una forma característica. El cambio en la morfología de las células progenitoras redondeadas pequeñas a las células grandes de formas irregulares confirma diferenciación exitosa. En macrófagos, PSTPIP2 fue citoplásmica con parcial localización en la membrana plasmática. OPAL1 parece orientarse también parcialmente a la membrana plasmática. El resto fue probablemente asociado a membranas intracelulares, tales como el retículo endoplasmático y aparato de Golgi. Sin embargo, para confirmar esta localización, marcadores de orgánulo específico tendría que ser utilizado. En las células dendríticas, la localización de la membrana era menos evidente.

Figure 1
Figura 1: eficiencia de la transfección de la célula de Plat-E. Para transfección de células de Plat-E, dos construcciones de codificación proteínas PSTPIP2 y OPAL1 fusionadas con EGFP (PSTPIP2-EGFP y OPAL1-EGFP) se clonaron en el vector de pMSCV. Transfección de PEI estándar fue realizada. La eficacia de la transfección se evaluó por citometría de flujo de las células de Plat-E después de la colección del segundo sobrenadante viral. (A). parcela de citometría de flujo representativo. (B). gráfico que muestra resultados de cuatro experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: evaluación del estado de diferenciación de BMDMs (A) y BMDCs (B). Expresión superficial de macrófagos específicos y marcadores de linaje de células dendríticas fue medida por citometría de flujo en el día 8 de cultivo. Las células muertas fueron cerradas hacia fuera basado en sus propiedades de dispersión hacia delante y lateral y la coloración con Hoechst 33258. Los resultados son representativos de al menos 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: evaluación de la expresión de EGFP PSTPIP2 y OPAL1-EGFP. Fluorescencia de la EGFP en BMDMs (A) y BMDCs (B) retrovirally transduced con construcciones EGFP PSTPIP2 y OPAL1-EGFP fue medida por citometría de flujo en el día 8 de cultivo. (C) . Gráfico que muestra los resultados de múltiples experimentos independientes. BMDMs y BMDCs fueron cerradas como en la figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: imágenes representativas de los macrófagos y las células dendríticas expresan PSTPIP2 o OPAL1. BMDMs (A) y BMDCs (B) expresar PSTPIP2 y OPAL1 fueron visualizados por microscopia confocal imagen vivo. Fluorescencia de la EGFP en verde se muestra en el lado izquierdo de cada panel, imagen de campo brillante de la derecha. Barra de escala = 10 μm. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La expresión de la proteína de interés en las células Diana es un paso clave en muchos tipos de estudios biológicos. Diferenciados de los macrófagos y las células dendríticas son difíciles de transfectar, transfección estándar y técnicas de transducción retroviral. Pasando por alto la transfección de las células diferenciadas con transducción retroviral de progenitores de médula ósea, seguido por la diferenciación cuando ya llevan la construcción deseada, es un paso crítico que permite la expresión de los cDNAs ectópico en estos tipos de la célula. Un ejemplo del uso acertado de este método puede encontrarse en nuestra reciente publicación25. Presentamos un protocolo rentable para lograr la expresión estable de la construcción de la opción en la médula ósea las células dendríticas y macrófagos utilizando este enfoque. El procedimiento que presentamos es relativamente barato y simple, pero ofrece muy buenos resultados. Reactivos utilizados en el presente Protocolo permiten su uso rutinario, incluso con un presupuesto relativamente restrictivo. El protocolo de la transfección de Plat-E emplea el PEI como un reactivo de transfección. En comparación con otros agentes de transfección química, el PEI es de un costo muy bajo, mientras que su eficacia es similar a la mayoría de los otros ampliamente utilizado compuestos. Sin embargo, el PEI puede reemplazarse con muchos diversos reactivo de transfección disponibles comercialmente en este paso sin pérdida de eficiencia. Como principio rector, protocolos de la transfección conocidos para trabajar con células HEK293 utilizadas normalmente realizan con células de Plat-E, también. Otra medida económica es la utilización de sobrenadantes del cytokine-que contienen en lugar de citoquinas recombinantes purificadas. El uso de estos sobrenadantes requiere alguna optimización. Sin embargo, cuando el protocolo estándar para su preparación es establecido y seguido, la variabilidad entre lotes individuales de estos sobrenadantes se vuelve muy baja, que generalmente no hay cambios en las concentraciones entre lotes individuales de trabajo. Las eficiencias de la diferenciación BMDM y BMDC con estos sobrenadantes son, en nuestra experiencia, idéntico a citocinas purificadas.

