Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Uttrykk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler og makrofager

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for uttrykket av fluorescerende fusion proteiner i murine benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager. Metoden er basert på signaltransduksjon av benmarg progenitors med retroviral konstruksjoner etterfulgt av differensiering i makrofager og dendrittiske celler i vitro.

Abstract

Dendrittiske celler og makrofager er avgjørende celler som danner den første linjen i forsvaret mot patogener. De kan også spille viktige roller i initiering av en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbeid med disse cellene er ganske utfordrende. Sin overflod i organer og vev er relativt lav. Som et resultat kan ikke de bli isolert i stort antall. De er også vanskelig å transfect med cDNA konstruksjoner. I murine modellen, kan disse problemene være delvis overvunnet av i vitro differensiering fra benmargen progenitors i nærvær av M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendrittiske celler. På denne måten er det mulig å få store mengder av disse cellene fra svært få dyr. Videre kan benmarg progenitors være transduced med retroviral vektorer bærer cDNA konstruksjoner i tidlige stadier av dyrking før deres differensiering inn benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager. Dermed kan retroviral signaltransduksjon etterfulgt av differensiering i vitro brukes til å uttrykke ulike cDNA konstruksjoner i disse cellene. Muligheten til å uttrykke ektopisk proteiner betydelig utvider utvalget av eksperimenter som kan utføres på disse cellene, inkludert levende celle imaging fluorescerende proteiner, tandem renselser for interactome analyser, struktur-funksjon analyser, overvåking av cellulære funksjoner med biosensors og mange andre. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for retroviral signaltransduksjon murine benmarg avledet dendrittiske celler og makrofager med vektorer koding for fluorescently-merket proteiner. På eksempel på to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, viser vi den praktiske anvendelsen i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger av denne tilnærmingen.

Introduction

Myeloide celler representerer en uunnværlig del av våre forsvarsmekanismer mot patogener. De kan raskt eliminere mikrober, samt døende celler. Dessuten, er de også involvert i å regulere vev utvikling og reparasjon og opprettholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler skille fra vanlige myelogen progenitors i beinmargen. Deres differensiering inn mange funksjonelt og morphologically forskjellige undergrupper er i stor grad kontrollert av cytokiner og deres ulike kombinasjoner4. De mest intensivt studerte myelogen celle undergrupper inkluderer neutrophilic granulocytter, makrofager og dendrittiske celler. Feil i noen av disse befolkningene føre til potensielt livstruende konsekvenser og forårsake alvorlige dysfunksjoner av immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.

I motsetning til neutrophilic granulocytter, dendrittiske celler og makrofager vev bosatt celler og sin overflod i immun organer er relativt lav. Som et resultat, er isolasjon og rensing av primære dendrittiske celler og makrofager for eksperimenter krever et stort antall av disse cellene dyrt og ofte umulig. For å løse dette problemet, er protokollene utviklet for å få store mengder homogen makrofager eller dendrittiske celler i vitro. Disse metodene er avhengig av differensieringen murine beinmargen celleområde i nærvær av cytokiner: macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) for makrofager og granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendrittiske celler7,8,9,10,11,12. Celler generert av denne metoden er ofte beskrevet i litteraturen som benmarg avledet makrofager (BMDMs) og benmarg avledet dendrittiske celler (BMDCs). De har mer fysiologiske egenskaper til felles med primære makrofager eller dendrittiske celler enn med tilsvarende linjer. En annen stor fordel er muligheten for å få disse cellene danner genetisk endret mus13. Komparative studier mellom vill-type celler og celler avledet fra genmodifiserte mus er ofte avgjørende for avdekke romanen funksjoner av gener eller proteiner av interesse.

Analyse av subcellular lokalisering av proteiner i levende celler krever koblingen av en fluorescerende etikett til protein av interesse i vivo. Dette oppnås vanligvis ved å uttrykke genetisk kodet fusion konstruere består av en analysert protein kombinert (ofte via en kort linker) til et fluorescerende protein (f.eks., grønn fluorescerende protein (GFP))14,15 , 16. uttrykk for fluorescently merket proteiner i dendrittiske celler og makrofager er utfordrende. Disse cellene er generelt vanskelig å transfect standard hva prosedyrer og effektiviteten pleier å være svært lav. Videre til hva er forbigående, den genererer mobilnettet stress og oppnådd intensiteten av fluorescens kanskje ikke tilstrekkelig for mikroskopi17. For å oppnå en rimelig andel av disse cellene med et tilstrekkelig nivå av transgene uttrykk, infeksjon av benmarg progenitor celler med retroviral har vektorer og deres påfølgende differensiering inn BMDMs eller BMDCs blitt en svært effektiv tilnærming. Det lov for analyse av proteiner myelogen opprinnelse i deres eget mobilnettet miljø, både stabilt eller i prosesser som er kritiske for immunforsvaret som fagocytose, immunologiske synapse formasjon eller overføring. Her beskriver vi en protokoll som tillater stabil uttrykk for fluorescently merket proteiner av interesse i murine benmarg avledet makrofager og dendrittiske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av ekspert komiteen for velferd av forsøksdyr av Institutt for molekylær genetikk og Academy of Sciences i Tsjekkia.

1. forberedelse av reagenser

  1. Forberede ammonium-klor-kalium (ACK) bufferen. Legge til 4.145 g NH4Cl og 0,5 g KHCO3 500 mL ddH2O, og legge til 100 µL av 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og filter-sterilisere.
  2. Forberede polyethylenimine (PEI) løsning. Legge til 0,1 g PEI 90 mL ddH2O. Under omrøring, Legg 1 M HCl dropwise til pH er lavere enn 2.0. Juster deretter pH-verdien til 7.2 med 1 M NaOH rør for opp til 3t til PEI er oppløst. Juster volumet til 100 mL med ddH2O og filter-sterilisere. Gjøre 1-2 mL dele og lagre på 20 ° C.
    Merk: Etter tining, PEI kan lagres på 4 ° C 2 uker men ikke skal fryses igjen.
  3. Forberede celle kultur supernatants som inneholder M-CSF eller GM-CSF. Disse supernatants kan gjøres på forhånd og lagret i-80 ° C. For å gjøre disse supernatants, kan du vokse cytokin-produserende cellene (J558 celler for GM-CSF 18 ) eller CMG 14-12 cellene for M-CSF 19i en 10 cm Petriskål i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) til samløpet. Deretter overføre alle celler til 200 mL medier i T150 vev kultur kolbe og kultur for ytterligere 4 dager på 5% CO237 ° C. Samle nedbryting og filter over 0,2 µm sterilisering filter. Gjøre dele og lagre disse på-80 ° C.
  4. Forberede 100 mL celle kultur medium: DMEM med 10% varme deaktivert FBS og celle kultur supernatants fra celler sekresjon GM-CSF (for BMDC differensiering) eller M-CSF (for BMDM differensiering).
    Merk: Mengden av cytokiner i disse supernatants kan variere og arbeider konsentrasjonen har bestemmes empirisk. Det brukes vanligvis 2-3% nedbryting fra cellelinjer produsere GM-CSF (anbefalt Start konsentrasjonen er 2%) eller 5 – 10% nedbryting fra CMG 14-12 celler produserer M-CSF (anbefalt Start konsentrasjonen er 10%). Alternativt renset kommersielt tilgjengelig M-CSF på 10 ng/mL og GM-CSF på 20 ng/mL kan brukes med resultater nesten identisk cytokin inneholder supernatants, dvs., uten noen effekt på frekvensen av differensiering, infeksjon effektivitet og subcellular lokalisering av EGFP-merket konstruksjoner. Antibiotika, inkludert penicillin G (100 IU/mL), streptomycin (100 µg/mL) og gentamicin (40 µg/mL), kan brukes til cellekultur på alle trinn av protokollen annet er oppgitt.

2. produksjon av Retrovirus

Advarsel: Selv om retroviral vektorer er relativt trygt sammenlignet med andre typer viral vektorer, de fortsatt utgjør en potensiell sikkerhetsrisiko. Derfor er det avgjørende å jobbe med omhu og riktig verneutstyr, og overholder alle sikkerhetsforskrifter og juridiske krav for å arbeide med virus partikler.

  1. Plate en enkeltcelle suspensjon av Platinum-Eco (Plat-E) emballasje celler i en 10 cm Petriskål og dyrke i 15 mL DMEM inneholder 10% FBS til 50-60% confluent (24 timer). Cellene skal vokse i en monolayer og bør ikke danne klumper i kultur.
  2. Pipetter 20 µg av retroviral konstruksjon (f.eks., konstruksjon uttrykke fluorescently merket protein interesse pMSCV vektor) og 10 µg pCL-Eco emballasje vektor20 i 1 mL av DMEM (uten serum og antibiotika) og bland forsiktig.
  3. Slik andre legge 75 µL Pei i 1 mL av DMEM (uten serum og antibiotika). Inkuber 5 min ved romtemperatur (RT) og bland innholdet i begge rør sammen og ruge i ytterligere 10 minutter på RT.
    NOTE Addisjonen av pCL-Eco er valgfritt. Det er koding for ecotropic viral reseptoren og kan øke virus titer.
  4. Nøye erstatte mediet på Plat-E celler med 8 mL av ferske DMEMsupplemented med 2% FBS. Forvarm mellomlang til 37 ° C før bruk. Ikke bruk antibiotika under transfection, siden antibiotika kan redusere transfection effektiviteten.
  5. Forsiktig legge til (i dråper) blandingen i trinn 2.3 på Plat-E cellene og ruge 4 h på 37 ° C.
  6. Etter inkubasjon, utveksle mediet på Plat-E celler for 10 mL forvarmes DMEM inneholder 10% FBS, og dyrke celler for 24 h på 37 ° C. Under denne inkubasjon produsere Plat-E cellene virus i media.
  7. Etter 24 timer, samle inn mediet som inneholder retroviral partikler fra Platinum Eco celler med en 5 mL pipette og overføre den til en 15 mL sentrifuge tube (= "supernatant 1" inneholder ecotropic retroviral partikler).
  8. For å unngå forurensning av Plat-E celler i viral supernatants, spin samlet viruset 1250 × g i 5 min på 4 ° C. De beste resultatene, bør viruset brukes umiddelbart for infeksjon.
    Merk: Dele virus kan også lagres på-80 ° C for senere bruk. Imidlertid vil det resultere i visse reduksjon i signaltransduksjon effektivitet. Unngå repeterende fryser/tining av viruset, siden det fører til virus degradering.
  9. Legge til 10 mL forvarmes DMEM med 10% FBS Plat-e celler og dyrke en annen 24 h på 37 ° C.
  10. Gjenta 2.7. og 2.8. å få "supernatant 2".

3. murine benmarg cellen aisolering

  1. Ofre musen bruker cervical forvridning eller annen godkjent metode. Spray musen med 70% etanol.
  2. Bruke pinsett og saks, fjerne hud samt en del av muskler fra bakbena. Forsiktig kablene acetabulum fra hip joint uten å bryte femur. Kuttet labben i ankelleddet. Spray bein (femur koblet til tibia) med 70% etanol og fjerne resten av musklene med tørkepapir.
  3. Plasser bein i en 5 cm Petriskål inneholder sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) med 2% FBS (PBS-FBS).  Hvis forbereder flere bein, holde Petriskål på is inntil behandlet.
  4. For å sikre dyrking sterilitet, kan du utføre alle følgende trinn i vev kultur hette.
  5. Skille femur fra tibia uten å bryte bein endene (bøy i kneet felles og nøye klippe med saks).
  6. Behandle bein enkeltvis. Avskåret en svært liten del av epiphyses (ca 1-2 mm) med saks mens du holder benet i pinsett.
  7. Bruke en 30 G nål og 2 eller 5 mL sprøyte fylt med PBS-FBS å spyle benmarg cellene fra begge ender av benet inn i et 15 mL sentrifuge rør. Bevege nålen inne benet under spyle for å fjerne alle cellene. Hvis nålen blir tett, endres.
    Merk: Bein bør slå fra rødt til hvitt under rødme. Dette indikerer at flertallet av cellene ble fjernet fra benet. Bruk ca 2-3 mL av PBS-FBS per bein.
  8. Sentrifuge cellene på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
  9. Forkast nedbryting og lyse røde blod celler ved resuspending pellet i 2,5 mL ACK bufferen i 2-3 min i romtemperatur. Under lyse, filtrere bein margtransplantasjon celler gjennom en 100 μm celle sil i en fersk 15 mL centrifug tube. Gjenopprette tonicity ved å legge til 12 mL PBS-FBS.
    Merk: Ikke overstige 5 min av hypotonisk lyse med ACK buffer å unngå celledød.
  10. Sentrifuge umiddelbart på 500 x g i 5 min på 4 ° C.

4. benmarg celledifferensiering i benmargen avledet makrofager

  1. Resuspend pellets beinmargen celleområde i DMEM med 10% FBS og antibiotika (se merknaden etter trinn 1.4. for antibiotika konsentrasjon) og telle celler. For differensiering inn BM avledet makrofager, plate 5-10 x 106 beinmargen celleområde i en 10 cm ikke-vev kultur behandlet (bakteriell) Petriskål med 10 mL av pre-forberedt DMEM media med serum og M-CSF fra trinn 1.4.
    Merk: Avkastningen av benmarg cellene er ca 4 x 107 per 6 – 8-uke-gamle C57BL/6J musen.
  2. Inkuber cellene i celle kultur inkubator for 3 dager på 5% CO2, 37 ° C.
    Merk: I løpet av de 3 første dagene, celler ser ikke veldig viktig, som mange apoptotisk celler presentere (celler kan ikke skille ut myeloide celler og terminalt differensierte celler).
  3. Etter 3 dager, benmarg cellekultur begynner å se vital og klynger av dele celler er dannet. Første tilhenger celler kan allerede være observert. På dette punktet, supplement cellene med fersk cytokin media.
  4. Legge 10 mL av forvarmes DMEM media med serum og M-CSF (fra trinn 1.4) inn hvert 10 cm Petriskål og returnere det i celle kultur inkubator. Det er ikke nødvendig å fjerne den gamle mediet i dette trinnet.
    Merk: benmarg makrofager er fullt ut etter 5-7 dager i kultur. Det beste tidspunktet for høsting er på dag 6-8, der flertallet av celler er tilhenger og Petriskål er helt dekket.
  5. På dag 5, ta Petriskål celle kultur panseret og helle retten til media er nesten nå kanten av parabolen. Ta forsiktig ut 15 mL av media fra overflaten nær kanten, og cellene pleier å bo midt parabolen. Legg til samme volum av forvarmes media med M-CSF og plasser rett tilbake i inkubator.
    Merk: Hvis media er pustende sakte og forsiktig, nesten ingen celler er tapt. Det er imidlertid også mulig å sentrifuge aspirerede media og legge cellene kulturen, å sikre at ingen ikke-tilhenger (dvs., ufullstendig differensiert) celler er tapt.
  6. Eksperimenter brukes bare tilhenger celler (makrofager). For å høste celler, dag 6 eller 7, fjerne alle medier og flytende celler. Vask parabolen gang med forvarmes PBS uten serum.
  7. Legge til 5 mL av 0.02% EDTA i PBS og ruge i 3-5 min på 37 ° C i vev kultur inkubator.
  8. Bruker en 5 mL pipette, fjerne celler fra parabolen av en strøm av PBS-EDTA og plassere dem i en 50 mL sentrifuge tube med 25 mL PBS. Hvis nødvendig, bassenget mer retter sammen.
  9. Sentrifuge umiddelbart på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
  10. Resuspend macrophage pellet i DMEM media og telle celler. Kontroller uttrykk for macrophage overflaten differensiering markører (CD11b og F4/80) av flowcytometri.
  11. For eksperimenter krever cellene i suspensjon, f.eks., strømmer cytometri eksperimenter, qPCR eller western blot analyse, bruke makrofager direkte. For eksperimenter med tilhenger makrofager, plate cellene i vev kultur plate i henhold til eksperimentelle oppsettet.
  12. Cellene er allerede fullt ut. Holde dem i media passer for de tiltenkte eksperimentet eller opprinnelige vekst og differensiering media med M-CSF.
    Merk: For arbeide med tilhenger makrofager, overføre dem til en ny plate minst 6 h før bruk (ideelt over natten) for å tillate full vedheft å det ny overflaten. Brøkdel av flytende celler kan fjernes før eksperimentet.

5. benmarg celledifferensiering i benmargen avledet dendrittiske celler

  1. Følg protokollen for BMDMs med justeringer som er spesifikke for BMDCs beskrevet nedenfor i trinn 5.2-5.4.
  2. Resuspend den fått pellet av bein margtransplantasjon celler i DMEMsupplemented med 10% FBS og antibiotika og telle celler (ved følgende trinn 4.1 macrophage protokollen). Differensiering inn dendrittiske celler behandlet plate 1-1,5 x 107 bein margtransplantasjon celler i en 10 cm ikke-vev kultur (bakteriell) Petriskål i 10 mL av pre-forberedt DMEM media med serum og GM-CSF (fra trinn 1.4.).
  3. Følg de samme trinnene dyrking som BMDM protokollen (trinn 4.3-4.5. macrophage protokollen). Bruk DMEM media med serum og GM-CSF i stedet for M-CSF. Siden for BMDCs dyrking tiden er lengre (vanligvis 10-12 dager), legge til 1-2 ekstra feedings i 3 dagers mellomrom (ved å fjerne nedbryting og legge et nytt dyrking media som beskrevet i trinn 4.5.).
  4. Denne delen av protokollen er nesten det samme som en tilsvarende del av macrophage protokollen (trinn 4.6-4,12. macrophage protokollen). Bruk bare tilhenger celler for eksperimenter. Dag 10-12, samle celler med EDTA, teller og plate dem på en ny overflate. Kontrollere uttrykket av overflaten differensiering markører av dendrittiske celler (CD11c +, CD11b +, F4/80-) av flowcytometri.

6. produksjon av BMDMs og BMDCs uttrykke EGFP-merket Protein rundt

  1. Resuspend pellets beinmargen celleområde innhentet i trinn 3.10. i DMEM supplert med 10% FBS og antibiotika og telle celler. Bruk 2-5 x 10 for infeksjon,6 BM celler per brønn av en 6-og vev kultur behandlet plate.
  2. Plate cellene i 1 mL av forberedt DMEM media per supplert Vel, enten med M-CSF for differensiering inn BMDMs eller GM-CSF for differensiering i BMDCs. holde celler for 4-6 h i en vev kultur inkubator med 5% CO2 på 37 ° C.
  3. Legg 2 mL fersk samlet virus ("supernatant 1") med polybrene (12 µg/mL, siste konsentrasjon 8 µg/mL etter tillegg til cellene).
    Merk: Frosne aliquot virus inneholder nedbryting av kan også brukes, men effekten vil være lavere.
  4. Sentrifuge platen 1250 x g for 90 min på 30 ° C (med langsom akselerasjon og deselerasjon). Deretter ruge 4 h med 5% CO2 på 37 ° C.
  5. Valgfritt: Erstatte 2 mL kultur media med fersk medium med respektive cytokin (M-CSF eller GM-CSF) og kultur med 5% CO2 på 37 ° C. På den andre dagen, fjerne 2 mL kultur medier og gjenta hele infeksjon (trinn 6.3-6.4) med 2 mL fersk samlet virus ("supernatant 2").
    Merk: Dette trinnet kan øke infeksjon effekt. Forbedring etter andre infeksjonen er avhengig celle type og målet protein og i vår erfaring kan variere fra 30% økning i effektivitet til ingen forbedring i det hele tatt.
  6. Samle ikke-tilhenger cellene, overføre slik 15 mL sentrifuge og spinne på 500 x g i 5 min (4 ° C). Kast nedbryting.
  7. Resuspend celle pellet i 10 mL av kultur medier med M-CSF eller GM-CSF, plasserer cellene i en behandlet Petriskål i 10 cm vev kultur og kultur ved 37 ° C, 5% CO2. Optimalt antall celler for en 10 cm rett er 5-10 x 106 BM-avledet makrofager og 10-15 x 106 BM-avledet dendrittiske cellen.
    Merk: Mindre retter eller platene kan brukes, men cellen tallene må justeres tilsvarende.
  8. Følg macrophage og dendrittiske celle dyrking og differensiering protokoll beskrevet i trinn 4 og 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Signalnettverk adapter proteiner er vanligvis små proteiner uten noen enzymatisk aktivitet. De har ulike samspill domener eller motiver, som megle binding til andre proteiner involvert i signaltransduksjon, inkludert tyrosin kinaser, phosphatases, ubiquitin ligases og andre21. Demonstrasjon av funksjonaliteten til denne protokollen ble myelogen celle adaptere PSTPIP2 og OPAL1 valgt. PSTPIP2 er også preget protein er involvert i regulering av betennelsesreaksjon22. Det er en cytoplasmatiske protein som kan også bli rekruttert til mobilnettet membraner via sitt F-bar-domene. Andre protein er en transmembrane adapter OPAL1, forventes å være knyttet til mobilnettet membraner. Dens fysiologiske funksjon er fortsatt ukjent. Men i akutt lymfatisk leukemi er uttrykk for OPAL1 assosiert med bedre prognose23.

cDNA konstruerer koding for PSTPIP2 eller OPAL1 smeltet via et kort linker (GSGGGS eller Myc-tag, henholdsvis) til EGFP på C-terminus ble klonet i pMSCV retroviral vektoren bruker standardmetoder cDNA måte. Denne konstruksjonen ble deretter transfekterte i Plat-E celler med emballasje vektor pCL-Eco. De resulterende supernatants som inneholder retroviruses ble brukt for signaltransduksjon av bein margtransplantasjon celler, etterfulgt av differensiering i BMDMs og BMDCs. Effekten av Plat-E transfection ble evaluert av flowcytometri etter samlingen av andre virus som inneholder nedbryting. Mener transfection effektivitet var 62% for PSTPIP2-EGFP og 53% for OPAL1 og resultatene var svært reproduserbare (figur 1A, B). OPAL1 konstruksjon syntes å være mer giftig for Plat-E celler (vurdert av utseendet på flytende/døde celler i kultur), resulterer i en reduksjon i prosenter av transfekterte celler.

Differensiering status benmarg avledet makrofager og dendrittiske celler (transduced med PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP retroviral konstruksjoner) ble vurdert av flowcytometri. Eldre macrophage befolkningen er definert av CD11b og F4/80 uttrykk, mens dendrittiske celler express CD11c avstamning markøren. Mer enn 90% av cellene i begge typer kultur var positive for deres respektive markører (figur 2A, B). Til slutt, vi fastslått hvilket uttrykk PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP-konstruksjoner i BMDMs og BMDCs av en enkel cytometri måling av EGFP fluorescens. Mener andelen EGFP-positive makrofager var 71% for PSTPIP2-EGFP og 62% for OPAL1-EGFP (figur 3A). Ved dendrittiske celler, effektiviteten var lavere, 32% for PSTPIP2 og 9% for OPAL1 (figur 3B). Resultatene av flere eksperimenter viser reproduserbarhet av denne metoden (Figur 3 c).

Vi vanligvis bestemme ikke virus konsentrasjonen i supernatants som vi bruker i infeksjoner. Vi foretrekker å bruke det virus supernatants friskt og umiddelbart etter samling, mens virus titer fastsettelse krever tre flere dager. Derfor informasjonen på virus titer kan bare hentes ex post. Men kan det fortsatt være nyttig når tekniske problemer og problemer. For å vurdere virus konsentrasjonen i supernatants fra Plat E celler transfekterte med PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP-konstruksjoner, vi ruges NIH-3T3 celler med serielt utvannet virus inneholder supernatants fra disse transfekterte Plat-E cellene og bestemt virus titer akkurat som beskrevet av Zjablovskaja et al i tidligere publiserte JoVE artikkelen24. I tre uavhengige eksperimenter, virus titer varierte fra 1.1 x 106 4.4 x 106 TU/mL. Vi observerer ikke noen betydelige forskjeller mellom PSTPIP1-EGFP og OPAL1-EGFP konstruksjoner og mellom supernatants fra dag 1 og dag 2. Når disse supernatants ble brukt for benmarg celle infeksjoner i henhold til protokollen vi beskriver i denne artikkelen, mangfoldet av infeksjon (MOI) varierte fra 1.1 til 4.4. Interessant, innenfor dette intervallet observerer vi ikke korrelasjon mellom MOI og infeksjon.

I Figur 4, var PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP i BMDMs og BMDCs visualisert ved AC confocal mikroskopi. Fullt differensiert makrofager og dendrittiske celler har en karakteristisk figur. Endringen i morfologi liten avrundet progenitor celler til store cellene av irregulære former bekrefter vellykket differensiering. I makrofager var PSTPIP2 cytoplasmatiske med delvis lokalisering i plasma membranen. OPAL1 syntes å være også delvis rettet mot plasma membranen. Resten var sannsynligvis knyttet til intracellulær membraner, som endoplasmatiske retikulum og Golgi komplekset. Men for å bekrefte denne lokalisering, må bestemte organelle markører brukes. I dendrittiske celler var membran lokalisering mindre tydelig.

Figure 1
Figur 1: effektiviteten av Plat-E celle transfection. For hva Plat-E celler, ble to konstruksjoner koding adapter proteiner PSTPIP2 og OPAL1 smeltet sammen med EGFP (PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP) klonet inn pMSCV vektor. Standard PEI transfection ble utført. Effekten av transfection ble evaluert av flowcytometri Plat-E cellene etter samlingen av andre viral nedbryting. (A). representant flyt cytometri plot. (B). grafen viser resultatene av fire uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: vurdering av differensiering status for BMDMs (A) og BMDCs (B). Overflaten uttrykk for bestemte macrophage og dendrittiske celle lineage markører ble målt ved flowcytometri på dag 8 av dyrking. Døde celler var gated ut basert på deres side og videresende scatter egenskaper og flekker med Hoechst 33258. Resultatene er representant for minst 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: vurdering av uttrykk for PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP. EGFP fluorescens i BMDMs (A) og BMDCs (B) retrovirally transduced med PSTPIP2-EGFP og OPAL1-EGFP konstruksjoner ble målt ved flowcytometri på dag 8 av dyrking. (C) . Diagram som viser resultatene av flere uavhengige eksperimenter. BMDMs og BMDCs var gated som i figur 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant bilder av makrofager og dendrittiske celler uttrykke PSTPIP2 eller OPAL1. BMDMs (A) og BMDCs (B) uttrykker PSTPIP2 og OPAL1 var visualisert ved live bildebehandling AC confocal mikroskopi. EGFP fluorescens i grønt vises på venstre side av hvert panel, lyse feltet bildet til høyre. Skala bar = 10 µm. Resultatene er representant for minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uttrykket protein interesse for målcellene er et viktig skritt i mange typer biologiske studier. Differensiert makrofager og dendrittiske celler er vanskelig å transfect av standard transfection og retroviral signaltransduksjon teknikker. Omgåelsen transfection av disse differensierte celler med retroviral signaltransduksjon av benmarg progenitors, etterfulgt av differensiering når de allerede bærer den ønskede konstruksjonen er et kritisk steg gir uttrykk for ektopisk cDNAs i disse celletyper. Et eksempel på vellykket bruk av denne metoden kan finnes i våre siste publikasjon25. Her gir vi en kostnadseffektiv protokoll for å oppnå stabil uttrykk for konstruksjon av valg i Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler og makrofager bruker denne tilnærmingen. Prosedyren presenterer vi er relativt billig og enkel, men leverer veldig gode resultater. Reagenser i denne protokollen gir rutinemessig bruk selv under et relativt begrenset budsjett. Protokollen for Plat-E transfection sysselsetter PEI som en transfection reagens. Sammenlignet med andre kjemiske transfection agenter, PEI er en svært lav kostnad, mens effektiviteten er lik fleste andre brukte forbindelser. Imidlertid kan PEI erstattes med mange forskjellige kommersielt tilgjengelig transfection reagenser i dette trinnet uten tap av effektivitet. Som et styrende prinsipp utføre hva protokoller kjent for å jobbe med brukte HEK293 celler vanligvis med Plat-E celler, også. En annen kostnadseffektivt tiltak er bruken av cytokin inneholder supernatants i stedet for renset rekombinant cytokiner. Bruken av disse supernatants krever noen optimalisering. Men når standardprotokollen for forberedelsen er etablert og etterfulgt, blir variasjon mellom individuelle grupper av disse supernatants svært lav, vanligvis krever ingen endringer i arbeider konsentrasjoner mellom individuelle. Effektiviteten av BMDM og BMDC differensiering med disse supernatants er, i vår erfaring, identisk renset cytokiner.

I tillegg til retroviral transduction finnes andre veletablerte metoder for pattedyr celle transfection, inkludert kjemiske transfection (vanligvis bruker kationisk lipider eller kationisk polymerer danner komplekser med DNA), electroporation og bruk av andre typer viral vektorer, hovedsakelig adenoviral og lentiviral26,27,28,29,30. Selv om svært høy titers og effektivitet oppnås med adenovirus-baserte gen levering, utarbeidelse av tilsvarende plasmider og virus partikler er vanskeligere og mer tidkrevende enn ved retroviral systemer29. I tillegg utløser adenovirus betennelsesreaksjon i dendrittiske celler og makrofager29,31,32 og for optimal ytelse i murine blodkreft cellene musen belastning bærer transgene adenovirus reseptor er nødvendig33. På den annen side, er generering av lentiviral partikler bærer genet av interesse en relativt enkel prosess, nesten identisk med den benyttes for retroviruses. I motsetning til ecotropic retroviral vektorer i denne protokollen, er lentiviruses dugelig av infeksjon ikke-voksende cellene i flere arter, inkludert mennesker34. Dette kan være en viktig fordel under bestemte eksperimentelle forhold. Men kompromisser denne funksjonen også sterkt sikkerheten til disse vektorer. Etter vår mening, gen levering til BMDMs og BMDCs, gir retroviruses den beste balansen mellom effektivitet, sikkerhet og brukervennlighet. Retroviral DNA konstruksjoner kan tilberedes enkelt ved hjelp av enkle molekylær kloning. Virus er produsert av Pakkelinjer celle direkte til kultur supernatant og ytterligere virus rensing er vanligvis ikke nødvendig. Ecotropic retroviruses også infisere ikke lett menneskelige celler, noe som gjør deres bruk relativt trygt. Men det er også noen generelle ulemper knyttet til bruk av retroviral vektorer. Den store begrensende faktoren er at disse virus infisere bare proliferating celler35. Denne funksjonen påvirker ikke betydelig protokollen beskrevet her, men det begrenser utvalget av programmer der retroviral vektorer kan brukes. Størrelsen på genet av interesse som kan klones i disse vektorer er også begrenset og viral partikkel titer avtar med økende sett inn størrelse. Med pMSCV vektorer begynner vi vanligvis å se effektene av sett inn størrelsen på rundt 3 kbp. Med ytterligere økning i sett inn størrelse avtar infeksjon effektiviteten gradvis.

Den kjemiske transfection og electroporation er enklere å bruke, sikrere og mindre tidkrevende enn noen av virus-basert prosedyrer26,27,28,30. Men i BMDMs og BMDCs, de kan stimulere svar til utenlandske nukleinsyrer31 og de genererer mer mobilnettet stress. I tillegg noen kjemiske transfection reagenser øker celle auto-fluorescens som kan forstyrre flowcytometri eller mikroskopi analyserer. På grunn av forbigående natur uttrykk, kan de bare brukes med eldre differensiert BMDMs eller BMDCs. Derimot sekvensene introdusert med retroviral vektorer er godt integrert i genomet av målcellene og gi rom for en stabil langvarig uttrykk kompatibel med tiden omfanget av differensiering protokoller34, 35. imidlertid denne funksjonen øker også risikoen for insertional mutagenese. På grunn av relativt tilfeldige natur vector integrering er dens virkning på store bestander av celler begrenset. De kan imidlertid være synlige på nivået av individuelle celler. Flere problemer kan oppstå når en konstruksjon uttrykt fra retroviral vektor påvirker dendrittiske cellen eller macrophage differensiering, som resulterer i feil å generere differensiert BMDMs eller BMDCs fra den infiserte forfedre. I noen grad, dette kan overvinnes ved å justere infeksjon betingelsene for å oppnå lav uttrykk (f.eks., ved å redusere virus titer) eller ved hjelp av en induserbart uttrykk system. Bruk av EGFP smeltet protein av interesse eller som reporter også tillater sortering av celler med uttrykket nivå tilsvarer eksperiment mål og begrensninger. Til slutt, bør vi også nevne problemer vanlig å alle transfection/signaltransduksjon prosedyrer. Disse omfatter hovedsakelig overuttrykte gjenstander, som protein misfolding, mislocalization og toksisitet36. Protein toksisitet kunne hvorfor OPAL1 var relativt vanskelig å uttrykke. Sin eksempel tydelig illustrerer at natur uttrykt protein kan vesentlig påvirke effektiviteten av denne metoden. Men til tross for dette klarte vi å skaffe tilstrekkelige mengder av OPAL1-EGFP uttrykke celler for mikroskopi analyse med denne metoden, demonstrere dens nytte selv når håndtere vanskelig mål. I tillegg vil det være mulig å øke prosenter av transduced celler av FACS sortering hvis det kreves av et bestemt program. Lav infeksjon effektiviteten kan også delvis løses ved å øke viral partikkel konsentrasjon med ulike metoder eller klar-å-bruk prosjektpakker. I våre hender, ultrafiltrasjon av viral nedbryting på sentrifugal filtre med en molekylvekt kuttet av 100 kDa har vist seg for å gi balanse mellom effektivitet og nødvendige anstrengelser.

Benmarg avledet makrofager og dendrittiske celler er mye brukt verktøy i phagocyte immunologi. De er mer fysiologisk relevant enn tilgjengelige linjer. De kan genereres i forholdsvis høye, og samtidig, mangler den genetiske heterogenitet og ustabilitet karakteristiske linjer. En annen fordel er at de kan genereres fra genmodifiserte mus å studere virkningene av genetisk modifisering på en relativt rikelig og homogen celle befolkningen. Dette er spesielt nyttig i biokjemiske studier, der relativt store mengder cellene er vanligvis nødvendig. Muligheten til å transduce disse cellene med cDNA konstruksjoner åpner flere muligheter forskning basert på rekonstituering eller complementation av genetiske defekter i disse cellene og struktur-funksjon analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tsjekkiske Science Foundation (GACR) (prosjektnummer 16-07425S), av Charles University Grant Agency (GAUK) (prosjektnummeret 923116) og av institusjonelle finansiering fra Institutt for molekylær genetikk, Academy of Sciences i tsjekkiske Republikken (RVO 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Tags

Biologi problemet 140 dendrittiske celler makrofager myeloide celler differensiering murine bein margtransplantasjon celler cytokiner M-CSF GM-CSF virusinfeksjon GFP merket protein
Uttrykk for fluorescerende Fusion proteiner i Murine Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler og makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kralova, J., Glatzova, D., Borna,… More

Kralova, J., Glatzova, D., Borna, S., Brdicka, T. Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e58081, doi:10.3791/58081 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter