Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Udtryk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine knoglemarv-afledte dendritiske celler og makrofager

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

I denne artikel vil give vi en detaljeret protokol for udtryk for fluorescerende fusion proteiner i murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager. Metoden er baseret på transduktion af knoglemarv stamceller med retroviral konstruktioner efterfulgt af differentiering af makrofager og dendritiske celler i vitro.

Abstract

Dendritiske celler og makrofager er afgørende celler, der danner den første linje i forsvar mod patogener. De også spille en vigtig rolle i iværksættelsen af en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbejde med disse celler er temmelig udfordrende. Deres overflod i organer og væv er relativt lavt. Som et resultat, kan ikke de være isoleret i stort tal. De er også svært at transfect med cDNA konstruktioner. I murine modellen, kan disse problemer løses delvist af in vitro- differentiering fra knoglemarven stamfaderen M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendritiske celler. På denne måde er det muligt at opnå store mængder af disse celler fra meget få dyr. Derudover kan knoglemarv stamceller være transduced med retroviral vektorer transporterer cDNA konstruktioner i tidlige stadier af dyrkning før deres differentiering i knoglemarven afledt dendritiske celler og makrofager. Retroviral transduktion efterfulgt af differentiering i vitro kan således bruges til at udtrykke forskellige cDNA konstruktioner i disse celler. Evnen til at udtrykke ektopisk proteiner betydeligt udvider rækken af eksperimenter, der kan udføres på disse celler, herunder levende celle billeddannelse af fluorescerende proteiner, tandem purifications interactome analyser, struktur-funktion analyser, overvågning af cellulære funktioner med biosensorer og mange andre. I denne artikel vil beskrive vi en detaljeret protokol til retroviral transduktion af murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager med vektorer, der koder for fluorescently markeret proteiner. På eksemplet med to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, vise vi sin praktiske anvendelse i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger ved denne fremgangsmåde.

Introduction

Myeloide celler udgør en uundværlig del af vores forsvarsmekanismer mod patogener. De er i stand til hurtigt fjerne mikrober, samt døende celler. Derudover er de også involveret i regulering af udvikling af væv og reparation og opretholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler differentiere fra fælles myeloide stamceller i knoglemarven. Deres differentiering i mange funktionelt og morfologisk særskilt undersæt er i vid udstrækning kontrolleret af cytokiner og deres forskellige kombinationer af4. De mest intensivt undersøgt myeloide celle subsets omfatter neutrophilic granulocytter, makrofager og dendritiske celler. Fejl i nogen af disse befolkningsgrupper føre til potentielt livstruende konsekvenser og forårsage alvorlige dysfunktioner af immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.

I modsætning til neutrophilic granulocytter, dendritiske celler og makrofager er bosiddende celler, væv og deres overflod i immun organer er relativt lavt. Som et resultat, er isolering og oprensning af primære dendritiske celler og makrofager for eksperimenter der kræver et stort antal af disse celler dyre og ofte umuligt. For at løse dette problem, er protokoller blevet udviklet for at opnå store mængder af homogen makrofager og dendritiske celler in vitro. Disse tilgange er baseret på differentiering af murine knoglemarv celler i overværelse af cytokiner: makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) til makrofager og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendritiske celler7,8,9,10,11,12. Celler genereret af denne metode er almindeligt beskrevet i litteraturen som knoglemarven afledt makrofager (BMDMs) og knoglemarv afledt dendritiske celler (BMDCs). De har flere fysiologiske egenskaber primære makrofager og dendritiske celler end med tilsvarende cellelinjer. En anden stor fordel er muligheden for at opnå disse celler form genetisk modificerede mus13. Sammenlignende studier mellem wild-type celler og celler, der stammer fra genmodificerede mus er ofte afgørende for afsløring roman funktioner af gener eller proteiner af interesse.

Analyse af subcellulært lokalisering af proteiner i levende celler kræver kobling af en fluorescerende etiket til protein af interesse i vivo. Dette sker oftest ved at udtrykke genetisk kodet fusion konstruktion består af en analyseret protein koblet (ofte via en kort linker) til en fluorescerende proteiner (fx., grøn fluorescerende proteiner (NGL))14,15 , 16. udtrykket af fluorescently mærket proteiner i dendritiske celler eller makrofager er udfordrende. Disse celler er generelt vanskeligt at transfect af standard Transfektion procedurer og effektivitetsgevinsterne tendens til at være meget lav. Desuden, Transfektion er forbigående, det genererer cellulært stress og opnåede intensiteten af fluorescens kan ikke være tilstrækkeligt for mikroskopi17. For at opnå en rimelig brøkdel af disse celler med en tilstrækkelig grad af transgenet udtryk, infektion af knoglemarv stamceller med retroviral er vektorer og deres efterfølgende differentiering af BMDMs eller BMDCs blevet en meget effektiv tilgang. Det er tilladt for analyse af proteiner af myeloide oprindelse i deres native cellulære miljø, både i en stabil tilstand eller i processer, der er kritiske for immunrespons fagocytose, immunologiske synapse dannelse eller migration. Her, beskriver vi en protokol, der giver mulighed for stabile udtryk af fluorescently mærket proteiner af interesse i murine knoglemarv afledt makrofager og dendritiske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Expert Committee på velfærd af forsøgsdyr af Institut for Molekylær Genetik og Academy of Sciences i Tjekkiet.

