Summary
Här beskriver vi ett protokoll för biokemisk karakterisering av jäst RNA-modifiera enzymet, Mod5, och diskutera hur detta protokoll skulle kunna tillämpas på andra RNA-ändra enzymer.
Abstract
N6- isopentenyladenosine RNA modifieringar är funktionellt mångsidig och mycket bevarat bland prokaryoter och Eukaryoter. En av de mest mycket N6- isopentenyladenosine ändringarna uppstår vid A37 position i en delmängd av tRNAs. Ändringen förbättrar översättning effektivitet och trohet genom att öka tRNAen affinitet för Ribosomen. Mutation av enzymer som ansvarar för denna ändring i Eukaryoter är associerade med flera sjukdomstillstånd, inklusive mitokondriell dysfunktion och cancer. Därför är det viktigt för förståelse av normal och patologisk eukaryota biologi att förstå substrat specificitet och biokemiska aktiviteter av dessa enzymer. En mångfald av metoder har använts för att karakterisera jag6A modifieringar. Är häri beskrivs en direkt metod för detektion av isopentenylation av Mod5. Denna metod använder tredjeparts inkubation av RNAs med en rekombinant isopentenyl transferas, följt av RNase T1 matsmältningen och 1-dimensionella gelelektrofores analys till upptäcka jag6A modifieringar. Dessutom diskuteras detta protokoll att karakterisera andra RNA-ändra enzymer potentiella anpassningsförmåga.
Introduction
Minst 163 distinkta postttransskriptionell RNA ändringar har identifierats, med dessa ändringar ger varierande och innehållsberoende funktioner till RNAs, direkt påverka RNA struktur, och som påverkar samspelet mellan RNA med andra molekyler1,2. Som uppskattning för antal och mängd RNA ändringar ökar, är det viktigt att utveckla analyser som tillförlitligt kan förhöra både RNA ändringarna och de enzymer som katalyserar dem.
En av de första RNA ändringarna identifieras uppstår vid basen 37 i tRNAs, intill den anti Codonen på 3' sida3,4. En isopentenyl grupp överförs från dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) till N6 position av adenosin 37 (jag6A37) 3,5 på en delmängd av både cytoplasmiska och mitokondrie tRNAs. Jag6A37 förbättrar översättning trohet och effektivitet genom att öka den tRNAen affinitet för de Ribosomen4,6 och jag6A37 är viktigt för stress i bakterier7. De enzymer som utför denna ändring kallas tRNA isopentenyl transferaser och är starkt konservativa i bakterier8,9, svampar10, maskar11, växter12och högre eukaryotes13 , inklusive människor14.
Mutationer i mänskliga tRNA isopentenyl transferas gen, TRIT1, är associerade med mänskliga sjukdomar. Exempelvis är en mutation i TRIT1 korrelerad med en svår mitokondriell sjukdom, troligen orsakad av en defekt i mitokondriell proteinsyntes15,16. Dessutom TRIT1 har beskrivits som en tumör suppressor genen17,18 och är inblandad i flera typer av cancer inklusive melanom19, bröst20, gastric21och lung cancer22 ,23. Slutligen TRIT1 och Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferaser är aggregation-benägen proteiner som bildar prion-liknande amyloid fibrer24,25,26. Dessa observationer implicerade potentiellt tRNA isopentenyl transferaser vid neurodegenerativa sjukdomar, även om direkta bevis för detta inte har ännu visats.
Givna roll att isopentenyl transferaser i översättning och sjukdom, metoder som direkt åtgärd jag6en isopentenyl transferas aktivitet är viktiga för en mekanistisk förståelse av dessa enzymer under normala och stater sjukdom. Det finns ett ökande antal metoder att upptäcka jag6A RNA ändringar, inklusive in vitro- isopentenylation analyser, positiva hybridisering i avsaknad av jag6en (PHA6)-analyser, tunna lager kromatografi (TLC), aminosyra acceptans aktivitet analyser och masspektrometri metoder (granskad i Ref. 4).
