Summary
ここで、Mod5、酵母 RNA 修飾酵素の生化学的解析のためのプロトコルを記述し、このプロトコル可能性があります他の RNA 修飾酵素に適用する方法について説明。
Abstract
N6- isopentenyladenosine RNA 変更、機能的多様性と原核生物と真核生物の間で非常に節約されました。最も非常に節約された N6- isopentenyladenosine 変更の 1 つは、Trna のサブセットの A37 位置に発生します。この変更は、tRNA のリボソームの親和性を高めることによって翻訳の効率と忠実度を向上します。真核生物でこの変更に関わる酵素の突然変異は、ミトコンドリア機能障害やがんなどいくつかの病気の状態に関連付けられます。したがって、基質特異性とこれらの酵素の生化学的活性について常態と病態の真核生物の生物学の理解のために重要です。方法の多様な配列は、私6A の変更の特性評価に採用されています。ここは Mod5 によって isopentenylation の検出のための直接的なアプローチを説明します。このメソッドは、組換えイソペンテニル トランスフェラーゼ、続いて RNase T1 消化と私に6A の変更を検出する 1 二次元のゲルの電気泳動分析と Rna の孵化を利用しています。さらに、他の RNA 修飾酵素を特徴付けるこのプロトコルの潜在的な適応性を説明します。
Introduction
Rna に、コンテキストに依存する多様な機能、直接 RNA の構造に影響を与える、他の RNA の相互作用に影響を与えるこれらの変更で少なくとも 163 異なる転写後の RNA の修正も確認されています。分子1,2。番号とさまざまな RNA 編集のための感謝が増えると、RNA 修飾とそれらを触媒する酵素の両方を問い合わせること確実に試金の開発が急務です。
識別される最初の RNA 修飾の一つは、基本 37 Trna、3' 側3,4反のコドンに隣接してに発生します。イソペンテニル グループ dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) からアデノシン 37 の N6 位置に転送されます (私6A37) 3,5細胞質とミトコンドリア Trna のサブセット。私6A37 翻訳忠実度を向上させるし、6リボソーム4,6と私の tRNA の親和性を高めることによって効率 A37 細菌7のストレス反応にとって重要です。この変更を行う酵素 tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼと呼ばれている、非常に高い真核生物13、植物12ワーム11菌10細菌8,9で保存、人間14を含みます。
ヒト tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼの遺伝子、 TRIT1、突然変異は人間の病気と関連付けられます。たとえば、 TRIT1の突然変異ミトコンドリアのタンパク質合成15,16の欠陥によって引き起こされる可能性が高い重大なミトコンドリア病と相関しています。さらに、 TRIT1は腫瘍のサプレッサー遺伝子17,18として記載されている、癌悪性黒色腫19、乳房20、胃21、肺癌22 などのいくつかの種類に関与しています。 ,23。最後に、TRIT1 と Mod5 (酵母) イソペンテニル トランスフェラーゼ、集計しやすいタンパク質プリオンのようなアミロイド繊維24,25,26を形成します。これの直接的な証拠は示されていないが、これらの観察は潜在的神経変性疾患における tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼを巻き込みます。
イソペンテニル トランスフェラーゼ活性の翻訳と病気、私に6を直接測る方法イソペンテニル トランスフェラーゼが果たす役割を考えるこれらの通常の下で酵素と病気の状態の機械論的理解のために重要であります。私に肯定的な交配の in vitro isopentenylation アッセイを含む6A RNA 改変を検出するメソッド数の増加があります私の不在で6(PHA6) を試金、薄層クロマトグラフィー (TLC)、アミノ酸受け入れ活性測定法および質量分析法によるアプローチ (Ref. 4レビュー)。
14C DMAPP とラベルの Trna を利用した isopentenylationの in vitroアッセイが記載されています。このアッセイで、放射性炭素がイソペンテニル トランスフェラーゼでは14C DMAPP から RNA に転送されます。この試金は高感度が、しばしば特定の残基を変更9,20,27を判断することは困難です。PHA6 試金、かさばるに頼る私6A の変更変更後の残渣をまたがる32P 標識プローブの交配を妨げること。ですから、交配は私の不在で大きい6修正18,28,29。PHA6 試金は非常に敏感な細胞溶解液から抽出されたトータル RNA を分析する能力が。さらに、関心の RNA に固有のプローブの設計機能柔軟性をこのメソッド実質的なターゲット。ただし、PHA6 の試金はプローブの対象地域内の残留発生、新規修飾部位を特定しにくいため変更の評価に限定されます。また、バインディングの有無の変更を示すものとして他の変更または RNA 結合に影響を与える突然変異にデータ分析が混同されます。
