Summary

Функциональная характеристика Carboxylesterases в стойкие инсектициды дома мух, Муха Domestica

Published: August 23, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол производить дом летать carboxylesterase белков в пробирке с системой выражение насекомых клеток бакуловирусы опосредованной и позднее функционально характеризуют их роли в метаболизм перметрин, таким образом, присвоение пиретроиды сопротивление путем проведения на основе клеток МТТ пробирного и в пробирке метаболических исследований.

Abstract

Считается, что Carboxylesterase опосредованной метаболизм играть важную роль в инсектицидам в различных насекомых. Несколько carboxylesterase гены были найдены вверх регулируются летать штамм устойчив дом, тогда как их роль в присвоении инсектицидам предстоит изучить. Здесь мы разработали протокол для функциональных характеристик carboxylesterases. Представлены три примера эксперименты: (1) выражение и изоляции carboxylesterase белков через бакуловирусы опосредованной насекомое Spodoptera frugiperda (Sf9) клеток выражение системы; (2 на основе клеток МТТ (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-ил] -2, 5-diphenyltetrazolium бромид) анализа цитотоксичности измерить толерантности насекомых клеток для лечения различных перметрин; и (3) в vitro метаболических исследования для изучения возможности метаболических carboxylesterases сторону перметрин. Джин carboxylesterase, что MdαE7 был клонирован с устойчивостью дома летать штамм ALHF и используется для конструирования рекомбинантных бакуловирусы Sf9 клетки инфекции. Жизнеспособность клеток против различных перметрин лечения были измерены с МТТ assay. Расширение ячейки терпимости экспериментальной группы (MdαE7-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток) по сравнению с теми из групп управления перметрин (CAT-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток и GFP-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных клеток) лечение предложил возможности MdαE7 в метаболизм инсектицидов, тем самым защищая клетки от химических повреждений. Кроме того carboxylesterase белки были выражена в насекомое Sf9 клеток и изолированные провести исследование метаболизма в пробирке . Наши результаты показали значительный в vitro метаболические эффективность MdαE7 сторону перметрин, прямо указывающее участия carboxylesterases в метаболизм инсектицидов и таким образом наделение инсектицидам в доме мух.

Introduction

Резистентность к инсектицидам в настоящее время является серьезной проблемой дом летать контроль во всем мире1,2. Попытки определить механизм инсектицидам способствует лучшему пониманию этого вопроса и таким образом обеспечивают Роман стратегии эффективно предотвратить или свести к минимуму Распространение сопротивления развития3. Carboxylesterases, как один из основных детоксикации ферментов, привлекли много внимания из-за их роли в поглощения и метаболизма инсектицидов в различных насекомых4,5,6. Наши предыдущие исследования выявил несколько carboxylesterases в доме мух и их уровни выражения были не только конститутивно вверх регулируются резистентными штаммами ALHF, но также может быть индуцированных для более высоких уровнях в ответ на перметрин лечения7 . Однако функциональные характеристики этих carboxylesterase генов в метаболизм инсектицидов по-прежнему быть изучены.

После представления первого доклада в начале 1980-х8бакуловирусы опосредованной иностранных ген выражение системы широко используются из-за его эффективности производства высоким содержанием белка и эукариотических белка, обработки возможностей9. Эта двойная система состоит из двух основных элементов: сконструированный рекомбинантных бакуловирусы доставки чужеродных генов в клетки хозяина и крупномасштабных выражение заинтересованных белков в клетках, инфицированных рекомбинантного бакуловирусы. За последние десятилетия бакуловирусы опосредованной клеток выражение системы широко используется производить тысячи рекомбинантных белков, начиная от цитозольной ферментов с белками мембраны прыгните насекомых и млекопитающих клеток10. Наши предыдущие исследования успешно выразил несколько CYP450 ферментов насекомых Sf9 клетки с этой системы11. В этом исследовании, мы построен carboxylesterase рекомбинантных бакуловирусы заразить клетки насекомого Sf9, изучаются терпимости клеток для лечения различных перметрин и крупномасштабных выраженной carboxylesterase белков в пробирке для функциональных разведки. Вместо того, чтобы расследование нескольких carboxylesterase изоферменты смеси от насекомых гомогенатах, принятый ранее исследования12,13, эта система выражение бакуловирусы опосредованной насекомых клеток позволяет конкретное выражение и изоляция целевых белков для лучшего изучения их биохимических и структурных свойств.

Пробу на основе соли tetrazolium (МТТ) является высок объём колориметрическим методом разработаны и оптимизированы для измерения жизнеспособности клеток. Этот assay основан на механизме, который только живые клетки способны метаболизировать реагент МТТ желтый цвет к темный фиолетовый Цветные Формазаны осадок, который может быть проанализирован нелабильном после того, как растворяется в органических растворителях14, 15. Несколько более точным, но много времени методы, такие как Трипановый синий изоляции и тимидина титрования пробирного16,17, были разработаны в последние годы. Однако на основе клеток МТТ пробирного до сих пор в настоящее время признается как метод наиболее быстрым и легко управлять быстро обнаружить жизнеспособность клеток. Здесь мы используем МТТ assay для изучения клеток терпимость против инсектицидами лечения. Повышение толерантности клеток когда инфицированных рекомбинантного бакуловирусы carboxylesterase решительно поддерживает метаболические функции carboxylesterases чтобы инсектициды, которые в свою очередь предполагает их участие в инсектицидам.

Кроме того в пробирке метаболических assay также было проведено в этом исследовании. По сравнению с общим carboxylesterase анализов, которые используют общие субстратов, например α-napthyl ацетат (α-NA) и β-naphthyl ацетат (β-NA) для отражения гидролитическая деятельности carboxylesterases, исследование метаболизма в vitro рассматривается как точный способ для прямого измерения деятельности carboxylesterases к инсектицидам18. Этот метод успешно работает в различных насекомых характеризовать множественные цитохрома P450s совместно с инсектицидами сопротивление11,19,20. Однако этот метод еще не применяется в carboxylesterase исследованиях. При наличии carboxylesterase белков, производимые бакуловирусы опосредованной выражение системы мы можем выполнить в vitro метаболических исследование carboxylesterases сторону перметрин, который далее может предоставить убедительные доказательства участия из carboxylesterases в присвоении пиретроид сопротивления в доме мух.

Protocol

1. выражение и изоляции целевых белков с системой выражение бакуловирусы опосредованной насекомых ячейки Направленно клонирования туп законченному продуктов ПЦР целевых белков из дома мух. Дизайн праймеры PCR зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) и дом летать MdαE7 гена, на осно…

Representative Results

Жизнеспособность клеток к лечения различных перметрин (МТТ проба) Цитотоксичность перметрин рассматривался в MdαE7-рекомбинантных бакуловирусы инфицированных Sf9 клетки (экспериментальная группа) и CAT-рекомбинантных бакуловирусы (предос…

Discussion

В последние десятилетия гетерологичных выражение системы широко использовались выразить и изолировать большое количество белков, таким образом позволяя биохимических и функциональных определение и характеристика ферментов в пробирке. На сегодняшний день, были адаптированы дл?…

Materials

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs inc. M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen by life technology K240020 S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen by life technology K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits Invitrogen by life technology 11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit Invitrogen by life technology 12562-019 Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid Invitrogen by life technology Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified Gibco by Life Technologies 10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM Gibco by Life Technologies 12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer G Biosciences by A Geno Technology Inc 786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete Gibco by Life Technologies 12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented Gibco by Life Technologies 11595030
Permethrin (isomers) analytical standard SUPELCO by Solutions WithinTM 442748
Methanol (analytical graded) Sigma-Aldrich 67-56-1
Acetonitrile (analytical graded) Sigma-Aldrich 75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) Pall Life Sciences 21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System Waters
T100 Thermal Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. 1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek

References

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803 (2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771 (2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587 (2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, &. #. 1. 9. 3. ;. MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583 (2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211 (2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

Play Video

Cite This Article
Feng, X., Liu, N. Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica. J. Vis. Exp. (138), e58106, doi:10.3791/58106 (2018).

View Video