Summary
우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.
Abstract
N6-isopentenyladenosine RNA 수정 기능 다양 하 고 높은 원핵생물과 진핵생물 사이에서 보존 있습니다. 가장 높은 보존된 N6-isopentenyladenosine 수정 중 tRNAs의 하위 집합에서 A37 위치에서 발생합니다. 이 수정 리보솜에는 tRNA의 선호도 증가 시켜 번역 효율성과 충실도 향상 시킵니다. 효소는 진핵생물에서이 수정에 대 한 책임의 돌연변이 미토 콘 드 리아 기능 장애, 암 등 여러 질병 상태와 연결 됩니다. 따라서, 기질 특이성 및 이러한 효소의 생 화 확 적인 활동 이해 정상과 pathologic 진 핵 생물의 이해를 위해 중요 하다. 방법의 다양 한 배열은6A 수정 난을 특성화 하기 위해 고용 되었다. 여기는 isopentenylation Mod5에 의해의 검출에 대 한 직접적인 접근을 설명. 이 방법은 재조합 isopentenyl 전이 효소, RNase T1 소화 및6A 수정 난을 검출 하기 위하여 1 차원 젤 전기 이동 법 분석 가진 RNAs의 외피를 사용 합니다. 또한, 잠재적인 적응성이의이 정서의 다른 RNA 수정 효소의 특성을 설명 합니다.
Introduction
적어도 163 가지 posttranscriptional RNA 수정 확인 되었습니다, RNAs에 맞는 다양 한 기능을 부여, 직접 영향을 미치는 RNA 구조, 및 다른 RNA의 상호 작용에 영향을 미치는 이러한 수정 분자1,2. 수와 다양 한 RNA 수정에 대 한 감사는 증가, 그것은 안정적으로 RNA 수정 및 그들을 촉매 하는 효소를 심문 수 분석 실험 개발에 중요 한.
발견 될 첫번째 RNA 수정 중 기본 37 tRNAs, 3' 사이드3,4안티 codon에 인접 한에서 발생 합니다. Isopentenyl 그룹 dimethylallylpyrophosphate (DMAPP)에서 아데노신 37의 N6 위치 전송 됩니다 (난6A37) 세포질 및 미토 콘 드리 아 tRNAs의 하위 집합에 3,5 . 난6A37 번역 충실도 향상과6리보솜4,6 , tRNA의 선호도 증가 시켜 효율성 A37 박테리아7스트레스 반응에 대 한 중요 하다. 이 수정 수행 하는 효소 tRNA isopentenyl transferases 불린다 고 높은 박테리아8,9, 버섯10, 벌레11, 식물12및 높은 진핵생물13 보존 됩니다. , 인간14를 포함 하 여.
돌연변이 인간 tRNA의 isopentenyl 전이 효소 유전자, TRIT1에서 인간의 질병과 연결 되어 있습니다. 예를 들어 TRIT1 에 돌연변이 가능성이 미토 콘 드리 아 단백질 합성15,16결함으로 인 한 심각한 미토 콘 드 리아 질병으로 상관 된다. 또한, TRIT1 는 종양 억제기 유전자17,18 으로 설명 하고있다 고 암 흑색 종19, 유 방20, 위21, 폐 암22 등의 여러 종류에 연루 ,23. 마지막으로, TRIT1 및 Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases 집계 경향이 단백질 프리온 같은 녹말 체 섬유24,,2526를 형성 하는. 이 관측은 잠재적으로 있지만이 대 한 직접적인 증거는 아직 표시 되지 tRNA isopentenyl transferases 신경 퇴행 성 질환에 연루.
Isopentenyl transferases 번역 및 질병, 직접 내가6측정 방법에서 isopentenyl 전이 효소 활동 재생 역할을 감안할 때 이러한 정상에서 효소와 질병 상태에 대 한 기계적 이해에 대 한 중요 하다. 방법의 증가 나6A RNA 수정, 포함 한 생체 외에서 isopentenylation 분석 실험, 긍정적인 교 잡 검출을 사용할 수 있습니다 나의 부재에6(PHA6) 분석 실험, 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 아미노산 수용 활동 분석 실험, 그리고 질량 분석 접근 (참고 4검토 됨).
생체 외에서 isopentenylation 분석 결과 활용 14C DMAPP 및 레이블이 tRNAs 설명 하고있다. 이 분석 결과에서 방사성 탄소 isopentenyl 전이 효소에 의해 14C DMAPP에서에서 RNA를 전송 됩니다. 이 분석 결과 매우 중요 한, 그것은 종종 특정 잔류물은9,,2027수정 확인 어렵다. PHA6 분석 실험에 의존 하는 부피 나6A 수정 수정 된 잔류물에 걸친 32P 표시 된 프로브의 교 잡에 방해가. 이와 같이, 교 잡 이다 i의 부재에서 더 큰6수정18,,2829. PHA6 분석 실험 매우 민감하고 세포 lysates에서 추출한 총 RNA를 분석 할 수 있습니다. 또한, 프로브 특정 관심의 RNA 설계 하는 능력이 방법은 상당한 대상 유연성을 제공 합니다. 그러나, PHA6 분석 실험의 수정 따라서 소설 수정 사이트를 식별 하는 조사의 대상된 지역 내에서 잔류물에 발생 하는 특성으로 제한 됩니다. 또한,로 바인딩의 부재는 수정, 다른 수정 또는 RNA 바인딩에 영향을 주는 돌연변이 데이터 분석을 혼동 됩니다.
또 다른 방법은 결합 벤 DEAE 셀 루 로스 (BD) 셀 루 로스 크로마토그래피 아미노산 수용 활동의 판독으로 tRNA306A 수정 합니다. 이 방법은 직접 기능을 분석 실험 i의6A 수정, 하지만 난6A 수정 감지 하는 간접 접근 이며 매핑하는 RNA에서 특정 잔류물에 수정 해상도 결여. TLC 접근 총 tRNA를 감지 하는 데 사용 되었습니다 내가6A 수정. 이 방법에서는, 내부적으로 32P 라는 tRNAs 단일 뉴클레오티드를 소화 하 고 2 차원 TLC 분석은 isopentenylation를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이 방식은 매우 민감한 탐지에 나에 게 주어진 RNA 샘플에서6A 총 이지만, 소화 시 모든 시퀀스 정보 손실; 따라서, 조사는 잔류물 수정된31되었습니다 결정의 방법이 있다.
더 최근에, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 방법은 개발 되었다 종, 세포 유형, 및 실험 조건32,33, 사이 총 RNA 수정 양적 비교 하 34. 이 방법론의 한계 덜 id와 위치를 수정된 nucleoside 했다 RNA 내에서 파생 된34확인할 수입니다. 또한, 전문성 및 장비 이러한 실험을 실행 하는 데 필요한이 방법의 실용성을 제한 합니다.
또한, 여러 가지 차세대 시퀀싱 기술은 매핑할 RNA 수정 transcriptome 전반34개발 되었습니다. 특정 수정 (RIP-Seq) 특정 항 체와 RNAs의 Immunoprecipitation 사용 특정 수정35,36를 포함 하는 모든 시퀀스를 식별 하는 탐정. 또한, 화학-Seq 등 비 무작위 불일치 시퀀싱 역전사-기반 접근 수정된 잔류물37,,3839에서 반전 녹음 방송 반응의 물결에 의존합니다. RNA 수정 transcriptome-넓은 지도를 이러한 기술의 장점에도 불구 하 고 RIP seq 시퀀스 (Seq) 화학 기술과 신뢰할 수 있는 항 체 또는 각 특정 수정, 각각34에 사용할 수 있는 반응 화학 물질의 부족에 의해 제한 됩니다. 또한, 역전사 효소 화학-Seq를 수행 하는 데 필요한 및 비-무작위 불일치 시퀀싱 기술을 안정 RNA 구조에 의해 장애가 수 있습니다. 높은 수정 하 고 구조적으로 안정적인 성격의 tRNAs 어려워질 그들 특히 이러한 기술을 사용 하 여가. 날짜 하려면, 다음-세대 시퀀싱 기반 기술은 하지 아직 이용 되어6수정34나을 지도.
여기, 내가6A tRNA 수정 체 외검출 하는 간단 하 고 직접적인 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 RNAs 재조합 S. cerevisiae isopentenyl 전이 효소 (Mod5)와 RNase T1 소화 및 1 차원 젤 전기 이동 법 분석 나6A 수정 지도 하의 외피를 활용 합니다. 이 방법은 직접 이며 데이터를 분석 하는 작은 특수 전문 지식이 필요로. 또한,이 메서드는 다른 RNA 효소, RNA 또는 젤 통해 RNA의 이동성의 분자량 covalently 변경 효소를 포함 하 여 수정에.
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Protocol
참고: 프로토콜 참고. 24에서 적응 시켰다.
1. RNA와 관심의 효소를 얻을
- 사용에서 생체 외에서 복사할 RNAs 내부적으로 32P, 표시 된 재조합 His6-Mod5 표현 하 고 대장균, 앞에서 설명한24에서 정화.
- 소개 생체 외에서 복사할 RNAs (제 3) 레이블이 ATP, UTP, CTP, GTP와 젤 정화, 에탄올 침전 α-ATP의 10 µCi의 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 1 x 테 (10 mM Tris HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA)에서 resuspended 그리고-80 ° C 에 저장 24.
- 또는, 관심의 상용 붙일 레이블된 RNAs를 얻을. 모든 기본 식 시스템에 관심의 enzyme(s)를 생성 합니다.
주의: 내부 형광 태그는 RNA에서 바꿀 수 있다 RNA 구조와 인식 효소에 의해.
2. 준비 20 %Polyacrylamide 젤을 변성 시키기
참고: RNA 파편의 충분 한 해상도 얻으려면 40 cm 길이 수직 석판 젤이 좋습니다. 사용 하는 젤의 너비는 분석할 샘플 수에 의해 결정 됩니다.
- 철저 하 게 청소 유리 접시. 첫째, 비누와 물으로 씻어, 이온을 제거 된 물으로 잘 씻어 그리고 마지막으로 소 프로 파 놀과 보풀 물티슈로 청소.
- 접시와 스페이서를 조립.
- 20% 아크릴, 7.5 M 요소, 1 x TBE 젤 100ml를 만들기 위해 다음과 같은 시 약을 혼합: 우 레 아 젤의 80 mL 집중 (237.5 g/L의 아크릴 아 미드, 메 틸 렌 bisacrylamide의 12.5 g/L, 이온된 수에 7.5 M 요소) 요소 젤 희석제의 10 mL (7.5M 이온된 수에 우 레 아) 및 요소 젤 버퍼 (0.89 M Tris Borate 20 mM EDTA 버퍼 pH 8.3 및 7.5 M 요소)의 10 mL.
참고: 젤 솔루션의 볼륨 젤의 크기에 따라 조정 해야 합니다. - N, N, n ′, n ′ Tetramethylethylenediamine (TEMED)과 갓된 10% 염화 persulfate (AP)의 800 µ L의 40 µ L를 추가 합니다.
- 큰 주사기에 젤 솔루션을 세우 고 유리 접시 사이 분배. 거품 형성을 방지 하기 위해 붓는 동안 손가락으로 유리에 누릅니다.
- 30 분 동안 공고히 하 젤을 허용 합니다.
- 바인더 클립을 사용 하 여 수직 젤 기구에 응고 젤 클램프.
- 1 위와 더 낮은 버퍼 약 실 채울 x TBE.
- 젤, 로드 하기 전에 2 시간 미리 20 젤 실행 mA, 2 h 버퍼 경계 작은 oligonucleotides-달아 날 수 있도록 그렇지 않으면 작은 뉴클레오티드와 oligonucleotides 경향이 버퍼 앞에 붕괴.
3. RNA Isopentenylation 분석 결과
- 17 µ L의 최종 볼륨에 반응 준비 포함 된 58 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1.2 m m ATP, 5.8 m m MgCl2, 0.2 m m DMAPP, 10 U의 RNase 억제제 (예, SuperRNaseIn), 40000 CPM 내부적으로 32P 표시 된 RNA, 5.3 µ M의 Mod5, 및 1.2 m m 2- mercaptoethanol입니다.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 반응을 품 어.
- 에탄올 침전 RNAs 100% 에탄올과 1/10 (1.7 µ L) 및 볼륨을 3.5 M 나트륨 아세테이트 pH 5.5,-20 ° C에서 1 시간 또는 하룻밤 2.5 볼륨 (42.5 µ L)을 사용 하 여.
- RNA 샘플 15,400 x g와 4 ° C에서 20 분 동안 원심
- 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 70% 에탄올 500 µ L로 RNA 펠 릿을 세척.
- 5 분 15,400 x g와 4 ° C에서 원심 분리기 샘플
- 조심 스럽게 표면에 뜨는 고 air-dry RNA 알 약 15 분, 또는 모든 에탄올은 증발 때까지 제거.
- 8m 우 레 아의 10 µ L에서 RNA 펠 릿을 resuspend.
- RNase T1의 150 U를 추가 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 6 (60% 글리세롤, 0.1% 자일 렌 cyanol) 버퍼 로드 x 2 µ L를 추가 합니다.
- 사전 실행된 20 %polyacrylamide, 7.5 M 요소 젤 (프로토콜의 섹션 2 참조)에 각 RNA 샘플의 10 µ L을 로드 합니다.
참고: 방사선된 RNA 크기 사다리 추가 이동성 표식으로 포함 될 수 있습니다. - 25에서 2 h를 위한 젤을 실행 mA.
- 젤을 중지 하 고 장치에서 제거 합니다.
- 휴식 두 유리 접시 사이 물개 하 고 "바닥판"에 남아 있는 젤과 유리 접시 중 하나를 제거 합니다.
참고:이 단계는 젤을 눈물로 하지 주의. - 젤 위에 플라스틱 랩의 레이어를 배치 하 고 또는 3 h. 위해 인광 체 스크린에 노출, 젤 크로마토그래피 종이에 놓고 젤 인광 체 스크린 노출 전에 드라이어로 건조 합니다.
- 인 영상에 이미지 인광 체 스크린입니다.
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Representative Results
Mod5는 티로신과 알을 품는 tRNA 또는 떠들고 DMAPP의 유무에 tRNA. 수정 반응에 따라 제품 있었다 RNase T1 소화는 앞 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (그림 1)을 떠나 모든 guanosines의 3' 끝. 전체 소화는 RNAs의 방사선된 파편 (그림 2A), 다음 20 %polyacrylamide 젤을 변성 시키기에 해결의 예측 가능한 패턴을 생성 합니다. DMAPP에서 RNA는 isopentenyl 그룹의 전송 수정된 잔류물 (그림 1)를 포함 하는 파편의 이동성 변화를 발생 합니다.
이 프로토콜은 안정적으로 Mod524로 수정 하는 정규 및 비정규 tRNA 잔류물의 isopentenylation를 감지 합니다. 예를 들어 Mod5 tRNAs는 앞에서 설명한 AAA36-38 시퀀스 요구10는 티로신을 포함 하 여 포함 하는 하위 집합을 수정 전망 이다 tRNA가이 연구에 사용 된 tRNA와 떠들고. Mod5 수정 DMAPP 존재 예측된 잔류물으로 이동한 10으로 nt AAA36-38 는 티로신에 조각 포함 된 tRNA (그림 2B). 마찬가지로 때 Mod5와 DMAPP, 10의 완전 한 변화 tRNA를 incubated 떠들고 nt AAA36-38 단편을 포함 하는 (그림 2C) 관찰. 흥미롭게도, 7 nt 조각의 부분 변화를 AAA36-38 (그림 2C)를 포함 하지 않는 관찰 됩니다. 이러한 데이터는 AAA36-38 시퀀스와 구조 활동 생체 외에서 Mod5;에 대 한 필요 하지 않습니다 것이 좋습니다. 그러나, 미래 연구 LC-MS/MS 또는 다른 방법을 사용 하는 변경의 정확한 화학 특성을 확인 해야 합니다.
그림 1 : Isopentenyl 전이 효소 분석 결과의 그림. tRNA, 내부적으로 32P-adeonsine, 표시는 S. cerevisiae tRNA isopentenyl 전이 효소 (Mod5), 및 ATP incubated DMAPP 없이 표시 됩니다. 위치 A36-A38 anticodon 지역에 인접 한 표시 됩니다. 빨간 별표 방사선된 뉴클레오티드를 나타냅니다. 부 화, 다음 RNAs는 RNase T1로 소화, 추출, 고 20% 변성 시키기-페이지에서 해결. tRNA DMAPP에서 isopentenyl 그룹의 이전은 저 능 아 밴드 전기 이동 법 동안에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Isopentenyl 전이 효소 분석 결과의 RNase T1 소화 지도 및 대표 결과. (A) 검은 삼각형 RNase T1 분열 사이트와 삼각형 위에 검은 줄 하나 이상 32P 표시 된 아데노신을 포함 하는 결과 파편을 대표 합니다. 회색 강조 표시 된 잔류물은 내가6A 수정 사이트 (즉, A37) 예측. (B) 티로신 tRNA와 (C) 떠들고 tRNA 내부적으로 32P-아데노신으로 표시 했다. S. cerevisiae isopentenyl 전이 효소, Mod5, DMAPP의 유무에서 각 RNA와 알을 품는. RNAs RNase T1과 소화 그리고 변성 시키기-페이지에서 해결 했다. 이동한 밴드 DMAPP 의존 수정된 RNA 잔류물의 존재를 나타냅니다. 예측된 수정 사이트 A37, 밑줄을 표시 하 고 수정된 A37 잔류물 별표와 함께 표시 됩니다. 예기치 못한 고 소설 수정 사이트를 식별 하 고로 "나6A?". 이 그림 읽기 외 에서 수정 되었습니다. 24 동의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
RNA 수정 계속 세포질 organismal 기능에 더 중요 하 고 다양 한 역할을 표시 합니다. 따라서, 수정 효소 RNA가 분석의 개발 생물학의 기본적인 측면을 이해 하는 더 나은 중심입니다. 이 프로토콜에는 고해상도 생체 외에서 분석 결과를 Mod5의 tRNA 수정 활동의 특성을 설명 합니다.
이 프로토콜 제공 하는 isopentenylation의 직접적인, 그리고 쉽게 해석할 판독의 뚜렷한 장점이 있습니다. 프로토콜 설명 isopentenyl transferases의 강력한 생 화 확 적인 특성에 대 한 수 있습니다. 또한,이 시스템 효소 이체와 함께 사용할 수 있습니다 또는 RNA 기판, 특정 잔류물 또는 도메인 수정에 있는 역할의 직접 측정 수 있도록 수정. 더 큰 해상도 얻기 위해이 프로토콜 쉽게 C와 U, 또는 모든 4 개의 뉴클레오티드에서 각각 쪼개 RNase p 1과 RNase A, 등 다른 RNases와 병렬 소화를 포함에 맞게 수 있습니다.
이 분석 결과의 한계는 그것이 상대적으로 낮은 처리량 및 따라서 실질적으로 분석 될 수 있는 적은 RNAs RNA 시퀀싱에 비해 질량 분석 접근34. 따라서, 그것은이 프로토콜 RNA 수정 사이트 transcriptome 전체를 식별 하는 것을 목표로 하는 사람들을 위해 사용할 권장 하지 않습니다. 이 프로토콜 수정 효소의 특정 RNAs 특정 RNA 검사에 관심이 조사에 가장 유용 합니다. 그러나, 많은 transcriptome RNA 수정 식별 하는 데 사용 된 넓은 방법론 수정된 뉴클레오티드를 화학 moiety의 공유 추가 필요 합니다. 이 메서드는 어디 하나40transcriptome 차원의 노력 투입 하기 전에 화학 수정 최적화를 개별 기판에 수정 프로토콜 테스트 저렴 하 고 효율적인 분석 결과를 제공 합니다. 이 프로토콜을 제공 하지만 isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 간단 하 고 직접적인 분석 결과 여기 설명된대로, 총 RNA 조각의 수정 %만 계산 고 그룹 사이 비교 수 있습니다. 연구원 활동 비교 양적 효소에 먼저 효소의 농도 당 활동의 단위를 계산 해야 합니다.
이 방법의 성공 몇 가지 중요 한 단계에 크게 의존합니다. 이전에 isopentenylation 관심의 RNA의 무결성 확인은 중요 하다.입니다. Isopentenyl 전이 효소 분석 결과 이전 RNA 샘플의 RNA 수정에 중요 한 영향을 미칠 수 있고 데이터 해석을 혼동. 또한, 같은 저하 후 RNase T1 소화는 감지 하기가 어렵습니다. 따라서, 페이지를 변성 시키기가 RNA 무결성을 체크 하는 것이 좋습니다. 또한, 완전히 그리고 정확 하 게 RNA 수정 범위 특성, RNase T1 소화는 완료 진행 되도록 필수적 이다. 추가 RNases RNase p 1과 RNase A, 등이 분석 결과의 해상도 증가 소화 RNAs RNase T1 병행에서 사용할 수 있습니다. 알려진된 길이 순서와 소화 되지 않은 RNA 샘플의 방사선된 oligonucleotide 사다리 소화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 일부 효소 수정의 특이성 "제대로" 접힌된 상태에서 되 고 RNA에 따라 다릅니다. 동안에 배 합성 체 외에 대부분 tRNAs 닮은 그들의 생체 내에서 구조 구조, 이것은 덜 긴 RNAs41와 특히, RNAs의 다른 클래스에 대 한 특정.
이 방법은 쉽게 covalently 화학 moiety 크게 달라져 분자량 또는 젤의 이동성을 추가 하는 다른 RNA 수정 효소의 특성에 맞게 수 tRNAs의 Mod5 isopentenylation에 설명 된 프로토콜 이지만, RNA입니다.
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Disclosures
공개 없음입니다.
Acknowledgments
우리는 그의 지도 및 유용한 의견이이 원고에 대 한 박사 데이비드 Engelke 감사 하 고 싶습니다. 잠 옷-공 주립 대학 실험실 시작 자금; 소량-1R15AI130950-01을 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
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