Además de transducción retroviral, existen otros métodos bien establecidos de la transfección de células de mamífero, como electroporación, transfección química (generalmente con lípidos catiónicos o polímeros catiónicos formando complejos con el ADN) y el uso de otros tipos de vectores virales, principalmente sistemas de adenoviral y lentivirales26,27,28,29,30. Aunque eficiencias y títulos muy elevados se pueden alcanzar con genes basados en adenovirus, la preparación de plásmidos correspondientes y partículas virales son más difícil y desperdiciador de tiempo que en el caso de sistemas retroviral29. Además, adenovirus provoca respuesta inflamatoria en las células dendríticas y macrófagos29,31,32 y para un rendimiento óptimo en las células hematopoyéticas murinas ratón cepa lleva transgénicos receptor de adenovirus es necesario33. Por otro lado, la generación de partículas lentivirales portadores del gen de interés es un proceso relativamente sencillo, prácticamente idéntico a la utilizada para el retrovirus. En contraste con los vectores retrovirales ecotropic utilizados en este protocolo, lentivirus son capaces de infectar a las células no proliferantes de múltiples especies, incluyendo seres humanos34. Esto puede ser una ventaja importante en las condiciones experimentales específicas. Sin embargo, esta característica también pone en peligro la seguridad de estos vectores. En nuestra opinión, para la entrega de genes BMDMs y BMDCs, retrovirus proporcionan el mejor equilibrio de eficiencia, seguridad y facilidad de uso. Construcciones de DNA retrovirales pueden prepararse fácilmente utilizando las técnicas de clonación moleculares estándar simple. Virus es producido por las líneas celulares directamente a la cultura del sobrenadante de empaquetado y posterior purificación de virus generalmente no es necesario. Ecotropic retrovirus también no fácilmente infectar células humanas, que hace su uso relativamente seguro. Sin embargo, también hay algunas desventajas generales asociados con el uso de vectores retrovirales. El factor limitante más importante es que estos virus infectan sólo proliferan las células35. Esta característica no afecta significativamente el protocolo descrito aquí, pero limita el rango de aplicaciones donde pueden utilizarse vectores retrovirales. El tamaño del gen de interés que pueden ser reproducido en estos vectores también es limitado y la concentración de la partícula viral disminuye con el aumento de tamaño del inserto. Con pMSCV vectores, generalmente Empezamos viendo efectos de insertar tamaño en alrededor de 3 kbp. Con nuevos aumentos en el tamaño del inserto, la eficiencia de infección declina gradualmente.

La transfección química y electroporación son fáciles de usar, más seguro y menos tiempo que cualquiera de los procedimientos basados en virus26,27,28,30. Sin embargo, en BMDMs y BMDCs, pueden estimular las respuestas a los ácidos nucleicos extraños31 y generan estrés más celular. Además, algunos reactivos de transfección química aumentan auto-fluorescencia de células que puede interferir con la citometría de flujo o microscopia analiza. Debido a la naturaleza transitoria de expresión, puede utilizarse con maduros BMDMs distinguidos o BMDCs. En cambio, las secuencias con vectores retrovirales permanentemente se integración en el genoma de las células diana y permitan una expresión estable de larga duración compatibles con la escala de tiempo de los protocolos de diferenciación34, 35. sin embargo, esta característica también aumenta el riesgo de mutagénesis del insertional. Debido a la naturaleza relativamente al azar de la integración del vector, se limitan sus efectos en grandes poblaciones de células. Sin embargo, pueden ser visibles a nivel de células individuales. Problemas adicionales surgen cuando un concepto expresado desde el vector retroviral afecta a las células dendríticas o diferenciación de macrófagos, dando por resultado falta generar diferencia BMDMs o BMDCs de los progenitores infectados. En cierta medida, esto se puede superar mediante el ajuste de las condiciones de la infección para lograr niveles de expresión baja (por ej., reduciendo la concentración de virus) o mediante el uso de un sistema de expresión inducible. El uso de EGFP fusionada a la proteína de interés o como un reportero de también permite la clasificación de células con expresión a nivel correspondiente a las limitaciones y objetivos del experimento. Por último, también hay que mencionar problemas comunes a todos los procedimientos de transducción de la transfección. Estos incluyen principalmente artefactos de sobreexpresión, tales como proteína mal plegamiento, mislocalization y toxicidad36. Toxicidad de la proteína podría ser la razón por qué OPAL1 fue relativamente difícil de expresar. Su ejemplo ilustra claramente que la naturaleza de la proteína expresada puede afectar sustancialmente la efectividad de este método. Sin embargo, a pesar de esto, hemos podido obtener suficientes cantidades de OPAL1-EGFP expresar las células para el análisis de microscopía con este método, demostrando su utilidad incluso cuando se trata de objetivos difíciles. Además, sería posible aumentar los porcentajes de células transduced por FACS clasificación si es requerido por una aplicación en particular. La eficiencia de infección baja puede superarse parcialmente al aumentar la concentración de partículas virales utilizando diversos métodos o kits listos para usar. En nuestras manos, ultrafiltración del sobrenadante viral en Filtros centrífugos con un peso molecular que se cortan de 100 kDa ha demostrado para proporcionar el mejor equilibrio entre eficacia y requiere esfuerzo.

La médula ósea derivados de macrófagos y células dendríticas son herramientas ampliamente utilizadas en Inmunología del fagocito. Son fisiológicamente más importantes que las líneas celulares disponibles. Pueden generarse en un número relativamente elevado y, al mismo tiempo, carecen de la característica de heterogeneidad e inestabilidad genética de líneas celulares. Otra ventaja es que pueden ser generados de ratones modificados genéticamente para estudiar los efectos de la modificación genética en una población relativamente abundante y homogénea de la célula. Esto es particularmente útil en estudios de bioquímica, donde son típicamente requiere cantidades relativamente grandes de las células. La capacidad de transducir estas células con cDNA construcciones abre posibilidades adicionales de investigación basada en la reconstitución o complementación de defectos genéticos en las células y análisis de la estructura y función.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por Checa ciencia Fundación (GACR) (proyecto número 16-07425S), por Charles University Grant agencia (poesías) (número de proyecto 923116) y por fondos institucionales desde el Instituto de Genética Molecular de la Academia de Ciencias de la República Checa República (RVO 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

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