1. reagens

  1. Forberede ammonium-chlorid-kalium (ACK) buffer. Tilføje 4.145 g af NH4Cl og 0,5 g KHCO3 til 500 mL af Hedeselskabet2O, derefter tilsættes 100 µL af 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) og filter-sterilisere.
  2. Forberede polyethylenimine (PEI) løsning. Tilsættes 0,1 g PEI til 90 mL af Hedeselskabet2O. Tilføj 1 M HCl dråbevis under omrøring, indtil pH-værdien er lavere end 2,0. Der omrystes i op til 3 h indtil PEI er opløst og derefter justere pH til 7,2 med 1 M NaOH. Regulér lydstyrken til 100 mL med ddH2O og filter-sterilisere. Gøre 1-2 mL alikvoter og opbevares ved-20 ° C.
    Bemærk: Efter optøning, PEI kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger, men bør ikke fryses igen.
  3. Forberede celle kultur analysere indeholdende M-CSF eller GM-CSF. Disse supernatanter kan foretages på forhånd og gemt i-80 ° C. For at gøre disse supernatanter, vokse de cytokin-producerende celler (J558 celler for GM-CSF 18 ) eller CMG 14-12 celler for M-CSF 19i en 10 cm petriskål i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) til sammenløbet. Derefter overføre alle celler til 200 mL af medier i T150 vævskultur kolbe og kultur for yderligere 4 dage på 5% CO237 ° C. Indsamle supernatanten og filter over 0,2 µm sterilisation filter. Gøre delprøver og gemme disse ved-80 ° C.
  4. Forberede 100 mL i cellekulturmedium: DMEM suppleret med 10% varme inaktiverede FBS og celle kultur analysere fra celler udskiller GM-CSF (for BMDC differentiering) eller M-CSF (for BMDM differentiering).
    Bemærk: Mængden af cytokiner i disse supernatanter kan variere og arbejder koncentration har fastsættes empirisk. Typisk er 2-3% supernatanten fra cellelinjer producerer GM-CSF (den anbefalede start koncentrationen er 2%) eller 5 – 10% supernatanten fra CMG 14 – 12 celler producerer M-CSF (den anbefalede start koncentration er 10%) brugt. Alternativt, renset kommercielt tilgængelige M-CSF ved 10 ng/mL og GM-CSF på 20 ng/mL kan bruges med resultaterne næsten identisk med cytokin-holdige supernatanter, dvs., uden nogen effekt på hastigheden af differentiering, infektion effektivitet og subcellulært lokalisering af EGFP-mærkede konstruktioner. Antibiotika, herunder penicillin G (100 IE/mL), streptomycin (100 µg/mL) og gentamicin (40 µg/mL), kan anvendes til cellekultur på ethvert trin i protokollen, medmindre andet er angivet.

2. produktion af Retrovirus

Forsigtig: Selvom retroviral vektorerne er relativt sikker i forhold til andre typer af virale vektorer, de stadig udgør en potentiel sikkerhedsrisiko. Derfor er det afgørende at arbejde med den største omhu og egnede værnemidler og overholder alle regler for sikkerhed og lovkrav for at arbejde med virale partikler.