En in vitro- isopentenylation assay har beskrivits som använder 14C-DMAPP och omärkt tRNAs. I denna analys överförs radioaktivt kol till RNA från 14C-DMAPP av den isopentenyl-transferasen. Denna analys är mycket känslig, är det ofta svårt att avgöra särskilda restmängd som är modified9,20,27. PHA6 analyser lita på den skrymmande jag6A ändring stör hybridisering av en 32P-märkt sond som spänner över det modifierade rest. Som sådan hybridisering är större i avsaknad av ett i6en ändring18,28,29. PHA6 analyserna är mycket känsliga och kan analysera total-RNA extraherade från cellulära lysates. Dessutom ger möjligheten att designa sonder som är specifika för RNA av intresse denna metod betydande mål flexibilitet. PHA6 analyser är dock begränsade till karakterisering av ändringar som inträffar på rester inom den berörda regionen av sonden och är därför mindre sannolikt att identifiera roman modifiering platser. Dessutom, eftersom avsaknad av bindande är vägledande för modifiering, kommer andra modifieringar eller mutationer som påverkar RNA bindande förbrylla dataanalys.
En annan strategi kombinerar bensyl DEAE-cellulosa (BD) cellulosa kromatografi med aminosyran acceptans verksamhet en avläsning av i6A ändringar i tRNA30. Detta tillvägagångssätt analyser direkt funktion av i6A ändring, men det är en indirekt metod att upptäcka jag6A modifiering och saknar resolution att mappa ändringar av en specifik rester i RNA. En TLC tillvägagångssätt har använts att upptäcka totala tRNA jag6A modifieringar. I denna strategi, internt 32P-märkt tRNAs rötas till enstaka nukleotider och tvådimensionella TLC analys används för att identifiera isopentenylation. Detta tillvägagångssätt är mycket känsliga i upptäckande totalt jag6A i ett givet RNA-prov men vid matsmältning, alla sekvensinformation går förlorad; Utredaren har således, inget sätt att fastställa vilka rester har varit modifierad31.
Mer nyligen, liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) metoder har utvecklats som kvantitativt jämför totala RNA ändringar mellan arter, celltyper och experimentella förhållanden32,33, 34. En begränsning av denna metod är att det är mindre kunna fastställa identitet och ställning inom RNA som var den modifierade nukleosiden härrör34. Dessutom begränsa den expertis och utrustning som är nödvändiga för att genomföra dessa experiment praktiskhet i denna strategi.
Dessutom har flera nästa generations sekvensering teknik utvecklats för att mappa RNA ändringar transkriptom hela34. Immunoprecipitation av RNAs med antikroppar som är specifika för en viss modifiering (RIP-Seq) gör det möjligt för utredaren att identifiera alla sekvenser som innehåller en specifik ändring35,36. Omvänt transkriptas-baserade metoder såsom Chem-Seq och icke-slumpmässigt mismatch sekvensering är dessutom beroende av störningar av omvänd Transkription reaktionen vid den modifierade rester37,38,39. Trots fördelen med dessa tekniker för att mappa RNA ändringar transkriptom-wide, begränsas RIP-seq och Chem-Seq teknik av bristen på tillförlitliga antikroppar eller reaktiva kemikalier tillgänglig för varje specifik modifiering, respektive34. Dessutom omvänt transkriptas enzymer för att utföra Chem-Seq och icke-slumpmässigt mismatch sekvensering tekniker kan hindras genom stabila RNA strukturer. Den starkt modifierade och strukturellt stabil karaktären tRNAs gör dem särskilt svårt att förhöra använda dessa tekniker. Hittills har nästa generations sekvensering-baserad teknik inte ännu använts till karta jag6en ändringar34.
Häri, beskriver vi en enkel och direkt inställning till upptäcka jag6A tRNA ändringar in vitro. Denna metod använder tredjeparts inkubering av RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferas (Mod5), följt av RNase T1 matsmältningen och 1-dimensionella gelelektrofores analys för att kartlägga jag6A modifieringar. Denna strategi är direkt och kräver lite specialiserad expertis för att analysera data. Dessutom är denna metod anpassas till andra RNA ändra enzymer, inklusive enzymer som kovalent ändrar den molekylära vikten av RNA eller en RNA rörlighet genom en gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Protokollet var anpassad från Ref. 24.
1. Skaffa RNA och enzym av intresse
- Användning i vitro transkriberas RNAs internt märkt med 32P, och rekombinant His6-Mod5 uttryckt i och renas från E. coli, som tidigare beskrivits24.
- Införa i vitro transkriberas RNAs (avsnitt 3) använder T7 RNA-polymeras i närvaro av omärkta ATP, UTP, CTP, GTP och 10 µCi av gel-renat, etanol-fällt α-ATP, resuspended i 1 x TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,1 mM EDTA), och lagras vid-80 ° C 24.
- Alternativt få kommersiellt tillgängliga fluorescently märkt RNAs sevärdheter. Producera enzyme(s) av intresse i någon rekommenderad uttryck systemet.
Försiktighet: Interna fluorescerande Taggar i RNA kan förändra RNA struktur och erkännande av enzymer.
2. Förbered en 20% polyakrylamid denatureringen Gel
Obs: För att erhålla tillräcklig upplösning av RNA fragment, en 40 cm längd vertikal platta gel rekommenderas. Bredden på gelen används bestäms av antalet prover som skall analyseras.
- Ren noggrant glasplattor. Först tvätta med tvål och vatten, skölj noga med avjoniserat vatten, och slutligen rengör med isopropanol och luddfria servetter.
- Montera plattorna och distanser.
- Blanda följande reagenser för att göra 100 mL 20% akrylamid, 7,5 M urea, 1 x TBE gel: 80 mL karbamid gel koncentrat (237,5 HB av akrylamid, 12,5 g/L metylen bisacrylamide, 7,5 M urea i avjoniserat vatten), 10 mL karbamid gel spädningsvätska (7.5M urea i avjoniserat vatten) , och 10 mL av karbamid gel buffert (0,89 M Tris-Borat-20 mM EDTA buffert pH 8,3 och 7,5 M urea).
Obs: Mängden gel lösning måste justeras enligt mått av gel. - Tillsätt 40 µL av N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) och 800 µL av nylagade 10% ammonium persulfatoxidation (APS).
- Upprätta gel lösning till en stor spruta och fördela mellan glasskivor. Tryck på glaset med fingrarna medan hälla för att förhindra bubbla bildandet.
- Låt gelen stelna i 30 min.
- Klämma stelnat gelen på vertikala gel apparater med hjälp av bindemedel klipp.
- Fyll övre och nedre buffert chambers med 1 x TBE.
- Två timmar före lastning i gel, pre kör gelen vid 20 mA, för 2 h att tillåta den buffert gränsen till springa ifrån de minsta oligonukleotider - annars den minsta nukleotider och oligonukleotider tenderar att kollapsa framtill buffert.
3. RNA Isopentenylation Assay
- Förbereda reaktioner i en slutlig volym av 17 µL, som innehåller 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5.8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 U av RNase inhibitor (t.ex., SuperRNaseIn), 40.000 CPM internt 32P-märkt RNA, 5,3 µM Mod5, och 1.2 mM 2 - merkaptoetanol.
- Inkubera reaktioner vid 37 ° C i 1 h.
- Etanol-fällningen RNAs med 2,5 volymer (42,5 µL) av 100% etanol och 1/10 volymer (1,7 µL) av 3,5 M natrium acetat pH 5,5 och plats vid-20 ° C för 1 tim eller över natten.
- Centrifugera RNA prover för 20 min vid 15,400 x g och 4 ° C.
- Försiktigt avlägsna supernatanten och tvätta RNA pelleten med 500 µL av 70% etanol.
- Centrifugera proverna på för 5 min 15,400 x g och 4° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och lufttorka RNA pellets i 15 min, eller tills alla etanol har avdunstat.
- Återsuspendera RNA pellets i 10 µL 8 M urea.
- Lägg till 150 U av RNase T1 och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Tillsätt 2 µL av 6 x laddar buffert (60% glycerol, 0,1% xylen cyanol).
- Ladda 10 µL av varje RNA-prov på en pre springa, 20% polyakrylamid, 7,5 M karbamid gel (se avsnitt 2 i protokollet).
Obs: Radiomärkt RNA storlek stegar kan ingå som en markör för extra rörlighet. - Kör gelen för 2 h 25 mA.
- Stoppa gel och bort från apparaten.
- Break tätning mellan de två glasplattorna och ta bort en av glasplattorna, med gelen kvar på ”bottenplatta”.
Obs: se till att inte riva gelen under detta steg. - Placera ett lager av plastfolie över gelen och exponera på en fosfor skärm för 3 h. Alternativt, placera gel på kromatografipapper och torka med en hårtork före fosfor skärmen exponering gel.
- Bild fosfor skärmen på en fosfor imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mod5 var inkuberas med en tyrosin tRNA eller serine tRNA i närvaro eller frånvaro av DMAPP. Efter modifiering reaktionen var produkterna RNase T1-rötas, som klyver 3' ände alla guanosines lämnar en 3' guanosinmonofosfat monophosphates (GMP)24 (figur 1). Fullständig nedbrytning av RNASEN producerar ett förutsägbart mönster av radiomärkt fragment (figur 2A), som sedan löses på en 20% polyakrylamid denatureringen gel. Överföring av en isopentenyl-grupp från DMAPP till RNA orsakar en rörlighet förskjutning av fragmentet som innehåller det modifierade rest (figur 1).
Detta protokoll upptäcker tillförlitligt isopentenylation av både kanoniska och icke-kanoniska tRNA rester av Mod524. Till exempel Mod5 förutspås för att ändra en delmängd av tRNAs, som innehåller den tidigare beskrivna AAA36-38 sekvens krav10, inklusive tyrosin tRNA och serin tRNA används i denna studie. Mod5 ändrar det förutspådda rest i närvaro av DMAPP som indikeras av den skiftade 10 nt AAA36-38 innehållande fragment i tyrosin tRNA (figur 2B). På samma sätt, när den serine tRNA inkuberas med Mod5 och DMAPP, en fullständig förändring av 10 nt AAA36-38 innehållande fragment observeras (figur 2C). Intressant, observeras en partiell förskjutning av ett 7 nt fragment som inte innehåller de AAA36-38 (figur 2C). Dessa data tyder på att AAA36-38 sekvens och struktur inte är nödvändiga för Mod5 i vitro aktivitet; framtida studier med LC-MS/MS eller andra metoder krävs dock att bekräfta den exakta kemiska naturen av ändringen.
Figur 1 : Illustration av isopentenyl transferas assay. tRNA, internt märkt med 32P-adeonsine, visas ruvade med S. cerevisiae tRNA isopentenyl transferas (Mod5), och ATP med eller utan DMAPP. Positioner A36-A38 anges intill regionen Anticodonen. Röda asterisker representerar radiomärkt nukleotider. Efter inkubering RNAs rötas med RNase T1, extraheras, och lösas genom 20% denatureringen-sida. Överföring av en isopentenyl-grupp från DMAPP till tRNAen indikeras av en utvecklingsstörd band under elektrofores. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : RNase T1 matsmältningen karta och representativa resultat för en isopentenyl transferas. (A) svarta trianglar representerar RNase T1 klyvning platser och svarta linjer ovanför trianglarna representerar resulterande fragment som innehåller minst en 32P-märkt adenosin. Grå markerade rester är förutspådde jag6A ändring platser (dvs A37). (B) tyrosin tRNA och (C) serine tRNA var internt märkt med 32P-adenosin. S. cerevisiae isopentenyl transferas, Mod5, var inkuberas med varje RNA i närvaro eller frånvaro av DMAPP. RNASEN var sedan smält med RNase T1 och löst på denatureringen-sidan. Skiftade band beroende av DMAPP indikera närvaron av en modifierad RNA-rester. Webbplatsen förutspådda modifiering, A37, är understruken, och modifierade A37 rester är markerade med en asterisk. En oväntad och romanen modifiering webbplats identifieras och anges som ”jag6A”?. Denna siffra har ändrats från Läs o.a. 24 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA ändringar fortsätter att visas att spela allt mer viktiga och olikartade roller i cellulär och organismers funktion. Som sådan, är utvecklingen av analyser att förhöra RNA ändra enzymer central för att bättre förstå de grundläggande aspekterna av biologi. Det här protokollet beskriver en högupplöst in vitro- test för att karakterisera aktiviteten tRNA modifiering av Mod5.
Detta protokoll har den klara fördelen att ge en direkt och lätt tolkningsbara avläsning av isopentenylation. Protokollet beskrivs tillåter robust biokemisk karakterisering av isopentenyl transferaser. Dessutom detta system kan användas med enzym varianter eller ändras RNA-substrat, vilket möjliggör direkt bestämning av roller som specifika rester eller domäner har på modifiering. För att få ännu större upplösning, kunde detta protokoll lätt anpassas till inkludera parallella tumörheterogenitet med andra RNaser, såsom RNase P1 eller RNase A, som sönderdelas vid alla fyra nukleotider eller vid C och U, respektive.
En begränsning av denna analys är att det är relativt låg genomströmning och därmed färre RNAs som kan analyseras praktiskt jämfört med RNA-sekvensering och masspektrometri metoder34. Därför är det inte rekommenderat att detta protokoll användas för dem som syftar till att identifiera RNA modifiering platser transkriptom-wide. Detta protokoll är mest användbar till utredare som är intresserade av att undersöka en specifik RNA modifiera enzymet med viss RNAs sevärdheter. Men kräver många transkriptom brett metoder används för att identifiera RNA ändringar kovalent tillägg av en kemisk del till en modifierad nukleotid. Denna metod ger ett billigt och effektivt test där man kunde testa modifiering protokoll på en enskilda substrat för att optimera kemisk modifiering innan de bestämmer sig en transkriptom-wide insats40. Trots detta protokoll ger en enkel och direkt analys för att upptäcka isopentenyl transferas aktivitet, som det beskrivs här, kan endast den procent modified total RNA Fragmentets beräknas och jämförelse mellan grupperna. Forskare som är intresserade av att göra kvantitativa enzym aktivitet jämförelser måste först beräkna aktivitetsenheter per koncentration av enzym.
Framgången för denna metod är starkt beroende av några kritiska steg. Det är viktigt att integriteten hos RNA av intresse bekräftas innan isopentenylation. Nedbrytning av RNA provet före isopentenyl transferas analysen kunde ha en betydande inverkan på RNA modifiering och blanda ihop tolkning av data. Sådan nedbrytning är dessutom svåra att upptäcka efter RNase T1 matsmältningen har ägt rum. Det rekommenderas därför att RNA integritet kontrolleras av denaturering sida. Dessutom för att fullständigt och korrekt beskriva omfattningen av RNA modifiering, är det viktigt att säkerställa RNase T1 matsmältningen har gått till fullbordan. Ytterligare RNaser, såsom RNase P1 eller RNase A, får användas till digest RNAs parallellt med RNase T1 för att öka upplösningen på denna analys. Radiomärkt oligonukleotiden stegar känd längd och sekvens och osmält RNA-prover kan användas för att bedöma matsmältningen. Slutligen, för vissa enzymer, specificitet modifiering beror på RNA är i tillståndet ”korrekt” vikta. Medan de flesta tRNAs synthesized in vitro- Vik in strukturer som liknar deras in-vivo -struktur, är detta mindre vissa för andra klasser av RNAs, särskilt med längre RNAs41.
Även om protokollet beskrivs är specifika för Mod5 isopentenylation av tRNAs, kunde denna metod anpassas enkelt till kännetecknar andra RNA-ändra enzymer som kovalent lägga en kemisk del som väsentligt förändrar den molekylvikt eller gel rörlighet RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr David Engelke för hans vägledning och hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. PJS - Ball State University laboratorium start medel. DAB - bevilja 1R15AI130950-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D.
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
