Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.
Abstract
Modifications de N6- isopentényl RNA sont fonctionnellement variées et hautement conservée chez les procaryotes et les eucaryotes. Une des plus hautement conservée N6- isopentényl modifications se produit à la position de A37 dans un sous-ensemble des ARNt. Cette modification améliore l’efficacité de la traduction et de la fidélité en augmentant l’affinité de l’ARNt pour le ribosome. Mutation des enzymes responsables de cette modification chez les eucaryotes sont associées à plusieurs états pathologiques, dont le cancer et dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, comprendre la spécificité de substrat et l’activité biochimique de ces enzymes est important pour la compréhension de la biologie eucaryote normale et pathologique. Un large éventail de méthodes a été utilisé pour caractériser les modifications6A je. Dans les présentes est décrit une approche directe pour la détection des isopentenylation par Mod5. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec une transférase isopentényl recombinante, suivie de la digestion de RNase T1 et l’analyse par électrophorèse sur gel 1D pour détecter les modifications de6A je. En outre, la capacité d’adaptation éventuelle du présent protocole pour caractériser d’autres enzymes de modification des RNA est discutée.
Introduction
Au moins 163 modifications de RNA post-transcriptionnel distinctes ont été identifiées, avec ces modifications conférant des fonctions variées et contextuelle à RNAs, directement influencer la structure d’ARN et qui touchent de l’ARN, des interactions avec d’autres molécules1,2. Que l’appréciation par le nombre et la variété de modifications de RNA augmente, il est essentiel d’élaborer des tests qui peuvent interroger fiable tant les modifications de RNA et les enzymes qui catalysent les.
Une des premières modifications RNA d’identifier se produit à base 37 dans les ARNt, adjacent à l’anti-codon sur les 3' côté3,4. Un groupe d’isopentényl est transféré de diméthylallylpyrophosphate (DMAPP) sur la position N6 d’adénosine 37 (j’ai6A37) 3,5 sur un sous-ensemble des ARNt cytoplasmiques et mitochondriale. J’ai6A37 améliore la fidélité de la traduction et l’efficacité en augmentant d’affinité de l’ARNt pour le ribosome4,6 et j’ai6A37 est importante pour la réponse au stress en bactéries7. Les enzymes qui effectuent cette modification sont appelés transférases isopentényl tRNA et sont hautement conservées chez les bactéries8,9, champignons10, vers11, plantes12et chez les eucaryotes supérieurs13 , y compris les humains,14.
Des mutations dans le gène humain de transférase isopentenyl de tRNA, TRIT1, sont associées à des maladies humaines. Par exemple, une mutation dans TRIT1 est corrélée avec une grave maladie mitochondriale, probablement causée par un défaut de synthèse de protéines mitochondriales15,16. Par ailleurs, TRIT1 a été décrit comme un suppresseur de tumeur gène17,18 et est impliquée dans plusieurs types de cancers dont le mélanome19, poitrine20, gastrique21et cancers du poumon22 ,,23. Enfin, TRIT1 et Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentényl transférase est sujettes à l’agrégation de protéines qui forment prion comme fibres amyloïdes24,25,26. Ces observations impliquent potentiellement transférases isopentényl tRNA dans les maladies neurodégénératives, même si une preuve directe pour que cela n’a pas encore été démontrée.
Compte tenu du rôle qu’isopentényl transférase joue dans la traduction et la maladie, les méthodes que j’ai mesurer directement6une activité d’isopentényl transférase sont importants pour une interprétation mécaniste de ces enzymes dans des conditions normales et états pathologiques. Un nombre croissant de méthodes est disponible pour détecter les adaptations de l’ARN de6, y compris en vitro isopentenylation essais, hybridation j’ai en l’absence d’i6A (PHA6) essais, mince chromatographie en couche (TLC), acides aminés tests d’activité acceptation et approches de la spectrométrie de masse (révision Réf. 4).