  1. Plade en enkelt cellesuspension af Platinum-øko (Plat-E) emballage celler i en 10 cm petriskål og dyrke i 15 mL af DMEM indeholdende 10% FBS indtil 50-60% sammenflydende (24 h). Celler skal vokse i en éncellelag og bør ikke danne klumper i kultur.
  2. Pipette 20 µg af retroviral konstruktion (fx., konstruere udtrykker interesse i pMSCV vektor fluorescently mærkede protein) og 10 µg pCL-Eco emballage vektor20 i 1 mL af DMEM (uden serum og antibiotika) og bland forsigtigt.
  3. Et andet rør, tilføje 75 µL af PEI i 1 mL af DMEM (uden serum og antibiotika). Inkuber 5 min. ved stuetemperatur (RT) og derefter blande indholdet af begge rør sammen og der inkuberes i yderligere 10 min. ved RT.
    Bemærk: Tilsætning af pCL-Eco er valgfri. Det er der koder for ecotropic viral receptor og kan øge virus titer.
  4. Omhyggeligt erstatte medium på Plat-E celler med 8 mL frisk DMEMsupplemented med 2% FBS. Pre varm medium til 37 ° C før brug. Må ikke bruge antibiotika under Transfektion, da antibiotika kan reducere Transfektion effektivitet.
  5. Forsigtigt tilføje (i dråber) blanding forberedt i trin 2.3 på Plat-E celler, og Inkuber i 4 timer ved 37 ° C.
  6. Efter inkubation, udveksle medium på Plat-E celler til 10 mL af pre varmede DMEM indeholdende 10% FBS, og dyrke celler i 24 timer ved 37 ° C. Under denne inkubering bliver Plat-E celler producerer virus i medierne.
  7. Efter 24 h, indsamle det medium, der indeholder retroviral partikler fra Platinum Eco celler ved hjælp af 5 mL pipette og overføre det til en 15 mL centrifugeglas (= "supernatanten 1" indeholdende ecotropic retroviral partikler).
  8. For at undgå kontaminering af Plat-E celler i viral analysere, spin indsamles viruset ved 1250 × g i 5 min. ved 4 ° C. For de bedste resultater, bør virussen anvendes straks for infektion.
    Bemærk: Delprøver af virus kan også opbevares ved-80 ° C til senere brug. Dog vil det resultere i visse reduktion i transduktion effektivitet. Undgå gentagen nedfrysning/optøning af virus, da det fører til forringelse af virus.
  9. Der tilsættes 10 mL af pre varmede DMEM med 10% FBS Plat-e celler og dyrke for en anden 24 timer ved 37 ° C.
  10. Gentag trin 2.7. og 2.8. at opnå "supernatanten 2".

3. murine knoglemarv celle Isolation

  1. Ofre musen ved hjælp af cervikal dislokation eller anden godkendt metode. Spray mus med 70% ethanol.
  2. Ved hjælp af saks og pincet, fjerne hud samt en del af muskler fra bagbenene. Forsigtigt løsne acetabulum fra hofteled uden at bryde lårbenet. Skære pote i ankelleddet. Spray knogler (lårbenet tilsluttet tibia) med 70% ethanol og fjerne resten af musklerne ved hjælp af en køkkenrulle.
  3. Placer knogler i en 5 cm petriskål indeholdende sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 2% FBS (PBS-FBS).  Hvis forbereder flere knogler, holde petriskål på is indtil behandles.
  4. For at sikre dyrkning sterilitet, skal du udføre følgende trin i vævskultur hætte.
  5. Adskille lårbenet fra tibia uden at bryde knogleenderne (bøje i knæet fælles og omhyggeligt skæres med en saks).
  6. Behandle knogler én efter én. Afskære en meget lille del af epifyserne (ca 1-2 mm) med en saks mens du holder knoglen i pincet.
  7. Brug 30 G nål og en 2 eller 5 mL sprøjte fyldt med PBS-FBS at skylle knoglemarv celler fra begge ender af knoglen i en 15 mL-centrifugerør. Flytte nålen inde i knoglen under rødmen for at fjerne alle celler. Hvis nålen bliver tilstoppet, ændre den.
    Bemærk: Knogler bør slå fra rød til hvid under rødmen. Dette indikerer, at hovedparten af cellerne blev fjernet fra knoglen. Brug cirka 2-3 mL af PBS-FBS pr. ben.
  8. Centrifugeres celler ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  9. Supernatanten og lyse røde blodlegemer af resuspending pellet i 2,5 mL af ACK buffer for 2-3 min. ved stuetemperatur. Under lysis, filtrere knoglemarv celler gennem en 100 μm celle si ind i en frisk 15 mL centrifug rør. Gendanne tonicity ved tilsætning af 12 mL af PBS-FBS.
    Bemærk: Må ikke overstige 5 min af hypotonic lysis med ACK buffer til at undgå celledød.
  10. Umiddelbart der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. ved 4 ° C.

