Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização bioquímica de enzimas de RNA-modificando o fermento, Mod5 e discutir como este protocolo poderia ser aplicado a outras enzimas RNA-modificando.
Abstract
N6- isopentenyladenosine do RNA modificações é funcionalmente diversificada e altamente conservadas entre procariontes e eucariontes. Dentre as modificações de isopentenyladenosine -6N mais altamente conservadas ocorre na posição A37 em um subconjunto dos tRNAs. Esta modificação melhora a eficiência de conversão e fidelidade, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma. Mutação das enzimas responsáveis por essa modificação em eucariontes estão associados a vários Estados de doenças, incluindo câncer e disfunção mitocondrial. Portanto, compreender a especificidade de substrato e actividades bioquímicas destas enzimas é importante para a compreensão da biologia eucariótica normal e patológica. Um diversificado leque de métodos tem sido empregado para caracterizar eu6A modificações. Aqui é descrita uma abordagem direta para a detecção de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza a incubação de RNAs com uma transferase de isopentenilo recombinantes, seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional eu detectar6A modificações. Além disso, a potencial capacidade de adaptação do presente protocolo para caracterizar outras enzimas RNA-modificando é discutida.
Introduction
Foram identificadas pelo menos 163 modificações de RNA posttranscriptional distintas, com estas modificações conferem funções diversas e contexto-dependente de RNAs, directamente influenciam a estrutura do RNA e afetando interações de RNA com outros moléculas1,2. À medida que aumenta a apreciação para o número e variedade de modificações do RNA, é fundamental desenvolver ensaios que podem confiantemente interrogar tanto as modificações de RNA e as enzimas que catalisam a eles.
Dentre as modificações de RNA primeiras a identificação ocorre em 37 base em tRNAs, adjacente a anticódon no 3' lado3,4. Um grupo de isopentenilo é transferido de dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) para a posição N6 de adenosina 37 (eu6A37) 3,5 em um subconjunto dos tRNAs citoplasmática e mitocondrial. Eu6A37 melhora a fidelidade de tradução e eficiência, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma4,6 e eu6A37 é importante para a resposta ao estresse em bactérias7. As enzimas que realizam essa modificação são denominadas transferases de isopentenilo tRNA e são altamente conservadas em bactérias8,9, fungos10, vermes11, plantas12e uns eukaryotes13 , incluindo os seres humanos14.
Mutações do gene humano que o tRNA isopentenilo transferase, TRIT1, estão associadas a doenças humanas. Por exemplo, uma mutação no TRIT1 está correlacionada com uma grave doença mitocondrial, provavelmente causada por um defeito na síntese de proteína mitocondrial15,16. Além disso, TRIT1 tem sido descrito como um tumor supressor gene17,18 e está implicada em vários tipos de cânceres, incluindo o melanoma19, mama20, gástrico21e cânceres de pulmão22 ,23. Finalmente, TRIT1 e Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenilo transferases são propensas a agregação de proteínas que formam o prião-como fibras de amiloides24,25,26. Estas observações potencialmente implicam transferases de isopentenilo tRNA em doenças neurodegenerativas, embora a evidência direta para isso ainda não foi mostrada.
Tendo em conta o papel que isopentenilo transferases na tradução e na doença, métodos que diretamente eu medir6uma atividade de transferase de isopentenilo são importantes para uma compreensão mecanicista destas enzimas sob o normal e a Estados de doença. Um número crescente de métodos está disponível para detectar as modificações A RNA6, incluindo em vitro isopentenylation ensaios, hibridização positiva na ausência de i6ensaios de um (PHA6), fino cromatografia em camada delgada (TLC), aminoácido ensaios de atividade de aceitação e abordagens de espectrometria de massa (revisado em ref. 4).
Um ensaio de isopentenylation em vitro tem sido descrito que utiliza 14C-DMAPP e tRNAs sem rótulo. Neste ensaio, carbono radioactivo é transferido para RNA de 14C-DMAPP pelo transferase de isopentenilo. Enquanto este ensaio é altamente sensível, muitas vezes é difícil determinar o resíduo específico que é modificado9,20,27. PHA6 ensaios dependem o volumoso eu6A modificação interferindo com hibridação de uma sonda P-etiquetada 32, abrangendo os resíduos modificados. Como tal, a hibridação é maior na ausência de um i6uma modificação18,28,29. Ensaios de PHA6 são altamente sensíveis e capazes de analisar o RNA total extraído de lisado celular. Além disso, a capacidade de projetar sondas específicas para o RNA de interesse dá essa flexibilidade de alvo substancial do método. No entanto, PHA6 ensaios são limitados para a caracterização das modificações que ocorrem na resíduos dentro da região de destino da sonda e, portanto, são menos propensos a identificar sites novel modificação. Além disso, como ausência de vinculação é indicativa de modificação, outras modificações ou mutações que afetam a ligação de RNA vão confundir a análise dos dados.
Outra abordagem combina cromatografia de celulose benzílico DEAE celulose (BD) com atividade de aceitação de aminoácidos como uma leitura de i6A modificações no tRNA30. Esta abordagem ensaios diretamente a função do i6A modificação, mas isso é uma abordagem indireta para eu detectar6A modificação e carece de resolução para mapear as modificações de um resíduo específico no ARN. Uma abordagem de TLC tem sido usada para detectar tRNA total eu6A modificações. Nesta abordagem, internamente 32P-rotulado os tRNAs são digeridos de nucleotídeos simples e análise bidimensional do TLC é usado para identificar o isopentenylation. Esta abordagem é altamente sensível na detecção de eu total6A uma determinada amostra de RNA, mas após a digestão, todas as informações de sequência serão perdidas; assim, o investigador não tem meios de determinar quais resíduos foram modificados31.
Mais recentemente, líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) foram desenvolvidos métodos que comparar quantitativamente modificações de RNA totais entre espécies, tipos de células e condições experimentais32,33, 34. Uma limitação desta metodologia é que é menos capaz de determinar a identidade e a posição dentro do RNA do qual os nucleosídeos modificados foi derivada34. Além disso, os conhecimentos e equipamentos necessários à execução dessas experiências limitam a praticabilidade desta abordagem.
Além disso, desenvolveram-se várias tecnologias de sequenciamento de nova geração para mapear RNA modificações transcriptome nível34. Imunoprecipitação de RNAs com anticorpos específicos para uma determinada modificação (RIP-Seq) permitem que o investigador identificar todas as sequências contendo uma modificação específica35,36. Além disso, abordagens de transcriptase reversa como Chem-Seq e sequenciamento de incompatibilidade não-aleatória dependem de perturbações da reação de transcrição reversa nos resíduos modificados37,38,39. Apesar da vantagem destas técnicas para mapear todo o transcriptoma RNA modificações, RIP-seq e Chem-Seq tecnologias são limitadas pela falta de confiança anticorpos ou Reactivos químicos disponíveis para cada alteração específica, respectivamente,34. Além disso, as enzimas transcriptase reversa necessária para executar Chem-Seq e técnicas de sequenciamento de incompatibilidade não-aleatório podem ser impedidas por estruturas estáveis de RNA. A natureza altamente modificada e estruturalmente estável de tRNAs torná-los especialmente difícil para interrogar usando essas técnicas. Até à data, tecnologias de próxima geração baseadas em sequenciamento ainda não foram utilizadas para mapear eu6modificações34.
Aqui, descrevemos uma abordagem simples e direta para detectar6A tRNA modificações em vitro. Este método utiliza a incubação de RNAs com recombinante S. cerevisiae isopentenilo transferase (Mod5), seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional Mapear6A modificações. Esta abordagem é direta e requer pouco especializado para analisar os dados. Além disso, este método é adaptável a outro RNA modificando enzimas, incluindo enzimas que covalentemente mudam o peso molecular de RNA ou mobilidade de um RNA através de um gel.
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Protocol
Nota: O protocolo foi adaptado de ref. 24.
1. obter o RNA e a enzima de interesse
- Uso em vitro transcrito RNAs internamente rotulados com 32P, e His6-Mod5 recombinante expressa em e purificado de e. coli, como descrito anteriormente,24.
- Introduzir em vitro transcrito RNAs (seção 3) usando T7 RNA polimerase na presença de ATP sem rótulo, UTP, CTP, GTP e 10 µCi de gel-purificado, etanol-precipitado α-ATP, resuspended em 1 x TE (pH 7,5, 0,1 mM EDTA de 10 mM Tris-HCl) e armazenado a-80 ° C 24.
- Como alternativa, obter RNAs fluorescente etiquetadas comercialmente disponíveis de interesse. Produzir o enzyme(s) de interesse em qualquer sistema de expressão preferencial.
Cuidado: Etiquetas fluorescentes internas no ARN podem alterar estrutura do RNA e reconhecimento por enzimas.
2. prepare uma 20% de poliacrilamida desnaturação Gel
Nota: A fim de obter uma resolução suficiente de fragmentos de RNA, um gel de laje vertical de comprimento 40cm é recomendado. A largura do gel é determinada pelo número de amostras a analisar.
- Limpe as placas de vidro. Primeiro, lave com água e sabão, enxaguar bem com água desionizada e finalmente limpar com isopropanol e toalhetes de fiapos.
- Monte as placas e os espaçadores.
- Misture os seguintes reagentes para fazer 100 mL de 20% do acrilamido, 7,5 M de ureia, 1 gel de x TBE: 80 mL de gel de ureia concentrar (237,5 g/L de acrilamida, 12,5 g/L de metileno bisacrylamide, 7,5 M de ureia em água desionizada), 10 mL de diluente de gel de ureia (7.5M ureia em água desionizada) e 10 mL de tampão de gel de ureia (0,89 M Tris-borato-20 mM EDTA buffer pH 8.3 e 7,5 M ureia).
Nota: O volume de solução de gel deve ser ajustado de acordo com as dimensões de gel. - Adicione 40 µ l de N, N, n', n'-tempted (TEMED) e 800 µ l de persulfato de amônio 10% recentemente preparada (APS).
- Elaborar uma seringa grande solução de gel e dispensar entre placas de vidro. Toque no vidro com os dedos ao derramar para evitar a formação de bolhas.
- Permitir que o gel para solidificar durante 30 min.
- Pinça solidificado gel para gel de vertical aparelho usando grampos da pasta.
- Encher câmaras tampão superior e inferior com 1 x TBE.
- Duas horas antes de carregar o gel, pre-funcione o gel a 20 mA, para 2 h permitir que o limite de buffer de correr mais que os oligonucleotides menores - caso contrário a menor nucleotídeos e oligonucleotides tendem a entrar em colapso na parte da frente de reserva.
3. o RNA Isopentenylation ensaio
- Preparar as reações em um volume final de 17 µ l, contendo 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, inibidor de 10 U de RNase (por exemplo, SuperRNaseIn), 40.000 CPM de internamente 32P-etiquetados RNA, 5,3 µM Mod5 e 1,2 mM 2 - Mercaptoetanol.
- Incube as reações a 37 ° C por 1h.
- Etanol-precipitado RNAs usando 2,5 volumes (42,5 µ l) de 100% de etanol e 1/10 volumes (1,7 µ l) de 3,5 M de sódio acetato pH 5,5 e lugar a-20 ° C por 1 h ou durante a noite.
- Centrifugar as amostras de RNA por 20 min em 15.400 x g e 4 ° C.
- Cuidadosamente, remover o sobrenadante e lavar o sedimento de RNA com 500 µ l de etanol 70%.
- Centrifugar as amostras por 5 min 15.400 x g e 4° C.
- Retire cuidadosamente as pelotas de RNA de sobrenadante e secar ao ar durante 15 minutos, ou até todos etanol tenha evaporado.
- Resuspenda pelotas de RNA em 10 µ l de 8 M de ureia.
- Adicionar 150 U de RNase T1 e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Adicione 2 µ l de 6 x carregando buffer (60% de glicerol, 0,1% de xileno cianol).
- Carrega 10 µ l de cada amostra de RNA em uma pre-execução, 20% poliacrilamida, gel de ureia de 7,5 M (ver secção 2 do protocolo).
Nota: As escadas de tamanho de RNA Radiolabeled podem ser incluídas como um marcador de mobilidade adicionais. - Funcione o gel por 2 h em 25 mA.
- Pare de gel e remover do aparelho.
- Break selar entre as placas de dois vidro e remover dentre as placas de vidro, com o gel restante na chapa "inferior".
Nota: tenha cuidado para não rasgar o gel durante esta etapa. - Coloque uma camada de filme plástico sobre o gel e expor em uma tela de fósforo por 3 h. Alternativamente, colocar gel no papel para cromatografia e seque com um secador antes da exposição de tela de fósforo de gel.
- Tela de fósforo da imagem em uma imagem de fósforo.
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Representative Results
Mod5 foi incubado com uma tirosina tRNA ou serina tRNA na presença ou ausência de DMAPP. Após a reação de modificação, produtos foram RNase T1-digerido, que fende a extremidade 3' de todos os guanosines deixando um 3' guanosina (GMP) de monophosphates24 (Figura 1). Digestão completa dos RNAs produz um padrão previsível de radiolabeled fragmentos(Figura 2),que então são resolvidos em uma 20% de poliacrilamida desnaturação gel. A transferência de um grupo de isopentenilo de DMAPP ao RNA provoca uma mudança de mobilidade do fragmento contendo o resíduo modificado (Figura 1).
Este protocolo para detecção segura de isopentenylation de resíduos de tRNA canônica e não-canônicos modificado por Mod524. Por exemplo, Mod5 está previsto para modificar um subconjunto dos tRNAs, que contêm o descrito anteriormente AAA36-38 sequência requisito10, incluindo a tirosina tRNA e serina tRNA utilizado neste estudo. Mod5 modifica o resíduo previsto na presença de DMAPP conforme é indicado pelo deslocado 10 nt AAA36-38 , contendo o fragmento na tirosina tRNA (Figura 2B). Da mesma forma, quando a Serina tRNA é incubado com Mod5 e DMAPP, uma mudança completa dos 10 nt AAA36-38 , contendo o fragmento é observada (Figura 2C). Curiosamente, uma mudança parcial de um fragmento de nt 7 observa-se que não contenha o AAA36-38 (Figura 2C). Estes dados sugerem que a sequência de36-38 AAA e estrutura não são requeridos para Mod5 em vitro atividade; no entanto, futuros estudos utilizando LC-MS/MS ou outros métodos são necessários para confirmar a natureza química exata da modificação.
Figura 1 : Ilustração do ensaio de isopentenilo transferase. tRNA, internamente rotulados com 32P-adeonsine, é mostrado incubadas com S. cerevisiae tRNA isopentenilo transferase (Mod5) e a ATP, com ou sem DMAPP. Posições A36-A38 são indicados adjacente à região anticodão. Asteriscos vermelhos representam radiolabeled nucleotídeos. Após incubação, RNAs são digeridos com RNase T1, extraídos e resolvidos por desnaturação-página de 20%. A transferência de um grupo de isopentenilo de DMAPP para o tRNA é indicada por um bando de retardados durante a electroforese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : RNase T1 digestão mapa e representante resultados de um ensaio de transferase de isopentenilo. (A) triângulos pretos representam sítios de clivagem de RNase T1 e linhas pretas acima os triângulos representam fragmentos resultantes que contêm pelo menos um 32P-rotulado adenosina. Cinza, destacado de resíduos previu6A sites de modificação (ou seja, A37). (B) tRNA tirosina e (C) serina tRNA internamente foram rotulados com 32P-adenosina. O S. cerevisiae isopentenilo transferase, Mod5, foi incubado com cada RNA na presença ou ausência de DMAPP. Os RNAs foram então digeridos com RNase T1 e resolvidos na página de desnaturação. Dependentes DMAPP deslocadas bandas indicam a presença de um resíduo de RNA modificado. O site de modificação prevista, A37, é sublinhado, e modificados A37 resíduos são indicados com um asterisco. Um site de modificação de imprevistos e romance é identificado e indicado como "Eu6A?". Esta figura foi modificada de leitura et al 24 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modificações de RNA continuam a ser mostrado para desempenhar um papel cada vez mais importante e diverso no celular e a função. Como tal, o desenvolvimento de ensaios para interrogar o RNA enzimas de modificação é fundamental para compreender melhor os aspectos fundamentais da biologia. Este protocolo descreve um ensaio de alta resolução em vitro para caracterizar a atividade de modificação do tRNA do Mod5.
Este protocolo tem a vantagem de fornecer uma leitura direta e facilmente interpretável de isopentenylation. O protocolo descrito permite a caracterização bioquímica robusta de isopentenilo transferases. Além disso, este sistema pode ser usado com variantes da enzima ou modificado em substratos de RNA, permitindo a determinação direta dos papéis que resíduos específicos ou domínios em modificação. Para obter maior resolução, este protocolo pode ser facilmente adaptado para incluir digestões paralelos com outro RNases, como RNase P1 e/ou RNase A, que cleave em todos os quatro nucleotídeos ou em C e U, respectivamente.
Uma limitação deste teste é que é relativamente baixa produtividade e, portanto, RNAs menos que podem praticamente ser analisados em comparação com a sequenciação do ARN e espectrometria de massa se aproxima de34. Portanto, não é recomendável que este protocolo seja usado para aqueles que visam identificar sites transcriptoma-toda a modificação do RNA. Este protocolo é mais útil para os investigadores que estão interessados em examinar um RNA específico modificando a enzima com RNAs particulares de interesse. No entanto, muitas metodologias ampla transcriptome usadas para identificar modificações RNA exigem adição covalente de um grupo químico de um nucleotídeo modificado. Este método fornece um ensaio mais barato e eficiente, onde alguém poderia testar protocolos de modificação em um substrato individual para otimizar modificação química antes de cometer a um esforço de toda a transcriptome40. Embora este protocolo fornece um ensaio simples e direto para detectar a atividade de transferase de isopentenilo, conforme é descrito aqui, apenas a porcentagem modificada do fragmento de RNA total pode ser calculada e comparada entre grupos. Pesquisadores interessados em fazer a enzima quantitativa comparações de atividade devem primeiro calcular as unidades de actividade por concentração da enzima.
O sucesso desse método depende fortemente de alguns passos críticos. É importante que a integridade do RNA de interesse é confirmada antes a isopentenylation. Degradação da amostra antes do ensaio de transferase de isopentenilo RNA poderia ter um efeito significativo na modificação do RNA e confundir a interpretação dos dados. Além disso, essa degradação é difícil de detectar após a digestão de RNase T1 tomou lugar. Portanto, é recomendável que a integridade do RNA é verificada pela página de desnaturação. Além disso, caracterizar plenamente e com precisão a extensão da modificação do RNA, é essencial para garantir a digestão de RNase T1 prosseguiu até a conclusão. RNases adicionais, tais como RNase P1 e/ou RNase A, pode ser usado para digerir RNAs em paralelo com RNase T1 para aumentar a resolução deste teste. Escadas do oligonucleotide radiolabeled de comprimento conhecido e sequência e amostras de RNA não digeridas podem ser usadas para avaliar a digestão. Por último, para algumas enzimas, a especificidade da modificação depende do RNA sendo no estado dobrado "corretamente". Enquanto a maioria dos tRNAs sintetizado em vitro dobra em estruturas assemelhando-se a sua estrutura na vivo , isto é menos seguro para outras classes de RNAs, particularmente com mais tempo de RNAs41.
Embora o protocolo descrito é específico para Mod5 isopentenylation de tRNAs, esse método poderia ser facilmente adaptado para caracterizar outras enzimas RNA-modificando que covalentemente adiciona um grupo químico que altera significativamente o peso molecular ou gel de mobilidade de o RNA.
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Disclosures
Nenhum para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o Dr. David Engelke por sua orientação e comentários úteis sobre este manuscrito. PJS - fundos de inicialização de laboratório Ball State University; DAB - conceder 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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