Une essai in vitro isopentenylation avec a été décrit qui utilise 14C-DMAPP et ARNt sans étiquette. Dans ce test, le carbone radioactif est transféré à l’ARN du 14C-DMAPP de l’isopentényl transférase. Bien que ce test est très sensible, il est souvent difficile de déterminer le résidu spécifique qui est modification9,20,27. PHA6 analyses reposent sur l’encombrant j’ai6A modification interférant avec l’hybridation d’une sonde marquée P 32, s’étendant sur le résidu mis à jour le. À ce titre, l’hybridation est plus grande en l’absence d’un i6une modification18,28,29. Les dosages de PHA6 sont très sensibles et capable d’analyser l’ARN total extrait de lysats cellulaires. En outre, la capacité de concevoir des sondes spécifiques de l’ARN d’intérêt permet cette méthode cible importante. Cependant, PHA6 tests sont limités à la caractérisation des modifications qui se produisent sur les résidus dans la région ciblée de la sonde et sont donc moins susceptibles d’identifier les sites de nouvelles modifications. En outre, comme l’absence de liaison est révélateur de la modification, autres modifications ou mutations qui affectent les ARN contraignantes confondre l’analyse des données.
Une autre approche combine chromatographie de cellulose de benzyle DEAE cellulose (BD) avec activité acceptation d’acides aminés comme une lecture de je6A des modifications dans le tRNA30. Cette approche tests directement la fonction du i modification6A, mais c’est une approche indirecte pour détecter j’ai6A modification et n’a pas de résolution pour mapper les modifications apportées à un résidu spécifique dans l’ARN. Une approche de TLC a été utilisée pour détecter les ARNt total j’ai6A modifications. Dans cette approche, en interne, 32P-étiqueté ARNt sont digérées en nucléotides simples et analyse bidimensionnelle de TLC est utilisé pour identifier des isopentenylation. Cette approche est très sensible dans la détection j’ai total6A dans un échantillon donné de RNA mais après digestion, toutes les informations de séquence sont perdues ; ainsi, le chercheur n’a aucun moyen de déterminer les résidus ont été mis à jour le31.
Plus récemment, les méthodes de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) ont été développés qui comparer quantitativement les modifications de RNA totales entre espèces, les types de cellules et conditions expérimentales32,33, 34. Une limitation de cette méthodologie est qu’il est moins en mesure de déterminer l’identité et la position au sein de l’ARN d'où le nucléoside modifié a été dérivé de34. De plus, l’expertise et l’équipement nécessaire pour exécuter ces expériences limitent l’aspect pratique de cette approche.
En outre, plusieurs technologies de séquençage de nouvelle génération ont été développés pour mapper les RNA modifications à l’échelle du transcriptome34. Immunoprécipitation d’ARN avec des anticorps spécifiques à une modification particulière (RIP-Seq) permettent à l’enquêteur d’identifier toutes les séquences contenant une modification spécifique35,36. En outre, approches axées sur la transcriptase inverse comme Chem-Seq et séquençage de décalage non aléatoire s’appuient sur les perturbations de la réaction de transcription inverse les résidus modifiés37,38,39. Malgré l’avantage de ces techniques pour mapper les modifications transcriptome-échelle de RNA, RIP-seq et Seq-Chem technologies sont limités par l’absence d’anticorps fiables ou de produits chimiques réactifs disponibles pour chaque modification spécifique, respectivement34. En outre, reverse transcriptase enzymes nécessaires à l’exécution de Chem-Seq et les techniques de séquençage de décalage non aléatoire peuvent être entravés par des structures d’ARN stables. Le caractère fortement modifié et structurellement stable des ARNt rendent particulièrement difficiles à interroger à l’aide de ces techniques. A ce jour, la nouvelle génération basée sur le séquençage des technologies n’ont pas encore été utilisés à carte j’ai6une modification34.
Ici, les auteurs décrivent une approche simple et directe pour détecter j’ai6un ARNt modifications in vitro. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec recombinant S. cerevisiae isopentényl transférase (Mod5), suivie de la digestion de la RNase T1 et analyse par électrophorèse sur gel 1D à la carte j’ai6A modifications. Cette approche est directe et nécessite peu d’expertise pour analyser les données. En outre, cette méthode est adaptable aux autre RNA modification des enzymes, y compris les enzymes qui changent par covalence le poids moléculaire de l’ARN ou de mobilité d’un ARN à travers un gel.
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Protocol
Remarque : Le protocole a été adapté du Réf. 24.
1. obtention de l’ARN et enzymes d’intérêt
- Usage in vitro transcrit les ARN marqué en interne avec 32P, et His6-Mod5 recombinant exprimée en et purifié à partir de e. coli, comme précédemment décrit24.