4. knoglemarven Celledifferentiering i knoglemarven afledt makrofager

  1. Resuspenderes knoglemarv celler i DMEM suppleret med 10% FBS og antibiotika (Se bemærkningen efter trin 1.4. for antibiotikum koncentration) og tælle cellerne. For differentiering af BM afledt makrofager, plade, 5 – 10 x 106 af knoglemarv celler i en 10 cm ikke-vævskultur behandlet (bakteriel) petriskål med 10 mL af tilberedte DMEM medier med serum og M-CSF fra trin 1.4.
    Bemærk: Udbyttet af knoglemarv celler er ca 4 x 107 pr. 6-8 ugers-gamle C57BL/6J mus.
  2. Inkuber celler i celle kultur inkubator i 3 dage på 5% CO2, 37 ° C.
    Bemærk: I de første 2 dage, cellerne ser ikke meget afgørende, da et stort antal apoptotiske celler er til stede (celler stand til at differentiere i myeloide celler og terminalt differentieret celler).
  3. Efter 3 dage, cellekultur knoglemarven begynder at kigge vitale og klynger af dividere celler er dannet. Første vedhængende celler kan allerede observeres. På dette tidspunkt, supplere celler med friske cytokin medier.
  4. Der tilsættes 10 mL af pre varmede DMEM medier med serum og M-CSF (fra trin 1.4) i hver 10 cm petriskål og returnere den i celle kultur inkubator. Der er ingen grund til at fjerne de gamle medier under dette trin.
    Bemærk: knoglemarven makrofager er fuldt differentierede efter 5-7 dage i kultur. Det bedste tidspunkt for høst er på dag 6 – 8, hvor hovedparten af cellerne er tilhænger og petriskålen er helt dækket.
  5. På dag 5, tager petriskålen celle kultur hood og hældning fadet indtil medierne næsten nåede kanten af skålen. Tage omhyggeligt 15 mL af medier fra overfladen tæt på kanten, og cellerne har tendens til at bo i midten af fadet. Tilføje den samme mængde af præ varmede medier med M-CSF og Placer fadet tilbage i inkubatoren.
    Bemærk: Hvis medierne er indsugning langsomt og forsigtigt, næsten ingen celler går tabt. Men det er også muligt at centrifugeres indsugning medierne og tilføje cellerne tilbage til kulturen, at sikre, at ingen ikke-tilhænger (dvs., ufuldstændigt differentieret) celler går tabt.
  6. Eksperimenter anvendes kun vedhængende celler (makrofager). For at høste celler, på dag 6 eller 7, Fjern alle medier og flydende celler. Vask skål engang med pre varmede PBS uden serum.
  7. Der tilsættes 5 mL 0.02% EDTA i PBS og inkuberes i 3-5 min. ved 37 ° C i vævskultur inkubator.
  8. Bruger 5 mL pipette, fjerne celler fra parabol af en strøm af PBS-EDTA og placere dem i et 50 mL centrifugeglas med 25 mL PBS. Hvis det er nødvendigt, samle flere retter.
  9. Umiddelbart der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. ved 4 ° C.
  10. Resuspenderes makrofag i DMEM medier og tælle cellerne. Kontrollere udtryk for makrofag overflade differentiering markører (CD11b og F4/80) ved flowcytometri.
  11. For eksperimenter der kræver celler i suspension, f.eks., flow flowcytometri eksperimenter, qPCR eller western blot analyse, bruge makrofager direkte. Eksperimenter med vedhængende makrofager, plade celler i vævskultur pladen ifølge opsætningen af eksperimenterende.
  12. Cellerne er allerede fuldt differentierede. Holde dem i medierne egnet til den påtænkte eksperiment eller i den oprindelige vækst og differentiering medier med M-CSF.
    Bemærk: For arbejde med vedhængende makrofager, overføre dem til en ny plade mindst 6 timer før brug (helst natten over) at tillade fuld vedhæftning til den ny overflade. Den lille brøkdel af flydende celler kan fjernes før eksperimentet.

5. knoglemarven Celledifferentiering i knoglemarven afledt dendritiske celler

  1. Følge protokollen for BMDMs med justeringer, der er specifikke for BMDCs beskrevet nedenfor i trin 5,2-5,4.
  2. Resuspenderes fremstillet af knoglemarv celler i DMEMsupplemented med 10% FBS og antibiotika og tælle cellerne (af følgende trin 4.1 af makrofag protokol). For differentiering af dendritiske celler behandlet plade 1 – 1,5 x 107 knoglemarv celler i en 10 cm ikke-vævskultur (bakteriel) petriskål i 10 mL af tilberedte DMEM medier med serum og GM-CSF (fra trin 1.4.).
  3. Følg de samme trin som dyrkning i BMDM protokol (trin 4.3 – 4.5. af makrofag protokol). Bruge DMEM medier med serum og GM-CSF i stedet for M-CSF. Da BMDCs dyrkning tid er længere (typisk 10-12 dage), tilføje 1-2 ekstra fodringer i 3 dages mellemrum (ved at fjerne supernatanten og tilføje en ny dyrkning medier som beskrevet i trin 4.5.).
  4. Denne del af protokollen er næsten den samme som den tilsvarende del af makrofag-protokollen (trin 4.6 – 4.12. af makrofag protokol). Brug kun vedhængende celler til eksperimenter. Dag 10-12, indsamle de celler ved hjælp af EDTA, tælle og plade dem på en ny overflade. Kontrollere udtryk af overflade differentiering markører for dendritiske celler (CD11c +, CD11b +, F4/80-) ved flowcytometri.

