Summary
Aquí, describimos un protocolo para la caracterización bioquímica de la enzima de modificación de RNA de la levadura, Mod5 y discutir cómo este protocolo podría aplicarse a otras enzimas de modificación de RNA.
Abstract
N6- isopentenyladenosine RNA modificaciones son funcionalmente diverso y altamente conservado entre procariotas y eucariotas. Una de las más altamente conservado N6- isopentenyladenosine modificaciones se produce en la posición de A37 en un subconjunto de tRNAs. Esta modificación mejora la eficiencia de la traducción y fidelidad mediante el aumento de la afinidad de los tRNA por el ribosoma. Mutación de las enzimas responsables de esta modificación en eucariotas están asociados con varios Estados de enfermedad, incluyendo cáncer y la disfunción mitocondrial. Por lo tanto, comprender la especificidad de sustrato y las actividades bioquímicas de estas enzimas es importante para la comprensión de la biología de eucariota normal y patológica. Una gran variedad de métodos se ha empleado para caracterizar i6A modificaciones. Es en este documento se describe un enfoque directo para la detección de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante isopentenyl transferasa, seguida por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel 1-dimensional detectar modificaciones6A. Además, se discute la adaptabilidad potencial de este protocolo para caracterizar otras enzimas de modificación de RNA.
Introduction
Se han identificado al menos 163 distinta modificación postranscripcional de RNA, con estas modificaciones confieren funciones diversas y contextual para RNAs directamente influir en la estructura del RNA y que afectan a las interacciones de RNA con otros las moléculas1,2. A medida que aumenta la apreciación de la cantidad y variedad de modificaciones de RNA, es fundamental para desarrollar ensayos que pueden interrogar confiablemente las modificaciones del RNA y las enzimas que catalizan los.
Una de las primeras modificaciones de RNA para identificarse se produce en 37 base en tRNAs, adyacente al anti-codon en el 3' parte3,4. Un grupo de isopentenyl se transfiere del dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) en la posición N6 de la adenosina 37 (me6A37) 3,5 en un subconjunto de tRNAs citoplásmica y mitocondrial. i6A37 mejora la fidelidad de la traducción y eficiencia aumentando la afinidad del ARNt por el ribosoma4,6 y yo6A37 es importante para la respuesta de estrés en las bacterias7. Las enzimas que realizan esta modificación se denominan transferasas de isopentenyl tRNA y están muy conservadas en bacterias8,9, hongos10, gusanos11, plantas12y eucariotas superiores13 , incluyendo los seres humanos14.
Las mutaciones en el gene humano de tRNA isopentenyl transferasa, TRIT1, están asociadas con enfermedad humana. Por ejemplo, una mutación en el TRIT1 se correlaciona con una severa enfermedad mitocondrial, probablemente causada por un defecto en la síntesis de proteínas mitocondriales15,16. Además, TRIT1 ha sido descrito como un tumor supresor genes17,18 y está implicada en varios tipos de cáncer incluyendo melanoma19, mama20, gástrico21y cánceres de pulmón22 ,23. Finalmente, TRIT1 y Mod5 transferasas de isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) son propensas a la agregación de proteínas que forman las fibras de amiloide-como prión24,25,26. Estas observaciones implican potencialmente transferasas de isopentenyl tRNA en enfermedades neurodegenerativas, aunque todavía no se ha demostrado evidencia directa para esto.
Dado el papel que isopentenyl transferasas en traducción y la enfermedad, métodos que directamente me miden6una actividad de transferasa de isopentenyl son importantes para una comprensión mecanicista de estas enzimas bajo normal y Estados de la enfermedad. Un número creciente de métodos está disponible para detectar modificaciones de una RNA6, incluyendo en vitro isopentenylation ensayos, hibridación positivo en ausencia de6ensayos (PHA6), delgada cromatografía (TLC), aminoácido ensayos de actividad de aceptación y métodos de espectrometría de masas (revisado en Ref. 4).
Un ensayo de isopentenylation en vitro se ha descrito que utiliza 14C-DMAPP y tRNAs sin etiqueta. En este ensayo, carbono radiactivo se transfiere al ARN de 14C-DMAPP por la transferasa de isopentenyl. Mientras que este ensayo es altamente sensible, a menudo es difícil determinar el residuo concreto que es modificada9,20,27. PHA6 ensayos dependen de la voluminosa me modificación6A interferir con la hibridación de una sonda marcada con P 32, que abarca el residuo modificado. Como tal, la hibridación es mayor en la ausencia de una i6una modificación18,28,29. PHA6 ensayos son muy sensibles y capaces de análisis de ARN total extraído de Lisados celulares. Además, la habilidad de diseñar sondas específicas de RNA de interés ofrece esta flexibilidad de método objetivo sustancial. Sin embargo, ensayos de PHA6 se limitan a la caracterización de las modificaciones que se producen en los residuos dentro de la región específica de la sonda y por lo tanto son menos propensos a identificar sitios de modificación novedosa. Además, como falta de Unión es indicativa de la modificación, otras modificaciones o mutaciones que afectan la Unión de la RNA se confundir análisis de datos.
Otro enfoque combina cromatografía de celulosa bencílico DEAE celulosa (BD) con actividad de aceptación de aminoácidos como una lectura de lo6A modificaciones en el tRNA30. Este enfoque ensayos directamente la función de la i modificación de6A, pero es una aproximación indirecta a detectar i6A modificación y carece de resolución para mapear modificaciones a un residuo específico en el ARN. Un enfoque del TLC se ha utilizado para detectar total tRNA i6A modificaciones. En este enfoque, internamente 32tRNAs P etiquetados son digeridos a nucleótidos individuales y análisis TLC bidimensional se utilizan para identificar el isopentenylation. Este enfoque es altamente sensible en la detección de i total6A en una muestra determinada de RNA pero sobre digestión, toda la información de secuencia se pierde; así, el investigador no tiene forma de determinar que los residuos han sido modificados31.
Más recientemente, se han desarrollado métodos líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que comparar cuantitativamente la total modificación de RNA entre especies, tipos celulares y condiciones experimentales32,33, 34. Una limitación de esta metodología es que es menos capaz de determinar la identidad y posición en el ARN que los nucleósidos modificados fue derivan34. Además, la experiencia y el equipo necesario para ejecutar estos experimentos limitan la utilidad de este enfoque.
Además, se han desarrollado varias tecnologías de secuenciación de próxima generación para RNA modificaciones todo el transcriptoma34. Inmunoprecipitación de RNAs con anticuerpos específicos a una modificación especial (RIP-Seq) permiten al investigador a identificar todas las secuencias que contiene una modificación específica35,36. Además, enfoques basados en la transcriptasa reversa como Chem-Seq y secuencia del desajuste no aleatoria se basan en las perturbaciones de la reacción de transcripción inversa en los residuos modificados37,38,39. A pesar de la ventaja de estas técnicas para asignar todo el RNA modificaciones transcriptoma, RIP-seq y Chem-Seq tecnologías están limitadas por la falta de anticuerpos confiables o disponible para cada modificación específica, respectivamente34reactivos químicos. Además, las enzimas transcriptasa reversa necesaria para realizar Chem-Seq y técnicas de secuenciación de desajuste no aleatoria pueden verse obstaculizadas por las estructuras de RNA estables. La naturaleza altamente modificada y estructuralmente estable de tRNAs hacen especialmente difíciles de interrogar utilizando estas técnicas. Hasta la fecha, tecnologías de secuenciación de próxima generación no se han utilizado todavía para mapa i6una modificaciones34.
Adjunto, describimos un enfoque simple y directo detectar6un tRNA modificaciones in vitro. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasa (Mod5), seguido por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel de 1 dimensión para mapa i6A modificaciones. Este enfoque es directo y requiere poco especializados para analizar los datos. Además, este método es adaptable a otros RNA modificación de enzimas, incluyendo enzimas que modifican covalentemente el peso molecular del ARN o movilidad de un RNA a través de un gel.
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Protocol
Nota: El protocolo fue adaptado de la ref. 24.
1. obtener el ARN y la enzima de interés
- Uso en vitro transcribe ARN marcado internamente con 32P y Mod5 de His6 recombinante expresada en y purificado de la e. coli, como se describió anteriormente24.
- Introducir en vitro transcritos RNAs (sección 3) utilizando T7 ARN polimerasa en presencia de ATP sin etiqueta, UTP, CTP, GTP y 10 μCi de gel purificado, precipitado etanol α-ATP, resuspendió en TE 1 x (pH de 10 mM Tris-HCl 7.5, 0.1 mM EDTA) y almacenados a-80 ° C 24.
- También puede obtener RNAs fluorescente etiquetados disponibles en el mercado de interés. Producir la enzyme(s) de interés en cualquier sistema de expresión preferido.
PRECAUCIÓN: Etiquetas fluorescentes internos en el ARN pueden alterar la estructura de RNA y reconocimiento por enzimas.
2. prepare una 20% de poliacrilamida desnaturalizantes Gel
Nota: Para obtener la suficiente resolución de fragmentos de ARN, se recomienda un gel de losa vertical de longitud 40 cm. El ancho del gel utilizado es determinado por el número de muestras a analizar.
- Limpie las placas de cristal. En primer lugar, lavar con agua y jabón, enjuagar con agua desionizada y finalmente limpiar con isopropanol y trapos sin pelusa.
- Montar las placas y los espaciadores.
- Mezclar los siguientes reactivos para hacer 100 mL de 20% de acrilamida, 7.5m de urea, 1 gel x TBE: 80 mL de gel de urea concentrado (237,5 g/L de acrilamida, 12.5 g/L de bisacrilamida de metileno, 7,5 M de urea en agua desionizada), 10 mL de diluyente de gel de urea (7.5M urea en agua desionizada) y 10 mL de tampón de gel de urea (0,89 M Tris-borato-20 mM EDTA buffer pH 8,3 y 7,5 M urea).
Nota: El volumen de la solución en gel debe ajustarse a las dimensiones del gel. - Agregar 40 μl de N, N, N′, Tetramethylethylenediamine N′ (TEMED) y 800 μl de persulfato de amonio 10% recién preparada (APS).
- Elaboración de la solución en gel en una jeringa grande y dispensar entre placas de vidrio. Grifo de cristal con los dedos mientras lo vierte para evitar formación de burbujas.
- Deje el gel solidificar por 30 minutos.
- Abrazadera de gel solidificado en gel vertical apparatus utilizando clips binder.
- Llenan cámaras de amortiguación superior e inferior de 1 x TBE.
- Dos horas antes de cargar el gel, ejecutar previamente el gel a 20 mA, por 2 h para permitir que el límite de búfer a correr más rápido que los más pequeños oligonucleótidos - lo contrario más pequeño nucleotides y oligonucleótidos tienden a colapsar en el frente del almacenador intermediario.
3. ARN Isopentenylation ensayo
- Preparar las reacciones en un volumen final de 17 μl, conteniendo 58 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 inhibidor de U de Rnasa (e.g., SuperRNaseIn), 40.000 CPM internamente 32ARN marcado con P, μm 5.3 Mod5 y 1,2 mM 2 - mercaptoetanol.
- Incubar a 37 ° C durante 1 hora las reacciones.
- Etanol-precipitado RNAs con 2,5 volúmenes (42.5 μl) de etanol al 100% y 1/10 volúmenes (1,7 μL) de 3,5 M sodio acetato pH 5.5 y a-20 ° C para 1 h o durante la noche.
- Centrifugar las muestras de RNA por 20 min a 15.400 x g a 4 ° C.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante y lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70% de RNA.
- Centrifugar muestras en 5 min 15.400 x g a 4° C.
- Retire con cuidado las pelotillas de RNA sobrenadante y secado al aire durante 15 minutos, o hasta que se evapore el etanol todos.
- Resuspender el pellet de RNA en 10 μl de 8 M de urea.
- Añadir 150 U de ARNasa T1 e incubar a 37 ° C durante la noche.
- Añadir 2 μl de 6 x buffer (glicerol al 60%, 0.1% xileno cyanol) del cargamento.
- Cargar 10 μl de cada muestra de RNA en una pre-carrera, 20% poliacrilamida, gel de urea de 7.5 M (véase la sección 2 del Protocolo).
Nota: Escalas de tamaño de RNA radiactiva pueden incluirse como un marcador de movilidad adicional. - Ejecutar gel por 2 h a 25 mA.
- Dejar el gel y retire del aparato.
- Entre las placas de dos vidrio y quitar una de las placas de vidrio, con gel en la placa "inferior".
Nota: tenga cuidado de no para rasgar el gel durante este paso. - Coloque una capa de envoltura de plástico sobre el gel y exponer en una pantalla de fósforo para 3 h. alternativamente, Coloque gel en cromatografía en papel y secar con un secador antes de la exposición de pantalla de fósforo de gel.
- Pantalla de fósforo de imagen en un sensor de fósforo.
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Representative Results
Mod5 fue incubado con una tirosina tRNA o serina tRNA en la presencia o ausencia de DMAPP. Tras la reacción de modificación, productos fueron digeridos ARNasa T1, que separa el extremo 3' de todos guanosines dejando una 3' guanosina (GMP) de Unión24 (figura 1). Digestión completa de los RNAs produce un patrón predecible de los fragmentos radiactivos (figura 2A), que luego se resolvió en una 20% de poliacrilamida desnaturalizantes gel. La transferencia de un grupo de isopentenyl de DMAPP del ARN produce un cambio de la movilidad del fragmento que contiene el residuo modificado (figura 1).
Este protocolo detecta confiablemente isopentenylation de residuos de tRNA canónico y no canónico modificado por Mod524. Por ejemplo, se predice Mod5 para modificar un subconjunto de tRNAs, que contienen la descrita AAA36-38 secuencia requerimiento10, incluyendo la tirosina tRNA y serina tRNA utilizado en este estudio. Mod5 modifica el residuo predicho en presencia de DMAPP está indicado por el desplazado 10 nt AAA36-38 que contiene el fragmento en la tirosina tRNA (figura 2B). Del mismo modo, cuando la serina tRNA se incuba con Mod5 y DMAPP, un cambio completo de los 10 nt AAA36-38 que contiene fragmento se observa (figura 2C). Curiosamente, un cambio parcial de un fragmento de nt 7 se observa que no contiene la AAA36-38 (figura 2C). Estos datos sugieren que la secuencia de36-38 AAA y estructura no son necesarios para Mod5 en vitro actividad; sin embargo, se requieren estudios futuros utilizando LC-MS/MS u otros métodos para confirmar la naturaleza química exacta de la modificación.
Figura 1 : Ilustración del ensayo de transferasa de isopentenyl. tRNA, internamente marcado con 32P-adeonsine, se muestra incubada con S. cerevisiae tRNA isopentenyl transferasa (Mod5) y ATP con o sin DMAPP. Posiciones A36-A38 se indican junto a la región del anticodón. Asteriscos rojos representan nucleótidos radiactivos. Tras incubación, RNAs son digeridos con ARNasa T1, extraídos y resuelto por desnaturalización-página de 20%. La transferencia de un grupo de isopentenyl de DMAPP para el tRNA está indicada por una banda de retrasados durante electroforesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : ARNasa T1 digestión mapa y representante de los resultados de un ensayo de transferasa de isopentenyl. (A) negros triángulos representan sitios de clivaje de ARNasa T1 y líneas negras por encima de los triángulos representan fragmentos resultantes que contienen al menos un 32P etiquetados adenosina. Son residuos resaltados gris me predijo6A sitios de modificación (es decir, A37). (B) tRNA tirosina y serina (C) tRNA internamente fueron etiquetadas con 32P-adenosina. La S. cerevisiae isopentenyl transferasa, Mod5, se incubó con cada ARN en la presencia o ausencia de DMAPP. Los RNAs fueron digeridos con ARNasa T1 y resueltos en la página de desnaturalización. Dependiente de DMAPP cambiados bandas indican la presencia de un residuo modificado de RNA. El sitio de la modificación prevista, A37, se subraya, y modificado A37 de residuos se indican con un asterisco. Un sitio de modificación imprevistas y novedosas es identificado y denominado "i6A?". Esta figura ha sido modificada de Lee et al. 24 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Modificaciones de RNA continúan ser demostrado que desempeñan un papel cada vez más importantes y diversas en función celular y organismo. Como tal, el desarrollo de ensayos para interrogar RNA enzimas modificadoras es central para comprender mejor los aspectos fundamentales de la biología. Este protocolo describe un análisis de alta resolución de vitro para caracterizar la actividad de modificación de tRNA de Mod5.
Este protocolo tiene la clara ventaja de proporcionar una lectura directa y fácilmente interpretable de isopentenylation. El protocolo descrito permite robusto caracterización bioquímica de isopentenyl transferasas. Además, este sistema puede usarse con variantes de la enzima o modifica substratos de RNA, que permite la determinación directa de papeles que residuos específicos o dominios en la modificación. Para obtener mayor resolución, este protocolo podría ser fácilmente adaptado para incluir digestiones paralelo con otras RNasas, como P1 Rnasa Rnasa A, que desdoblan los cuatro nucleótidos o C y U, respectivamente.
Una limitación de este ensayo es que es relativamente bajo rendimiento y por lo tanto menos RNAs que pueden analizarse prácticamente en comparación con secuenciación del RNA y espectrometría de masa acerca a34. Por lo tanto, no se recomienda que este protocolo se utiliza para aquellos que pretenden identificar RNA modificación sitios todo el transcriptoma. Este protocolo es útil a los investigadores que están interesados en el examen de un ARN específico modificación enzimática con RNAs particular de interés. Sin embargo, muchos transcriptoma amplia metodología para identificar modificaciones RNA requiere adición covalente de una molécula química a un nucleótido modificado. Este método proporciona un análisis eficiente y barato donde uno podría probar protocolos de modificación sobre un sustrato individual para optimizar la modificación química antes de comprometerse con un esfuerzo de todo el transcriptoma de40. Aunque este protocolo proporciona un análisis simple y directo para detectar actividad de transferasa de isopentenyl, como se describe aquí, sólo el porcentaje modificado del fragmento de RNA total puede ser calculado y comparado entre los grupos. Los investigadores interesados en la fabricación de enzima cuantitativa comparación de actividad primero deben calcular las unidades de actividad por la concentración de enzima.
Éxito de este método depende en gran medida de unos pocos pasos críticos. Es importante que la integridad del ARN de interés es confirmada antes de la isopentenylation. Degradación de la muestra de RNA antes del ensayo de transferasa de isopentenyl podría tener un efecto significativo en la modificación de RNA y confundir la interpretación de los datos. Además, esta degradación es difícil de detectar después de la digestión Rnasa T1. Por lo tanto, es aconsejable que integridad de RNA está marcada por desnaturalización de la página. Además, para totalmente y precisa caracterizar el grado de modificación de RNA, es esencial para asegurar la digestión Rnasa T1 ha procedido a completar. RNasas adicional, como P1 Rnasa Rnasa A, permite digerir RNAs en paralelo con ARNasa T1 para aumentar la resolución de este ensayo. Radiactiva oligonucleótido escaleras de longitud conocida y secuencia y sin digerir las muestras de RNA pueden utilizarse para evaluar la digestión. Por último, algunas enzimas, la especificidad de modificación depende el RNA en el estado "correctamente" doblado. Aunque mayoría tRNAs sintetizada en vitro veces en estructuras que se asemejan a su estructura en vivo , esto es menos seguro para otras clases de RNAs, particularmente con RNAs largo41.
Aunque el protocolo descrito es Mod5 isopentenylation de ARNt específico, este método podría ser muy fácilmente adaptable para caracterizar otras enzimas de modificación de RNA que añaden covalentemente un grupo químico que altera significativamente el peso molecular o la movilidad de gel de el RNA.
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Disclosures
Ninguno para revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Dr. David Engelke por su orientación y comentarios sobre este manuscrito. Pijamas - fondos de puesta en marcha de laboratorio de Ball State University; DAB - concesión 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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