- Introduire dans vitro transcrit RNAs (section 3) à l’aide d’ARN polymérase T7 en présence d’ATP sans étiquette, UTP, CTP, GTP et 10 µCi de gel purifié, a précipité l’éthanol α-ATP, resuspendu dans 1 x TE (pH 7.5, EDTA de 0,1 mM de 10 mM Tris-HCl) et conservés à-80 ° C 24.
- Vous pouvez également obtenir commercialement disponibles RNAs fluorescent étiquetés d’intérêt. Produire l’enzyme d’intérêt dans n’importe quel système d’expression préféré.
ATTENTION : Les étiquettes fluorescentes internes dans l’ARN peuvent modifier structure d’ARN et de la reconnaissance par les enzymes.
2. préparer un 20 % de Polyacrylamide Gel la dénaturation
Remarque : Afin d’obtenir une résolution suffisante de fragments d’ARN, un gel de la dalle verticale de longueur 40 cm est recommandé. La largeur du gel utilisé est déterminée par le nombre d’échantillons à analyser.
- Bien nettoyer les plaques de verre. Tout d’abord, laver à l’eau savonneuse, rincer avec de l’eau désionisée et enfin nettoyer avec l’alcool isopropylique et chiffons non pelucheux.
- Assembler les plaques et les entretoises.
- Mélanger les réactifs suivants pour faire 100 mL de 20 % d’acrylamide, 7,5 M urée, 1 x TBE gel : 80 mL de gel de l’urée se concentrer (237,5 g/L d’acrylamide, 12,5 g/L de méthylène bisacrylamide, 7,5 M urée dans l’eau désionisée), 10 mL de diluant gel urée (7.5 mètres urée dans l’eau désionisée) et 10 mL de tampon de gel d’urée (0,89 M Tris-Borate-20 mM EDTA tampon pH 8,3 et 7,5 M urée).
Remarque : Le volume de solution de gel doit être réglé selon les dimensions du gel. - Ajouter 40 µL de N, N, N′, N′-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 800 µL de persulfate d’ammonium 10 % fraîchement préparée (APS).
- Rédiger la solution de gel dans une grande seringue et répartir entre les plaques de verre. Tapez sur le verre avec les doigts tout en versant pour empêcher la formation de bulles.
- Laisser solidifier pendant 30 min.
- Pince gel solidifié sur appareil gel vertical à l’aide de pinces pour reliures.
- Remplissez les compartiments supérieurs et inférieurs de tampon 1 x TBE.
- Deux heures avant le chargement du gel, exécutez avant le gel à 20 mA, pendant 2 h permettre à la limite de tampon de courir plus vite les oligonucléotides plus petits -, sinon le plus petit nucléotides et oligonucléotides ont tendance à s’effondrer sur le devant de la mémoire tampon.
3. RNA Isopentenylation Assay
- Préparer des réactions dans un volume final de 17 µL, contenant 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 inhibiteur de U de RNase (p. ex., SuperRNaseIn), 40 000 CPM en interne 32marqués P RNA, 5,3 µM Mod5 et 1,2 mM 2 - mercaptoéthanol.
- Incuber à 37 ° C pendant 1 h, les réactions.
- Éthanol-précipité RNAs utilisant 2,5 volumes (42,5 µL) d’éthanol à 100 % et de 1/10 volumes (1,7 µL) d’acétate de sodium 3,5 M pH 5.5 et place à-20 ° C pour 1 h ou toute une nuit.
- Centrifuger les échantillons d’ARN pendant 20 min à 15 400 x g et 4 ° C.
- Avec précaution, retirez le surnageant et laver le culot de RNA avec 500 µL d’éthanol à 70 %.
- Centrifuger les échantillons à pendant 5 min 15 400 x g et 4° C.
- Retirer délicatement les boulettes de RNA surnageants et séchage à l’air pendant 15 minutes, ou jusqu'à ce que tout l’éthanol s’est évaporée.
- Resuspendre les pastilles de RNA dans 10 µL d’urée 8 M.
- Ajouter 150 U de RNase T1 et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Ajouter 2 µL de 6 x chargement tampon (60 % de glycérol, 0,1 % de xylène cyanol).