6. fremstilling af BMDMs og BMDCs udtryk for EGFP-mærkede Protein af interesse

  1. Resuspenderes knoglemarv celler fremstillet i trin 3.10. i DMEM suppleret med 10% FBS og antibiotika og tælle cellerne. For infektionen, bruge 2-5 x 106 BM celler pr. brønd af et 6-godt vævskultur behandlet plade.
  2. Plade celler i 1 mL af den forberedte DMEM media pr. godt, suppleret med M-CSF for differentiering af BMDMs eller med GM-CSF for differentiering i BMDCs. holde cellerne for 4-6 h i en vævskultur kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C.
  3. Tilsættes 2 mL frisk indsamlede virus ("supernatanten 1") suppleret med polybrene (12 µg/mL, slutkoncentration 8 µg/mL efter tilsætning til cellerne).
    Bemærk: Frosne alikvot af virus-holdige supernatanten kan også bruges, men effekten vil være lavere.
  4. Der centrifugeres plade ved 1250 x g i 90 min ved 30 ° C (med langsom acceleration og deceleration). Derefter inkuberes i 4 h med 5% CO2 ved 37 ° C.
  5. Valgfrit: Erstatte 2 mL af kultur medier med friske medium indeholdende respektive cytokin (M-CSF eller GM-CSF) og kultur med 5% CO2 ved 37 ° C. På andendagen, fjerne 2 mL af dyrkningsmedier og Gentag hele infektion procedure (trin 6.3-6.4) med 2 mL frisk indsamlede virus ("supernatanten 2").
    Bemærk: Dette trin kan øge infektion effektivitet. Forbedring efter den anden infektion er afhængig af celle type og target proteinet og i vores erfaring kan variere fra 30% stigning i effektiviteten til nogen forbedring overhovedet.
  6. Indsamle ikke-tilhænger celler, overføre til en 15 mL centrifugeglas, og spin på 500 x g i 5 min (4 ° C). Supernatanten.
  7. Celle resuspenderes i 10 mL af kultur medier med M-CSF eller GM-CSF, placere cellerne i et 10 cm væv kultur behandlede petriskål og kultur ved 37 ° C, 5% CO2. Optimale antal celler for en 10 cm parabol er 5-10 x 106 for BM-afledte makrofager og 10-15 x 106 for BM-afledte dendritiske celle.
    Bemærk: Mindre retter eller plader kan blive brugt, men celle tal skal justeres i overensstemmelse hermed.
  8. Følg makrofager og dendritiske celle dyrkning og differentiering protokollen beskrevet i trin 4 og 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Signaling adapter proteiner er normalt små proteiner uden nogen enzymatisk aktivitet. De besidder forskellige interaktion domæner eller motiver, der mægle binding til andre proteiner involveret i signaltransduktion, herunder tyrosin kinaser, fosfataser og ubiquitin ligases21. Til demonstration af funktionaliteten af denne protokol blev myeloide celler adaptere PSTPIP2 og OPAL1 udvalgt. PSTPIP2 er et godt karakteriseret protein involveret i reguleringen af inflammatorisk respons22. Det er et cytoplasmatisk protein, der kan også ansættes til cellemembranerne via sit F-bar domæne. Andet protein er en transmembrane adapter OPAL1, forventes at være forbundet med cellemembraner. Dens fysiologiske funktion er stadig ukendt. Dog, i akut lymfoblastær leukæmi, udtryk for OPAL1 er forbundet med bedre prognose23.

cDNA konstruerer kodning for PSTPIP2 eller OPAL1 sammenvokset via en kort linker (GSGGGS eller Myc-tag, henholdsvis) til EGFP på C-terminus blev klonet i pMSCV retroviral vektor ved hjælp af standardmetoderne for kloning af cDNA. Denne konstruktion var derefter transfekteret til Plat-E celler sammen med emballage vektor pCL-øko. De resulterende analysere indeholdende retrovira blev brugt til transduktion af knoglemarv celler, efterfulgt af differentiering i BMDMs og BMDCs. Effekten af Plat-E Transfektion blev evalueret ved flowcytometri efter indsamling af anden virus-holdige supernatanten. Gennemsnitlig Transfektion effektivitet var 62% for PSTPIP2-EGFP og 53% for OPAL1 og resultaterne var meget reproducerbare (figur 1A, B). OPAL1 konstruktion syntes at være mere giftige for Plat-E celler (vurderet af udseendet af flydende/døende celler i kultur), hvilket resulterer i en reduktion i procentdelen af transfekteret celler.