別のアプローチは、tRNA30で6A 変更私の読み出しとしてアミノ酸受入れ活動とベンジル DEAE セルロース (BD) セルロース クロマトグラフィーを組み合わせたものです。この方法は、関数を直接試金 i の6A の変更、しかし、それは私に6A の変更を検出する間接アプローチと RNA の特定の残基への変更をマップする解像度が不足します。TLC のアプローチは、合計 tRNA を検出する使用されています私6A の変更。このアプローチで単一ヌクレオチドに32P 標識 Trna を消化する内部的、二次元 TLC 分析は、isopentenylation を識別するために使用されます。このアプローチは非常に敏感な検出、私に与えられた RNA サンプル6A を合計が、消化時にシーケンスのすべての情報が失われます。したがって、調査官はどの残基が変更された31をされているを確認する方法はありません。
最近では、液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析法 (MS/LCMS) 方法開発されている定量的に比較する種、細胞の種類、および実験条件32,33、間の総 RNA の修正 34。この方法の制限が少ない派生した34の id と変更されたヌクレオシドがいたから RNA 内の位置を決定することができます。さらに、専門知識とこれらの実験を実行するために必要な機器は、このアプローチの実用性を制限します。
さらに、RNA の変更トランスクリプトーム34をマップするいくつかの次世代シーケンシング技術をしました。特定の変更 (RIP Seq) に特異抗体を免疫沈降の Rna は、特定の変更35,36を含むすべてのシーケンスを識別するために調査官を有効にします。さらに、化学 Seq など非ランダムな不一致シーケンス逆転写酵素ベースのアプローチは変更された残37,38,39逆転写反応の摂動に依存します。RNA トランスクリプトームの変更をマップするこれらの技術の利点にもかかわらず RIP seq とケム Seq 技術は信頼性の高い抗体の反応性化学物質ごとの特定の変更は、それぞれ34の不足によって制限されます。また、逆転写酵素の酵素化学 Seq を実行する、非ランダムな不一致の配列解析技術は、安定した RNA の構造によって妨げられることができます。Trna の非常に変更された、構造的に安定した性質は、それらがこれらの技術を使用して調査する特に困難にします。までに、次世代シーケンス技術は私に6の変更34をマップにまだ活用されていません。
ここで、私に6A tRNA 変更体外を検出する単純で直接的アプローチについて述べる.このメソッドは、Rna 組換え酵母イソペンテニル トランスフェラーゼ (Mod5) と続いて、RNase T1 消化と 1 二次元のゲルの電気泳動分析私の6A の変更をマップするを利用しています。この方法は直接、データの分析に少し専門知識が必要です。さらに、このメソッドは修正の酵素、RNA またはゲルによる RNA のモビリティの分子量を変更する共有結合酵素を含む他の RNA に適応されます。
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Protocol
注: プロトコルは、Ref. 24から適応されました。
1. 関心の酵素と RNA を取得します。
- 使用の in vitro転写 Rna 内部で32P でラベルしてエシェリヒア属大腸菌、前述した24から精製組換え His6 Mod5 で表現。
- 紹介の in vitro転写 Rna (セクション 3) ラベル ATP、UTP、CTP、GTP、10 µCi ゲル精製、エタノール沈殿 α ATP の存在下で T7 RNA ポリメラーゼを用いた 1 x テ (10 mM トリス塩酸 pH 7.5、0.1 ミリメートルの EDTA) で再停止され、 -80 ° C で保存24。
- また、市販の蛍光に分類された Rna の関心を取得します。任意の最寄り式システムに関心の液を生成します。
注意: 酵素による RNA の構造と認識は RNA の蛍光タグの内部には変更できます。
2. ゲルを変性剤濃度 20% ポリアクリルアミドゲルを準備します。
注: RNA のフラグメントのための十分な解像度を得るために 40 cm の長さの垂直平板ゲルお勧めします。使用ゲルの幅は、分析するサンプルの数によって決まります。
- ガラス板を徹底的に掃除します。まず、石鹸と水で洗って、脱イオン水でよくすすぎ、イソプロパノールと糸くずのおしりふき、最後にきれい。
- 板・ スペーサーを組み立てます。
- 20% アクリルアミド、7.5 M 尿素、1 x TBE ゲル 100 mL 以下の試薬を混ぜて: 尿素ゲル 80 mL 集中 (237.5 グラム/L のアクリルアミドのメチレン bisacrylamide 12.5 g/L、脱イオン水で 7.5 M 尿素)、尿素ゲル希釈液 10 mL (7.5M 脱イオン水に尿素)、と 10 mL の尿素ゲル バッファー (0.89 M トリス-ホウ酸塩-20 mM EDTA バッファー pH 8.3、7.5 M 尿素)。
注意: ゲル溶液の量は、ゲルのサイズに従って調整する必要があります。 - N、N、n ′、n ′-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)、作りたて 10% アンモニア過硫酸 (APS) の 800 μ L の 40 μ L を追加します。
- 大きな注射器をゲル溶液を作成し、ガラス板を分配します。中に注いで泡形成を防ぐために指でガラスをタップします。
- 30 分間固化するゲルを許可します。
- バインダー クリップを使って垂直ゲル装置に固化したゲルをクランプします。
- 1 で上限と下限のバッファーの部屋をいっぱい x TBE。
- ゲルをロードする前に 2 時間事前実行ゲル 20 mA、2 h バッファーの境界 - 最小のオリゴヌクレオチドを追い越すようにそうでなければ最小のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド崩れがちバッファー フロント。
3. RNA Isopentenylation アッセイ
- 17 μ L の最終巻で反応を準備内部で32P 標識 RNA、5.3 μ M の 58 mM トリス塩酸 (pH 7.2) 1.2 mM ATP、5.8 mM MgCl2、0.2 mM 10 U の RNase 阻害剤 (例えばSuperRNaseIn)、DMAPP 40,000 CPM を含む Mod5、1.2 mm 2-メルカプトエタノール。
- 1 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。
- エタノール沈殿 Rna 1 時間または一晩 100% エタノールと 3.5 M ナトリウム酢酸 pH 5.5、および-20 ° C で場所の 1/10 ボリューム (1.7 μ L) の 2.5 倍量 (42.5 μ L) を使用します。
- 15,400 x g と 4 ° C で 20 分のための RNA のサンプルを遠心分離します。
- 慎重に上澄みを除去し、70% エタノール 500 μ L の RNA 餌を洗浄します。
- 5 分 15,400 x g と 4 ° C で遠心分離機サンプル
- 上澄みと風乾の RNA ペレット、15 分間またはすべてエタノールが蒸発するまでを慎重に取り外します。
- 8 M 尿素の 10 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。
- RNase T1 の 150 U を追加し、37 ° C で一晩インキュベートします。
- バッファー (60% のグリセロール、0.1% キシレンシアノール) x 6 の 2 μ L を追加します。
- 実行前の 20% ポリアクリルアミド、7.5 M 尿素ゲル (プロトコルのセクション 2 を参照) の各 RNA サンプルの 10 μ L をロードします。
注: 標識 RNA サイズはしごは、追加移動マーカーとして含まれているかもしれません。 - 25 で 2 h のためのゲルを実行 mA。
- ゲルを停止し、装置から削除します。
- ブレークは、2 枚のガラス板との間のシール、「底」プレートに残ったゲルをガラス板の 1 つを削除します。
注: この手順中にゲルを破らないように注意してください。 - ゲルをプラスチック製のラップの層を配置、または 3 h の蛍光体スクリーンで公開、ジェルを濾紙とゲルの蛍光体スクリーン露出前にドライヤーで乾燥します。
- 蛍光イメージャのイメージの蛍光体スクリーン。
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Representative Results
Mod5 は、チロシンと培養された tRNA またはセリン DMAPP の有無で tRNA。以下の改質反応製品であった RNase T1 消化 3' グアノシン monophosphates (GMP)24 (図 1) を残してすべての guanosines の 3' 末端を切断します。Rna の完全消化は、ゲルの変化 20% ポリアクリルアミドゲルに解決されます radiolabeled フラグメント (図 2A) の予測可能なパターンを生成します。DMAPP から RNA へイソペンテニル グループの転送変更された残渣 (図 1) を含むフラグメントの移動性シフトが発生します。
このプロトコルは、Mod524によって変更された正規と非正規の tRNA の残基の isopentenylation を確実に検出します。前述した AAA36 38シーケンス要件10チロシンを含むを含む Trna のサブセットを修正する Mod5 の予測など、tRNA がこの研究で使用される tRNA とセリン。Mod5 シフト 10 によって示される DMAPP 存在下で予測残基を変更する nt AAA36-38チロシンのフラグメントを含む tRNA (図 2B)。同様に、Mod5 DMAPP、10 の完全なシフトと tRNA をインキュベート セリン nt AAA36 38フラグメントを含む観察 (図 2C)。興味深いことに、AAA36 38 (図 2C) を含まない 7 nt フラグメントの部分的な変化が観察されます。示唆された AAA36 38シーケンスと構造が活動の in vitro Mod5 の必要ではありません。ただし、クロマトグラフィー-タンデム質量またはその他の方法を使用して将来の研究は、変更の正確な化学的性質を確認する必要があります。
図 1: イソペンテニル トランスフェラーゼ アッセイのイラスト。内部で32P-adeonsine の付いた tRNA が培養酵母tRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ (Mod5) と ATP DMAPP 有無にかかわらず表示されます。位置 A36 A38 はアンチコドン地域に隣接して表示されます。赤いアスタリスクを表す標識ヌクレオチド。次の孵化、Rna が RNase T1 と消化し、展開 20% 変化ページで解決。TRNA に DMAPP からイソペンテニル グループの転送は、電気泳動の間に遅らせられたバンドによって示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: イソペンテニル トランスフェラーゼ アッセイの RNase T1 消化マップと代表結果。(A) 黒の三角形は RNase T1 胸の谷間サイトを表し、三角形の上の黒い線は32P 標識アデノシンの少なくとも 1 つを含む結果のフラグメントをします。灰色の強調表示されている残基は私に6A 修飾部位 (すなわちA37) を予測しました。(TRNA チロシン B) と (C) セリン、tRNA 内部で32P アデノシンで付けられました。出芽酵母イソペンテニル トランスフェラーゼ、Mod5、各 RNA と培養された DMAPP の有無。Rna、RNase T1 と消化され変性ページで解決。シフト バンド DMAPP に依存しては、変更された RNA の残基の存在を示します。A37、予測修正サイトに下線し、変更された A37 残基は、アスタリスクで示されます。予期しないと新規変更サイトを識別し、として示された「私6?」。この図は、読み取りらから変更されています。24権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
RNA 修飾は、細胞・個体機能のこれまで以上に重要かつ多様な役割を果たすことに表示し続けます。など、RNA 修飾酵素を尋問するアッセイの開発は生物学の基本的な側面を理解するより良い中心です。このプロトコルでは、高解像度の in vitroアッセイで Mod5 の tRNA の修正活動の特性について説明します。
このプロトコルには、isopentenylation の直接と簡単に解釈できる読み出しを提供する明確な利点があります。説明されたプロトコルはイソペンテニル トランスフェラーゼの堅牢な生化学的解析のためことができます。さらに、このシステムは酵素のバリエーションに使用することができます。 または修飾 RNA 基板上、変更、特定の残基またはドメイン ロールの直接定量を可能にします。でもより高い解像度を得るためには、このプロトコルは RNase P1 や RNase A などの他の RNases とすべての 4 つのヌクレオチド、C, U, をそれぞれ切断する並列の消化力を含むように合わせることが容易にできます。
この試金の制限は比較的低スループットだしたがって実質的に分析することができる少数の Rna が RNA シーケンスと比較して、質量分析アプローチ34。したがって、このプロトコルが RNA トランスクリプトーム変更サイトを識別するために目指す人に使用することはお勧めできません。このプロトコルは興味の特定の Rna と酵素を変更する特定の RNA を調べることに興味を持っている研究者に最適です。ただし、RNA の変更を識別するために使用多くのトランスクリプトーム広い手法変更されたヌクレオチドに化学部の共有結合の付加が必要です。このメソッドは、1 つがトランスクリプトーム努力40へ託す前に化学修飾を最適化する個々 の基板上の修正のプロトコルをテストすることが安価で効率的な分析を提供します。このプロトコルは、ここで前述のイソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する簡単な直接アッセイを提供します、総 RNA フラグメントの変更 % だけは計算およびグループ間で比較できます。定量的酵素活性比較することに興味がある研究者は、活性酵素の濃度の単位を計算する必要が最初。
このメソッドの成功は、いくつかの重要なステップを多用します。Isopentenylation 前に関心の RNA の整合性を確認することが重要です。イソペンテニル トランスフェラーゼ アッセイの前に RNA サンプルの分解が RNA の修飾に重要な影響を及ぼすでき、データの解釈を混同します。さらに、このような劣化は、RNase T1 消化後に検出することは困難です。したがって、ページの変化によって RNA の整合性がチェックされていることをお勧めします。さらに、完全かつ正確には、RNA の修飾の範囲を特徴付ける、それは RNase T1 消化が完了するまで行われたことを確認することが欠かせません。このアッセイの解像度を上げる RNase P1 や RNase A などの追加 RNases RNase T1 と並行してダイジェスト Rna に使えます。知られている長さおよびシーケンスと未消化の RNA のサンプルの radiolabeled オリゴヌクレオチドはしごは、消化力を評価するために使用できます。最後に、いくつかの酵素の修飾の特異性は、「正しく」折り畳まれた状態にある RNA に依存します。倍 Trna 合成体外にほとんど構造体内の構造体に似ている、これはより長い Rna41特に Rna が、他のクラスの特定。
説明されたプロトコルは、Trna の Mod5 isopentenylation に固有ですが、このメソッドは分子量またはゲルの移動性を大幅変更する化学構造を追加したその他の RNA 修飾酵素の特徴を簡単に合わせることができます。RNA。
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Disclosures
なしに開示します。
Acknowledgments
我々 は彼の指導と有用なコメントがこの原稿のため博士デイヴィッド Engelke を感謝したいです。PJS - ボール州立大学研究所スタートアップ資金;軽打 - 1R15AI130950-01 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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