- Charger de 10 µL de chaque échantillon de RNA sur un pré exécution, 20 % polyacrylamide, gel d’urée de 7,5 M (Voir l’article 2 du protocole).
NOTE : Radiomarquées RNA taille échelles peuvent être inclus comme un marqueur de mobilité supplémentaire. - Exécutez le gel pendant 2 h à 25 mA.
- Arrêter le gel et retirer de l’appareil.
- Rupture conserver entre les deux plaques de verre et retirez-les d'entre les plaques de verre, avec le gel restant sur la plaque de « fond ».
Remarque : prenez soin de ne pas pour déchirer le gel au cours de cette étape. - Appliquer une couche de plastique sur le gel et exposer sur un écran phosphorescent pendant 3 h, alternativement, placer le gel sur papier pour chromatographie et sécher avec un sèche-cheveux avant l’exposition au phosphore écran de gel.
- Image écran de phosphore sur un imageur de phosphore.
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Representative Results
Mod5 est incubé avec une tyrosine ARNt ou sérine ARNt en présence ou en absence de DMAPP. Suite à la réaction de la modification, produits ont été digérés RNase T1, qui s’attache à l’extrémité 3' de tous les guanosines laissant un 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (Figure 1). La digestion complète du RNAs produit un schéma prévisible des fragments radioactifs (Figure 2A), qui sont alors résolu sur un 20 % de polyacrylamide gel la dénaturation. Le transfert d’un groupe d’isopentenyl de DMAPP à l’ARN provoque un déplacement de mobilité du fragment contenant le résidu modifié (Figure 1).
Ce protocole détecte avec fiabilité isopentenylation des résidus de tRNA canonique et non canoniques modifié par Mod524. Par exemple, Mod5 est censé pour modifier un sous-ensemble des ARNt, qui contiennent le décrit précédemment AAA36-38 séquence exigence10, y compris la tyrosine tRNA et sérine ARNt utilisé dans cette étude. Mod5 modifie les résidus prédits en présence de DMAPP comme l’indique le 10 décalé nt AAA de36-38 contenant le fragment de la tyrosine ARNt (Figure 2B). De même, lorsque la sérine tRNA est incubé avec Mod5 et DMAPP, un changement complet des 10 nt AAA de36-38 contenant le fragment est observée (Figure 2C). Fait intéressant, un déplacement partiel d’un fragment de nt 7 est observé qui ne contient pas le AAA36-38 (Figure 2C). Ces données suggèrent que la séquence de36-38 AAA et la structure ne sont pas nécessaires pour Mod5 in vitro l’activité ; Cependant, les études à venir à l’aide d’autres méthodes ou LC-MS/MS sont nécessaires pour confirmer la nature chimique exacte de la modification.
Figure 1 : Illustration du dosage d’isopentényl transférase. ARNt, marquées en interne avec 32P-adeonsine, est montré incubé avec S. cerevisiae tRNA isopentényl transférase (Mod5) et ATP avec ou sans DMAPP. Postes A36-A38 sont indiqués, adjacente à la région de l’anticodon. Astérisques rouges représentent les nucléotides radioactifs. Après incubation, RNAs sont digérés par la RNase T1, extraite et traduites par dénaturation-PAGE de 20 %. Le transfert d’un groupe d’isopentenyl de DMAPP à l’ARNt est indiqué par un bandeau retardé pendant l’électrophorèse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : RNase T1 digestion carte et représentant les résultats d’un test d’isopentényl transférase. (A) noirs triangles représentent des sites de clivage RNase T1 et lignes noires au-dessus les triangles représentent des fragments obtenus qui contiennent au moins un 32P-étiqueté l’adénosine. Les résidus en surbrillance grises sont j’ai prédit6A sites de modification (c.-à-d., A37). (B) tRNA de tyrosine et (C) sérine les ARNt ont été marquées en interne avec 32P-adénosine. La S. cerevisiae isopentényl transférase, Mod5, est incubée avec chaque ARN en présence ou en absence de DMAPP. RNAs étaient ensuite digéré par la RNase T1 et résolu sur la dénaturation-PAGE. Dépendants DMAPP décalés bandes indiquent la présence d’un résidu de RNA modifié. Le site de modification prévus, A37, est souligné, et mis à jour le A37 résidus sont marqués d’un astérisque. Un site de modification imprévue et roman est identifié et indiqué comme « j’ai6A ? ». Ce chiffre a été modifié par lecture et al. 24 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Modifications de RNA continuent de figurer à jouer un rôle toujours plus important et diversifié dans la fonction cellulaire et organismique. Ainsi, le développement des tests d’interroger RNA modification des enzymes est central pour mieux comprendre les aspects fondamentaux de la biologie. Ce protocole décrit une analyse haute résolution in vitro afin de caractériser l’activité de modification tRNA de Mod5.
Ce protocole a l’avantage d’offrir une lecture directe et facilement interprétable d’isopentenylation. Le protocole décrit permettant la caractérisation biochimique robuste d’isopentényl transférase. En outre, ce système peut être utilisé avec des variantes de l’enzyme ou substrats RNA, permettant la détermination directe de rôles ayant des résidus spécifiques ou des domaines sur la modification de la modification. Pour obtenir une plus grande résolution, ce protocole pourrait être facilement adapté pour inclure les digestions parallèles avec autres ribonucléases, comme RNase P1 et/ou de la RNase A, qui clivent tous les quatre nucléotides ou C et U, respectivement.
Une limitation de ce test est qu’il est relativement faible débit et donc moins ARN qui peut être analysées pratiquement par rapport à la RNA-séquençage et spectrométrie de masse s’approche34. Par conséquent, il est déconseillé d’à utiliser ce protocole pour ceux qui visent à identifier les sites transcriptome-échelle de RNA modification. Ce protocole est très utile aux chercheurs qui s’intéressent à examiner un ARN spécifique Modification enzymatique avec ARN particulier d’intérêt. Toutefois, plusieurs méthodologies large transcriptome, utilisés pour identifier les modifications de RNA exigent covalente addition d’un groupe fonctionnel à un nucléotide modifié. Cette méthode fournit un dosage efficace et bon marché, où on pouvait tester les protocoles de modification sur un substrat individuel pour optimiser la modification chimique avant de s’engager à un effort à l’échelle du transcriptome40. Bien que ce protocole prévoit un essai simple et direct pour détecter l’activité isopentényl transférase, telle qu’elle est décrite ici, seulement le pourcentage modifié du fragment RNA total peut être calculé et comparé entre les groupes. Les chercheurs intéressés à comparaisons quantitative enzyme activité doivent en premier lieu calculer les unités d’activité par la concentration de l’enzyme.
Succès de cette méthode s’appuie fortement sur quelques étapes cruciales. Il est important que l’intégrité de l’ARN d’intérêt est confirmée avant l’isopentenylation. Dégradation de l’échantillon de RNA avant dosage isopentényl transférase pourrait avoir un effet significatif sur la modification de RNA et confondre l’interprétation des données. En outre, cette dégradation est difficile à détecter après que la digestion de la RNase T1 a eu lieu. Par conséquent, il est recommandé que RNA intégrité est vérifiée en dénaturant la PAGE. En outre, afin de parfaitement caractériser l’étendue de la modification de RNA, c’est indispensable pour assurer la digestion RNase T1 s’est poursuivie jusqu'à la fin. RNases supplémentaires, par exemple de la RNase P1 et/ou de la RNase A, peut servir à digérer RNAs en parallèle avec la RNase T1 pour augmenter la résolution de ce test. Oligonucléotide radioactif des échelles de longueur connue et séquence et des échantillons d’ARN non digérés peuvent servir à évaluer la digestion. Enfin, pour certains enzymes, la spécificité de modification dépend de l’ARN dans l’état plié « correctement ». Alors que la plupart ARNt synthétisées in vitro pli en structures ressemblant à leur structure en vivo , c’est moins sûr pour les autres classes d’ARN, notamment avec l’ARN plus long41.
Bien que le protocole décrit est spécifique à Mod5 isopentenylation des ARNt, cette méthode pourrait être facilement adaptée pour caractériser d’autres enzymes de modification des RNA qui ajoutent de façon covalente un groupe caractéristique chimique qui modifie sensiblement le poids moléculaire ou le gel de la mobilité des l’ARN.
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Disclosures
Aucune à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr. David Engelke pour ses conseils et commentaires utiles sur ce manuscrit. PJS - des fonds de démarrage de laboratoire de Ball State University ; DAB - accorder 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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