Differentiering status af knoglemarven afledt makrofager og dendritiske celler (transduced med PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP retroviral konstruktioner) blev vurderet ved flowcytometri. Modne makrofag befolkning er defineret af CD11b og F4/80 udtryk, mens dendritiske celler express CD11c afstamning markør. Mere end 90% af celler i begge typer af kultur var positive for deres respektive markører (figur 2A, B). Endelig, vi har besluttet udtryk niveauet af PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP konstruerer i BMDMs og BMDCs af en simpel flowcytometri flowmåling af EGFP fluorescens. Den gennemsnitlige procentdel af EGFP-positive makrofager var 71% for PSTPIP2-EGFP og 62% for OPAL1-EGFP (figur 3A). I tilfælde af dendritiske celler, effektivitet var lavere, 32% for PSTPIP2 og 9% for OPAL1 (figur 3B). Resultaterne af flere eksperimenter viser reproducerbarhed af denne metode (figur 3 c).

Vi bestemmer typisk ikke virus fusionen i de supernatanter, som vi bruger i infektioner. Vi foretrækker at bruge den virus analysere friske, umiddelbart efter opsamlingen, mens virus titer bestemmelse kræver tre ekstra dage. Som et resultat, der kun kan indhentes oplysninger om virus titer ex post. Dog kan det stadig være nyttigt, når du adresserer tekniske spørgsmål og problemer. For at vurdere virus fusionen i supernatanter fra Plat E celler transfekteret med PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP konstruktioner, vi rugede NIH-3T3 celler med seriefremstillede fortyndet virus-holdige analysere indsamlet fra disse transfected Plat-E celler og bestemt virus titer nøjagtigt som beskrevet af Zjablovskaja al. i tidligere udgivne JoVE artikel24. I tre uafhængige eksperimenter, virus titer varierede fra 1,1 x 106 til 4,4 x 106 TU/mL. Vi ikke observere nogen væsentlige forskelle mellem PSTPIP1-EGFP og OPAL1-EGFP konstruktioner og analysere fra dag 1 og dag 2. Når disse supernatanter blev brugt til knoglemarven celle infektioner efter protokol beskriver vi i denne artikel, mangfoldigheden af infektion (MOI) varierede fra 1,1 til 4.4. Interessant, inden for dette interval, vi ikke observere nogen sammenhæng mellem MOI og infektion effektivitet.

I figur 4, blev PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP udtrykt i BMDMs og BMDCs visualiseret ved Konfokal mikroskopi. Fuldt differentierede makrofager og dendritiske celler har en karakteristisk form. Ændringen i morfologi fra små afrundede stamceller til de store celler af irregulære figurer bekræfter vellykket differentiering. I makrofager var PSTPIP2 cytoplasmatisk med delvis lokalisering på plasmamembran. OPAL1 syntes at målrettes også delvist plasmamembran. Resten var sandsynligvis forbundet med intracellulære membraner, såsom endoplasmatiske reticulum og Golgi kompleks. Men for at bekræfte denne lokalisering, specifikke organelle markører ville have til at blive brugt. I dendritiske celler blev membran lokalisering mindre synlige.

Figure 1
Figur 1: effektivitet af Plat-E celle Transfektion. For Transfektion af Plat-E celler, blev to konstruktioner kodning adapter proteiner PSTPIP2 og OPAL1 sammenvokset med EGFP (PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP) klonet i pMSCV vektor. Standard PEI Transfektion blev udført. Effekten af Transfektion blev evalueret ved flowcytometri celleområde Plat-E efter indsamling af anden viral supernatanten. (A). repræsentative flow flowcytometri plot. (B). graf viser resultaterne af fire uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vurdering af status som differentiering af BMDMs (A) og BMDCs (B). Overflade udtryk for specifikke makrofager og dendritiske celle lineage markører blev målt ved flowcytometri på dag 8 i dyrkning. Døde celler var gated ud baseret på deres side og forward scatter egenskaber og farvning med Hoechst 33258. Resultaterne er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: vurdering af udtryk af PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP. EGFP fluorescens i BMDMs (A) og BMDCs (B) Retroviralt transduced med PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP konstruktioner blev målt ved flowcytometri på dag 8 i dyrkning. (C) . Graf, der viser resultaterne af flere uafhængige forsøg. BMDMs og BMDCs var gated som i figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative billeder af makrofager og dendritiske celler, der udtrykker PSTPIP2 eller OPAL1. BMDMs (A) og BMDCs (B) udtrykker PSTPIP2 og OPAL1 blev visualiseret ved live imaging Konfokal mikroskopi. EGFP fluorescens i grønt er vist på venstre side af hvert panel, lysfelt billedet til højre. Skalalinjen = 10 µm. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udtryk for protein af interesse i target-cellerne er et vigtigt skridt i mange typer af biologiske undersøgelser. Differentierede makrofager og dendritiske celler er vanskeligt at transfect af standard Transfektion og retroviral transduktion teknikker. Omgåelse Transfektion af disse differentierede celler med retroviral transduktion af knoglemarven progenitorceller, efterfulgt af differentiering, når de allerede bærer det ønskede konstruktion, er et kritisk skridt giver udtryk for ekstrauterin cDNAs i disse celletyper. Et eksempel på vellykket anvendelse af denne metode kan findes i vores seneste publikation25. Her, leverer vi en omkostningseffektiv protokol for at opnå stabil udtryk for konstruktionen af valg i knoglemarv-afledte dendritiske celler og makrofager ved hjælp af denne fremgangsmåde. Den procedure, vi præsenterer er forholdsvis billig og simpel, men meget gode resultater. Reagenser, der anvendes i denne protokol giver mulighed for sin rutinemæssige brug selv under et relativt restriktivt budget. Protokol for Plat-E Transfektion beskæftiger PEI som en Transfektion reagens. I forhold til andre kemiske Transfektion agenter, PEI er af en meget lav pris, mens dets effektivitet er lig fleste andre udbredte forbindelser. PEI kan dog erstattes med mange forskellige kommercielt tilgængelige Transfektion reagenser i dette trin uden tab af effektivitet. Som et ledende princip udføre Transfektion protokoller kendt for at arbejde med almindeligt anvendte HEK293 celler typisk godt med Plat-E celler, også. En anden omkostningseffektiv foranstaltning er udnyttelsen af cytokin-holdige supernatanter i stedet for renset rekombinant cytokiner. Brugen af disse supernatanter kræver nogle optimering. Men når standardprotokol for deres forberedelse er etableret og fulgt, variabiliteten mellem enkelte partier af disse supernatanter bliver meget lav, der normalt kræver ingen ændringer i arbejder koncentrationer mellem individuelle masser. Effektiviteten af BMDM og BMDC differentiering med disse supernatanter er vores erfaring, identisk med renset cytokiner.

Ud over retroviral transduktion findes andre veletablerede metoder af pattedyr celle Transfektion, herunder kemiske Transfektion (typisk ved hjælp af kationiske lipider eller kationiske polymerer danner komplekser med DNA), elektroporation og brugen af andre typer af virale vektorer, hovedsagelig adenoviral og lentiviral systemer26,27,28,29,30. Selv om meget høj titers og effektivitetsfordele kan opnås med adenovirus-baserede gen levering, udarbejdelse af tilsvarende plasmider og virale partikler er mere vanskeligt og tidskrævende end i tilfælde af retroviral systemer29. Derudover fremkalder adenovirus inflammatorisk reaktion i dendritiske celler og makrofager29,31,32 og sikre en optimal ydeevne i murine hæmatopoietisk celler mus stamme bærer transgene adenovirus receptor er påkrævet33. På den anden side er generation af lentiviral partikler bærer gen af interesse en forholdsvis simpel proces, stort set identisk med det udnyttede retrovira. I modsætning til ecotropic retroviral vektorer bruges i denne protokol, er lentiviruses i stand til at inficere ikke prolifererende celler af flere arter, herunder mennesker34. Dette kan være en vigtig fordel særlige eksperimentelle betingelser. Dog, denne funktion også i høj grad bringer sikkerheden af disse vektorer. I vores udtalelse, genet leveres til BMDMs og BMDCs, leverer retrovira den bedste balance mellem effektivitet, sikkerhed og brugervenlighed. Retroviral DNA konstruktioner kan tilberedes nemt ved hjælp af enkle standard molekylærbiologiske kloning teknikker. Virus er produceret af emballage cellelinjer direkte til kultur supernatanten og yderligere virus rensning er normalt ikke nødvendige. Ecotropic retrovira også ikke let at inficere humane celler, hvilket gør deres brug relativt sikkert. Men der er også nogle generelle ulemper forbundet med brugen af retroviral vektorer. Den vigtigste begrænsende faktor er, at disse virus inficerer kun prolifererende celler35. Denne funktion påvirker ikke væsentligt protokollen beskrevet her, men det begrænser vifte af applikationer hvor retroviral vektorer kan bruges. Gen af interesse, der kan klones til disse vektorer størrelse er også begrænset og viral partikel titer aftager med stigende skærstørrelse. Med pMSCV vektorer begynder vi normalt at se virkningerne af skærstørrelse på omkring 3 kbp. Med yderligere stigninger i skærstørrelse forringes infektion effektivitet gradvist.

Kemiske Transfektion og elektroporation er nemmere at bruge, mere sikker og mindre tidskrævende end nogen af de virus-baserede procedurer26,27,28,30. Men i BMDMs og BMDCs, de kan stimulere svar til udenlandske nukleinsyrer31 , og de genererer mere cellulært stress. Derudover nogle kemiske Transfektion reagenser øge celle auto-fluorescens, der kan forstyrre flowcytometri eller mikroskopi analyserer. På grund af den forbigående karakter af udtryk, kan de kun bruges med modne differentierede BMDMs eller BMDCs. Derimod de sekvenser, der er indført med retroviral vektorer er permanent integreret i genomet af target-cellerne og giver mulighed for en stabil langvarig udtryk kompatibel med tidsskala for differentiering protokoller34, 35. imidlertid denne funktion øger også risikoen for pattedyrsceller mutagenese. På grund af den relativt tilfældige karakter af vektor integration er dens virkninger på store bestande af celler begrænset. De kan dog være synlige på niveauet af individuelle celler. Yderligere problemer kan opstå, når en konstruktion udtrykt fra retroviral vektor påvirker dendritiske celle eller makrofag differentiering, hvilket resulterer i manglende evne til at generere differentierede BMDMs eller BMDCs fra inficerede stamfaderen. Til en vis grad dette kan løses ved at justere infektion betingelserne for at opnå lav udtryk (fx., ved at reducere virus titer) eller ved hjælp af en inducerbar ekspressionssystem. Brugen af EGFP sammenvoksede til protein af interesse eller som reporter også giver mulighed for sortering af celler med udtryk niveau svarende til eksperiment mål og begrænsninger. Endelig bør vi også nævne problemer fælles for alle Transfektion/transduktion procedurer. Disse omfatter primært overekspression artefakter, såsom protein, misfoldning, mislocalization og toksicitet36. Protein toksicitet kunne være grunden til, hvorfor OPAL1 var relativt vanskeligt at udtrykke. Dens eksempel viser klart, at karakteren af de udtrykte proteiner væsentligt kan påvirke effektiviteten af denne metode. Men trods dette kunne vi få tilstrækkelige mængder af OPAL1-EGFP udtrykker celler for mikroskopi analyse med denne metode, demonstrere sin nytte, selv når der beskæftiger sig med vanskelige mål. Derudover ville det være muligt at øge procentdelen af transduced celler ved FACS sortering hvis det kræves af et bestemt program. Lav infektion effektivitet kan også løses delvist ved at øge viral partikel koncentration ved hjælp af forskellige metoder eller klar-til-brug kits. I vores hænder, ultrafiltrering af viral supernatanten på centrifugal filtre med en molekylvægt, skåret ud af 100 kDa har vist sig for at give den bedste balance mellem effektivitet og krævede indsats.

Knoglemarven afledt makrofager og dendritiske celler er almindeligt anvendte værktøjer i phagocyt immunologi. De er mere fysiologisk relevante end disponible cellelinjer. De kan oprettes i relativt høje tal, og på samme tid, mangler den genetiske heterogenitet og ustabilitet karakteristisk for cellelinjer. En anden fordel er, at de kan genereres fra genmodificerede mus at studere virkningerne af genetisk modifikation på en forholdsvis rigelig og homogen celle population. Dette er især nyttigt i biokemiske undersøgelser, hvor relativt store mængder af celler er typisk kræves. Evnen til at transduce disse celler med cDNA konstruktioner åbner yderligere muligheder for forskning baseret på rekonstitution eller komplementering af genetiske defekter i disse celler og struktur-funktion analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tjekkiske Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), af Charles University Grant agentur (GAUK) (projektnummer 923116) og af institutionel finansiering fra Institut for molekylær genetik, Academy of Sciences i tjekkiske Republik (RVO 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Tags

Biologi spørgsmål 140 dendritiske celler makrofager myeloide celler differentiering murine knoglemarv celler cytokiner M-CSF GM-CSF virusinfektion normal god landbrugspraksis markeret protein
Udtryk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine knoglemarv-afledte dendritiske celler og makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kralova, J., Glatzova, D., Borna,… More

Kralova, J., Glatzova, D., Borna, S., Brdicka, T. Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e58081, doi:10.3791/58081 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter