Summary
이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.
Abstract
말기 심장 마비 환자에 대 한 궁극적인 해결책은 장기 이식 이다. 하지만 기증자 마음은 제한 하 고 면역 억제가 필요 하 고, 궁극적으로 거부 발생할 수 있습니다. 기능 만들기, 헌 바이오 인공 심장 이러한 과제를 해결할 수 있습니다. Biofabrication 비 계 및 셀의 구성 하는 심장의 한 옵션입니다. 마이크로 및 매크로 아키텍처 뿐 아니라 조직 특정 구성 자연 비 계는 인간이 나 돼지 등 큰 동물에서 decellularizing 마음에 의해 얻어질 수 있다. Decellularization 3 차원 기질 및 맥 관 구조를 보존 하 고 나중 timepoint에 "cellularization"를 허용 하는 동안 세포 파편에 밖으로 세척 하는 작업이 포함 됩니다. 복잡 한 장기의 관류 decellularization 그를 찾는 우리의 소설에 대문자로 하는 것이 가능, 우리 비 transplantable 인간 심 혼에서 거꾸로 가압된 주머니 안에 배치 하 여 decellularize를 더 "생리" 방법 개발 방향, 제어 압력 하. 가압된 주머니를 사용 하 여의 목적은 대동맥 밸브 폐쇄 그것을 유지 하 고 향상 심근 관류를 통해 압력 그래디언트를 만드는 것입니다. 동시 평가 흐름 역학 및 decellularization 유체 유입 및 파편 유출 모니터링 하는 동안 세포 파편 제거, 간단한 심장 수리를 위해 사용 함으로써 생성 될 수 있는 비 계 (예: 패치로 또는 비 계 밸브) 또는 전체 기관 비 계.
Introduction
심장 마비 환자에서 높은 사망률에 지도 한다. 말기 심장 마비에 대 한 궁극적인 치료 옵션은 여 보세요-이식 합니다. 그러나, 공여 장기의 부족으로이 식 위한 긴 대기 목록 이며 환자 얼굴 후 이식 허들 만성 장기 거부1,2에 평생 면역 억제에 이르기까지 다양. 바이오 기능 마음 decellularized 인간 크기는 환자 자신의 마음을 다시 채우기로 셀3이러한 장애물 우회 수.
중요 한 단계 "공학"는 마음은 적절 한 혈관과 parenchymal 구조, 구성 및 맞춤 가이드 함수 비의 생성 및 전달된 세포의 조직. 적절 한 프레임 워크의 발판에 시드 셀 환경을 인식 하 고 그 장기의 일환으로 예상된 기능을 수행 해야 합니다. 우리의 의견에 decellularized 기관 기질 (dECM) 이상적인 발판의 필요한 특성을 함유 한다.
기본 맥 관 구조를 이용 하 여 복잡 한 전체 기관 decellularization antegrade 또는 퇴행 성 관류4 섬세 한 3D 기질 및 맥 관 구조2, 유지 하면서 세포 구성 요소 제거를 통해 달성 될 수 있다 5,,67. Vivo에서, 영양소 분배 및 폐기물 제거8기능 맥 관 구조 공학 전체 기관 다만에서 중요 하다. 관상 동맥 관류 decellularization 쥐4, 또는 돼지4,7,,910,11 decellularized 마음 만들기에 효과적인 것으로 입증 되었습니다. ,,1213및 인간5,7,14,,1516. 그러나, 밸브, 심 방 및 다른 "얇은" 영역 무결성은 겪을 수 있다.
인간 크기 decellularized 심장 건설 기계는 압력 제어7,9,10,,1112 또는 주입 흐름 속도 제어13, 를 사용 하 여 돼지에서 얻어질 수 있다 17 및 압력을 사용 하 여 인간 기증자에서 제어5,7,,1415. 수직 방향5,,1516 또는 60 mmHg14 에서 제어 하는 압력을 받고 16 일 이상 80-100 mmHg에서 제어 하는 압력을 받고 4-8 일 동안 발생 하는 인간 기증자 심 혼의 decellularization . Antegrade, 압력 제어 decellularization에서 대동맥 밸브 역량 관상 동맥 관류 효율성과 대동맥 루트에서 안정적인 압력 유지에 중요 한 역할을 하고있다. 우리의 이전 작품 심장의 방향을 따라서 끝9에서 비 계 무결성 decellularization 절차 동안 관상 동맥 관류 효율이 영향을 밝혔다.
우리의 이전 작품9의 계속으로 어떤 점에서 심장 모양의 주머니 전체 심장 decellularization 향상에 추가 됩니다 새로운 개념을 소개 합니다. 대동맥 루트에서 120 mmHg에서 제어 하는 압력을 받고 반대로 지향, 가압된 파우치 안에 배치 하는 인간 심 혼의 decellularization을 설명 합니다. 이 프로토콜 모니터링 흐름 프로필 및 decellularization 절차 관상 동맥 관류 효율성과 세포 파편 제거 평가를 통해 유출 미디어 컬렉션을 포함 합니다. 생 화 확 적인 분석 실험 방법의 효과 테스트 하려면 다음 수행 됩니다.
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Protocol
모든 실험에서 텍사스 심장 연구소 윤리 위원회 지침을 준수 됩니다.
1. 기관 준비
참고: 이식에 적합 하지 않은 LifeGift, 텍사스 (http://www.lifegift.org), 비영리 기관 조달 조직 기증 협력 인간의 마음에 승인 동의 연구를 위해 사용 되었다.
- 마음을 조달, 정 맥으로 마음을 30000 U 덤플링을 달 이다. 안전 하 게 대동맥 정 맥 cardioplegia 봉합 하 고 채워 관류 라인을 연결 합니다. 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 올바른 마음을 환기 구멍 왼쪽된 우량한 폐 정 맥 또는 심장의 왼쪽된 챔버 환기 왼쪽된 심 방 돌출부를 잘라.
- Cardioplegia 또는 heparinized 염 분의 1 L 달 이다. 대동맥 아치 지점과 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC), 기타 폐 정 맥 혈관 이나 주변 조직 첨부 파일에서 마음을 출시 해 부. 아이스 염에서 잘 heparinized 심장 잠수함
- 기증 된 인간의 심장 검사 (anteriorly와 뒤로, 그림 1). 해 쟁반에 마음을 놓고 어떤 구조적 손상 또는 해 부 기형에 대 한 검사 합니다. 간 및 폐 이식에 대 한 조달 했다, 마음 짧은 열 등 한 베 나 정 맥 또는 좌 심 방 후 벽의 부재와 함께 발생할 수 있습니다.
- 가능 결함-심 방 septal 결함 (ASD), 심 실 septal 결함 (VSD), 또는 밸브 (대동맥, 폐, mitral, tricuspid) 기형에 대 한 내부 검사를 수행 합니다.
- 있으면 septal 결함, 적절 한 봉합 (그림 2A, 2B) 수정. Septal 결함의 교정은 decellularization 폐 동맥 (PA) 유출 탁도 측정을 통해 진행 상황을 모니터링 필요 합니다. Septal 결함의 교정 왼쪽 오른쪽 우회로를 제거, 따라서, PA에서 유출 관상 부 비 동을 통해 관상 동맥 순환에서 유출을 나타냅니다.
- 2-0 비단 봉합 (그림 2C)와 뛰어난 및 하 부 베 나 정 맥 선
- 후속 cannulation에 주요 PA (그림 2D)에서 대동맥 (Ao)를 해 부.
- Ao와 PA로 선박, (그림 3)의 직경에 따라 커넥터를 삽입 하 고 2-0 비단 봉합 (그림 4A)와 그들을 보호.
- 폐 정 맥 orifices 중 하나를 사용 하 여 배관 라인 왼쪽된 심 실 (LV) (그림 3) 쪽으로 왼쪽된 아 트리 움 (그림 4B)를 삽입 합니다.
- 커넥터는 Ao와 PA (그림 3)에 있는 유출 라인에 배치 하는 주입 라인을 연결 합니다.
- 거꾸로 방향 폴리에스터 주머니로 준비 된 마음 (거꾸로) 놓습니다.
- 관류 컨테이너에 마음으로 주머니를 놓고 (그림 4C) 뚜껑을 닫습니다.
- 각각의 라인을 고무 마 개 (컨테이너의 직경에 따라)에 해당 포트에 연결 하 고 폴 리 에스테 주머니 (그림 4C 와 그림 5B) 인감을 관류 컨테이너의 뚜껑에 삽입 합니다.
- PA와 라인에서 유출 확인 고무 스 토퍼의 주입 포트를 통해 1 x 버퍼링 인산 염 (PBS) (136 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4 , 증류수, pH 7.4에에서 1.8 m m KH2포4 ) perfuse 라스베가스에 삽입
- 이 흐름을 사용 하 여 청소는 맥 관 구조에 혈액의 잔여 흔적의 기관. 그들은 느슨한 될 수 흐름 관찰 되지 않는 경우 연결 라인 조입니다.
2. 시스템 설치 프로그램 및 기관 Decellularization 절차
- 생물을 조립 하 고 수직 방향 (그림 5)에 배치. 개인용 컴퓨터 (PC), 비례-적분-미분 (PID) 컨트롤러, Ao 주입에 대 한 연동 펌프, 관류 생물, LV perfusate 보존 (2 L 흡 인기 병 하단에 대 한 압력 머리 컨테이너 관류 시스템 포함 수급), 그리고 연동 펌프 압력 머리 컨테이너에서 과잉 액체를 배수 하 고 유출 펜에서 수집 하
- 고무 심장에 관류 생물 (그림 5A) 위에 고무 캡 표면 포트 주입 선, 압력 머리 선, PA 유출 라인과 생물 배수 라인을 연결 합니다.
- 대동맥 루트에서 측정 120 mmHg의 일정 한 압력 아래 마음 decellularize LV의 평균 압력은 전체 decellularization 과정을 통하여 14-18 mmHg 이내 이어야 한다.
- 다음과 같이 마음을 decellularize: 마 솔루션 (500 m m NaCl), 소형 솔루션 (20 mM NaCl) 나트륨 라우릴 황산 (1 %SDS) 솔루션의 120 h의 2 h 4 h 및 1 X PBS (그림 6A)의 120 l 최종 세척.
- 일정 한 압력 제어 (120 mmHg) 마음 decellularize Ao에 주입 유량 심장 종속적 이며, 평균 고 솔루션 98.06±16.22 mL/min, 소형 솔루션 76.14±7.90 mL/min, SDS를 위한 151.50±5.76 mL/min 및 PBS 위한 185.24±7.10 mL/min. 각 시 약의 총 소비 볼륨 평균 23.36±5.70 L 마 솔루션 및 소형 솔루션 9.13±1.26 L.
- SDS 관류의 끝까지 1 %SDS (심장 무게의 그램 당 1 L)의 최종 60 L을 recirculate. 그림 6A 보여준다 decellularization 프로세스에 대 한 타임 라인 데이터 컬렉션에 대 한 끝점을 도출: 흐름 속도 모니터링 (Ao 및 PA) 및 유출 컬렉션 (PA 및 비-PA) 압력 머리에서 decellularization 동안.
- 그것은 가정 하는 합리적 SVC, IVC는 출혈, 이후 실제 관상 동맥 관류 (그림 5B)의 결과 모든 액체는 PA에서 수집. Ao에 생긴된 솔루션의 흐름 속도 의해 perfusate PA에서의 흐름 속도 직접 나누어 관상 동맥 관류 효율성을 확인:
관상 동맥 관류 효율 =
(%). - PA와 LV와 중복에서 주입된 솔루션에서 분명 하단 96 잘 접시에 잘 당 200 μ 로드 고 280에서 흡 광도 읽고 얻은 perfusate의 비교 분석을 수행 nm. 흡 광도 값, 서로 다른 값을 시도한 후 경험적으로 선택 최고에 게 정규화 된 값을 발견 했다.
- 깨끗 한 주입된 시의 탁도 사용 하 여 제어. 유출 perfusate의 탁도 세포 파편의 유실 나타내고 과정의 추적 도구로 decellularization 동안 즉시 측정할 수 있습니다.
- 1 X PBS의 10 l 최종 세척 하는 동안 살 균 무력화 2.1% 초 산 솔루션, 10N NaOH, 0.1% 초 산 솔루션 (v/v) PBS에 선도와 무력화의 500 mL를 추가 합니다. 이 솔루션을 사용 하 여 발판 소독.
(%).3입니다. Decellularized 하트의 평가
참고: decellularization, 후 대표 마음 관상 동맥 혈관 촬영 이미징 및 생 화 확 적인 분석 실험을 위해 사용할 수 것입니다.
- 관상 동맥 맥 관 구조 intactness 검사 대표 decellularized 인간의 심장의 관상 동맥 혈관을 수행 합니다. 이미지는 짧게, 관상 동맥 ostial 정 주 오른쪽과 왼쪽 관상 동맥을 통해 대조 대리인의 주입 후 인간의 마음을 decellularized는 투시를 사용 하 여.
- 나머지 deoxyribonucleic 산 (DNA), glycosaminoglycan (개 그) decellularized 조직에 SDS 수준 평가를 19 지역에서 샘플을 decellularized 심장 해 부. 심에서 심장의 베이스를 제거 하 고 심 4 동등한 섹션 (그림 6 c)으로 해 부. 앞쪽에 및 사후 우 심 실 (RV), 앞쪽에 및 사후 LV 및 interventricular 심장 (IVS)에 각 섹션을 나눕니다. 조직 꼭대기를 포함 하는 샘플링에 대 한 LV와 RV에 해 부.
- 개 그, SDS, DNA 분석 실험 (~ 15 밀리 그램 젖은 무게의)에 대 한 조직 샘플을 잘라.
- 65 ° C에서 3 h 1 M NaOH에 샘플을 소화 하 여 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 추출 하 고 7 10 x 트리 스-EDTA (테) 버퍼와 1 M 염 산 (HCl)를 사용 하 여 pH를 조정.
- 표준 송아지 thymus dsDNA 분석 결과 키트를 사용 하 여 dsDNA 계량 ( 재료의 표참조). 중복 형광 microplate 리더를 사용 하 여 샘플 읽기 (480 nm 및 520에 방출에서 여기 nm). 시체 (시체 %)에 각 조직에 dsDNA 농도 비교 하 여 decellularized 마음에 잔여 dsDNA의 비율을 계산 합니다.
- 3 시간 동안 65 ° C에서 papain 추출 솔루션 (EDTA disodium 소금, 시스테인 HCl와 0.2 M 나트륨 인산 염 버퍼, 나트륨 아세테이트, papain)에서 조직 샘플을 소화 하 여 솔루션으로 sulfated 개 그를 가져올. (중복)에서 개 그 콘텐츠 Glycosaminoglycan 분석 결과 키트를 사용 하 여 측정 합니다.
- 열띤된 진공 및 측정 건조 중량 분석 결과 SDS에 대 한 샘플 lyophilize 각 말린된 샘플을 초순의 200 µ L을 추가 하 고 솔루션으로 잔여 SDS 추출 균질. Chloroform을이 SDS 솔루션 및 메 틸 렌 블루 솔루션 (0.01 M HCl의 1 L에 메 틸 렌 블루의 12 mg) 믹스. SDS는 methylene 청색 염료에 바인딩하여 유기 층에는 별도 것입니다.
- 흡수도 읽고 형광 microplate 리더를 사용 하 여 (655 nm) 표준 및 중복 잔여 SDS를 계산 하는 샘플의. 조직 건조 중량을이 SDS 값 정상화.
- 두꺼운 지역 (즉, LV, RV 및 심장) decellularization 후 세포 제거 확인을 비선형 광학 현미경 (NLOM)와 인간의 마음에서에서 이미지 샘플. NLOM 설치는 우리의 이전 간행물18,,1920에 상세한입니다. NLOM 어떤 외 인 얼룩 또는 염료21을 사용 하지 않고 이미지 셀, 엘라 스 틴, 콜라겐과 myosin 섬유의 2 광자 형광 (TPF)와 두 번째 고조파 생성 (SHG) 채널을 통해 우리를 수 있습니다.
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Representative Results
Antegrade 120 mmHg의 일정 한 압력 대동맥 관류와 7 일 decellularization, 후 인간의 마음 반투명 (그림 6B) 아닙니다. 마음은 조잡 한 생화학 (DNA, 개 그와 SDS) 분석 (그림 6 c) 최종 decellularized 제품 평가를 위한 19 섹션으로 해 부.
Decellularization 과정 전반에 걸쳐 다양 한 압력으로 다른 솔루션의 주입 유량 일정 유지 되었다. 점차 감소 96.68±23.54에서 80.59±12.41 mL/min (16.64%) 관류 솔루션으로 Ao (그림 7A)에 흐름 속도에서 변경 고 침투성. 반면, 흐름 속도에서 증가 71.68±10.63 110.61±14.40 mL/min (54.31%) 관류 솔루션 SDS에 당뇨에서 변경 될 때. SDS 관류 동안 주입 유량은 110±14.40와 176.31±44.03 mL/min 사이 요동 쳤 다. 유출 속도 PA (그림 7B)에서 처음 (그림 7A) 비슷한 추세를 보였다. 그러나, 35.77±9.07에서 27.08±4.09 mL/분 관상 동맥 관류 효율 감소 1 %SDS 관류 동안 유출 속도 대동맥 밸브 patency와 유사한 경향을 평가 하 사용 되었다. 효율성 맥 관 구조 (그림 ℃) 통해 끼얹는다 다른 시 약으로 시간이 지남에 따라 감소 합니다. 1 X PBS 워시의 첫 번째 시간 동안 관류 효율 원래 미리 소형 솔루션 값 복원 (1 h PBS에서 28.39±3.61% 31.02±7.16 %1-h 당뇨 대 ). 말은 관상 동맥 관류 효율성은 46.08±9.89%, 28.08±7.12%, 25.70±5.30%, 28.39±3.61% 고 솔루션, 소형 솔루션, 1 %SDS 1 X PBS, 각각 (그림 7D).
PA와 LV에서 유출 perfusate 동시에 수집 했다, 이후 그들의 파편 콘텐츠 수 (그림 8A) 분광학 흡수도 280에서 측정 하 여 비교 nm (그림 8B). PA와 각 솔루션;의 재 관류 동안 시간이 지남에 따라 감소 하는 LV에서 방류 수의 탁도 그러나, PA에서 탁도 초기 관류 기간 동안 LV에서 관찰에 비해 더 갑작스러운 색상 변화를 보였다. 마에서 소형 솔루션으로 전환 후 탁 LV와 PA 유출 1.40±0.07 (21.73% 증가)를 1.15±0.03에서 변경의 1.13±0.05에서 1.24±0.07 (9.73% 증가) 변경. 1 %SDS 관류의 첫 번째 시간 동안 탁에서에서 변경 1.17±0.04 2.77±0.15 (136.75% 증가) PA 및 1.75±0.26에 1.11±0.04 (56.65% 증가) LV 유출에 대 한. 유출 탁과 세포 파편 희미하게 사이의 상관 관계는 단백질 농도 유출 샘플에서 측정할 때 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 사용 하 여 평가 되었습니다. 6 인간 심 혼의 decellularization에서 얻은 결과 공개 단백질 농도 및 방류 수 탁도 R2 사이 선형 상관 관계 = 0.95 (그림 8C).
완료 후 전체 심장 decellularization의, 관상 동맥 혈관 촬영 그대로 관상 맥 관 구조 (그림 9)의 보존을 확인 했다. 아니 셀 존재 TPF 채널 (그림 10)에서 관찰 되었다 decellularized 인간의 마음에 두꺼운 지역 (즉, RV, 라스베가스, 그리고 심장)에서 심근 층의 비선형 광학 이미징 세포 제거 확인. 그들의 autofluorescence와 세포 (cardiomyocytes즉, 또는 심장 섬유 아 세포) 그들의 길쭉한 타원형 모양 형태학에 의해 TPF 채널에 쉽게 확인 수 있습니다. Decellularization 프로세스 및 세포질 파편 제거의 효과 보장 하기 위해, decellularized 인간의 마음 19 영역 (그림 6 c) DNA, sulfated 개 그, 그리고 그 지역에 남아 있는 SDS 수준을 계량으로 싫어할 추가 했다. 모든 지역에서 DNA 싱가포르로 심장의 10% 미만 이었다. 오른쪽 아 트리 움 (8.39%-10.38% 시체를 기준으로)와 왼쪽에 DNA 아 트리 움 (5.11%-7.60%)은 가장 높은 (그림 11A).
그림 1: 기관 조달 기관에서 싱가포르로 인간의 마음. 싱가포르로 인간의 심장의 앞쪽 및 후부 전망입니다. 파선된 영역에 관측 된 열 등 한 베 나 정 맥 및 오른쪽 아 트리 움의 일부 누락, 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대 한 검사 septal 해 부 변칙 밸브 그리고/또한. (A) 검사 경우 특허 구멍 ovale (PFO) 제시 (왼쪽과 오른쪽 아 트리 움 간의 통신). (B)는 5-0 폴 리 프로필 렌 봉합 PFO을 지속적인 패션에 적용 됩니다. (C) 오른쪽 아 트리 움은 5-0 폴 리 프로필 렌의 실행 봉합으로 닫힙니다. (D) 주요 폐 동맥은 해 부 오름차순 대동맥에서 무딘 해 부에 의해. FO: 구멍 ovale; PA: 폐 동맥; Ao: 대동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 주입 생물의 구성 요소. Decellularization 시스템은 4 포트; (A) 고무 캡으로 구성 (B) 유출 라인 폐 동맥 (PA);에 연결 되어 있어야 Luer 잠금 PA 및 대동맥 (Ao), 좌 심 실 (LV)에 대 한 삽입 라인 (D) 와 (C, F) 커넥터 (E) 주입 라인 대동맥, (G) 폴 리 에스테 주머니와 (H) 관류 컨테이너에 연결 되어 있어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 인간의 마음 cannulation 및 주입 생물 어셈블리. (A) 폐 동맥 (PA) 및 대동맥 (Ao) 개별적으로 cannulated 심장의 앞쪽 보기. (B) 후부 보기 정을 보여주는 심장의 좌 심 실 (LV) 폐 정 맥 (PV)을 통해 지시. (C) 조립 후 주입 생물 안에 인간의 마음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 압력 머리 거꾸로 지향적인된 decellularization의 시스템 설치. 완전 한 decellularization 시스템 구성 (A) : 컴퓨터, 비례-적분-미분 (PID) 컨트롤러, 펌프, 생물, 그리고 폐 동맥 (PA) 및 좌 심 실 (LV)에서 수집 하는 유출에 대 한 저수지. Ao: 대동맥. 화살표 방향 으로를 흐름을 나타냅니다. (B) 의 관류의 생물 안에 인간의 심장의 설치 및 decellularization 중 perfusate/유출의 연결된 흐름 경로 회로도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 인간 심 혼의 decellularization 절차 및 포스트 decellularization 검사의 도식 대표. Decellularization 프로시저의 (A) 도표. (B) 앞쪽 및 후부 시험 decellularized 인간의 마음 (C) 총 생 화 확 적인 분석 결과 분석에 대 한 4 개의 횡단면 (섹션 D A 섹션)에 인간의 심장의 해 부. 인간의 마음에 착 색은 잔여 lipofucin 증 착에 의해 발생 합니다. 내부 심 실 표면 또는 epicardium와 심근 착 색 일반적으로 선물 한다. 라: 좌 심; RA: 오른쪽 아 트리 움; LV: 좌 심 실; RV: 우 심 실; 개미: 앞쪽; 게시물: 후부; 하이퍼: 마; 저자: 당뇨; SDS: 나트륨 라우릴 황산 염; PBS: 인산 염 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: decellularization 중 저속 흐름 역학. (A) decellularization 솔루션 과정 대동맥으로의 주입 유량. (B) decellularization 동안 PA에서 폐수의 흐름. (C) decellularization 동안 관상 동맥 관류 효율성. (D) 다른 솔루션/시 약의 재 관류 동안 관상 동맥 관류 효율을 의미 합니다. N = 6. 데이터 대표 mean±SEM. PA: 폐 동맥; 하이퍼: 마; 저자: 당뇨; SDS: 나트륨 라우릴 황산 염; PBS: 버퍼링 인산 염; Sem의: 의미의 표준 오류입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: decellularization 중 시간 경과 셀 파편 유실. (A) PA와 비 파 (좌 심 실)에서 유출 미디어 컬렉션입니다. (B) 결과 280에서 탁도 측정의 nm. (C) 단백질 농도, 탁도 사이 선형 상관 관계가 존재 한다. n = 6 인간의 마음. 제어 깨끗 한 decellularization 솔루션을 했다. 데이터 대표 mean±SEM. PA: 폐 동맥; 하이퍼: 마; 저자: 당뇨; SDS: 나트륨 라우릴 황산 염; Sem의: 의미의 표준 오류입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: decellularized 인간의 심장의 관상 동맥 혈관 촬영 decellularization 후 thevascular patency 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 시체와 decellularized 심근에서 비선형 광학 현미경을 사용 하 여 얻은 이미지는 decellularized에 타원형 이나 길쭉한 모양 형태학 세포 (cardiomyocytes즉, 또는 심장 섬유 아 세포)의 아무 존재가 보여 LV, RV 및 심장입니다. LV: 왼쪽 심 실; RV: 우 심 실; TPF: 두 개의 광자 형광; SHG: 둘째로 고조파 생성. 일부 심장 세포는 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11: 생 화 확 적인 분석 실험 결과. (A) decellularized 조직에서 싱가포르로 심장을 기준으로 나머지 DNA. (B) 나머지 개 그 decellularized 조직에서 싱가포르로 심장을 기준으로. (C) decellularized 조직에 남아 있는 SDS. n = 6 인간의 마음. 데이터 대표 mean±SEM. 라: 왼쪽 아 트리 움; RA: 오른쪽 아 트리 움; LV: 좌 심 실; RV: 우 심 실; 개미: 앞쪽; 게시물: 후부; SDS: 나트륨 라우릴 황산 염; Sem의: 의미의 표준 오류입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 메서드 | 프로 | 콘 |
| 종래의 직 립 Langendorff 관류 | · Decellularization 동안 복구 하는 마음을 접근 하기 쉬운 | · 대동맥 심장 무게 때문에 과도 한 부담 |
| · 일정 한 압력 제어에서 SDS 관류 동안 높은 주입 유량 | ||
| · SDS 관류 동안 낮은 관상 동맥 관류 효율성 | ||
| · 정 맥 결 찰 선 위에 대동맥 폐 동맥의 부분 탈수 하 고 쉽게 오염 수 있습니다. | ||
| 거꾸로 Langendorff 관류 가압된 주머니 안에 | · 대동맥 심장 무게 때문에 해지는 부담을 최소화 | · 접근 하기 어려운 마음을 복구 하는 경우 필요 합니다. |
| · 일정 한 압력 제어에서 SDS 관류 동안 낮은 주입 유량 | ||
| · SDS 관류 동안 관상 동맥 관류 효율성 향상 | ||
| · 온 마음 이기 때문에 침수/수산화 아니 조직 밖으로 건조 됩니다. |
표 1: 종래의 직 립 관류 가압된 주머니 안에 거꾸로 Langendorff 관류 대를 사용 하 여 전체 심장 decellularization의 찬 부 양론의 요약.
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Discussion
우리의 지식을 하려면이 보고서 거꾸로 decellularization 가압된 주머니 안에 인간 심 혼의 흐름 속도 세포 파편 제거의 시간 경과 모니터링에 첫 번째 연구 이다. 심장 모양의 주머니는 심장의 방향을 decellularization 절차에 걸쳐 안정 유지합니다. 잠수 하 고 주머니 안에 전체 마음 반전 탈수를 방지 하 고 때 (심장 무게)에서 대동맥에 과도 한 부담을 최소화는 종래의 직 립 Langendorff 관류 decellularization 방법9에 비해. 이, 차례로, 관상동맥 밸브의 역량을 유지합니다.
최대 decellularization 효율성을 달성 하기 위해 관상 동맥 혈관 저항 전체 심근 통해 액체의 적절 하 고 일관 된 관류 되도록 낮은 해야 합니다. 퇴행 성 관류를 사용 하 여 전체 심장 decellularization 모델에서 액체는 뇌 실에서 축적 하 고 끌어올리고 intraventricular 압력을, 차례 차례로, 관상 동맥 혈관 저항을 증가 하 고 체액의 흐름을 제한. 관상동맥 밸브는 그대로, 비록 심 실 구멍 채우는 보조 생리 누설 하 고 차례로 심 실 벽을 압축 한다.
가압된 주머니 안에 심장 decellularizing의 우리의 기술은이 문제를 완화 하 고 decellularization 효율 증가 목적 이다. 대동맥 루트에서 120 mmHg와 주머니에 14 mmHg의 압력은 decellularization 과정 전반에 걸쳐 유지 됩니다. 이러한 압력 값은 매우 생리 적인 범위 (대동맥에 80-120 mmHg) 및 왼쪽된 심 실 확장기 말 압력2215 mmHg. 목요일 외 에 따르면 23, 1.10 mL/min에 심근 혈액 흐름 속도 범위 0.61에서 / g, 그리고 인간의 마음 무게24,25 약 245 308 g; 따라서, 생리 적 관상 동맥 흐름 속도 대 한 149.45 338.80 mL/min, 하지만 심장 무게에 따라 달라 집니다. 펜 실바 니 아에서 유출 속도 우리의 생리 적 관상 동맥 흐름 속도의 값 보다 작으면 50 mL/min은 20에서 배열 했다와 2 다른 상황에서 결과 수: 1) 심장에 솔루션의 주입 부 종 생산 하 고 있다 또한 정상적인 해 부 왼쪽된 심 실 구멍;에 관상 동맥 시스템의 배수 액체를 통해 손실 또한 2)으로 발생 하는 decellularization,. 그들의 침투성에 자연적인 증가 때문에 decellularized 벽 이 차압 혈관의 붕괴를 방지 하 고 특허 유지 하도록 수 있습니다. 또한,이 시스템 압축 심근 벽, 관상 동맥 혈관 저항을 증가 하 고 혈관 내 순환 decellularization 솔루션의 손상 없이 상대 해부학 조건에서 마음을 유지 합니다. 인간의 마음 (그림 7A)의 주입 유량 속도 프로 파일 매우 비슷합니다 우리 돼지 심장9, 우리의 거꾸로 decellularization 낮은 주입 유량에 약간의 증가 소형 관류 동안 발생과 관찰 흐름 속도 (110.61±14.40 mL/min 176.31±44.03 mL/min) 1 %SDS 관류 동안 발생 합니다. 우리의 주입 유량 (평균값 = 151.50±3.71 mL/min) 1 %SDS 동안 관류 했다 비교, 또는 인간의 마음 decellularization Guyette 그 외 여러분 보고 보다 훨씬 그러나 14 , 우리의 방법은 120 mmHg의 압력 제어를 수행 하 고 그들의 방법 사용 60 mmHg. 관류 압력에이 차이 낮은 주입 유량 높은 압력을 유지할 수 있기 때문에 우리의 기술에 대동맥 밸브 폐쇄의 우수한 효과 제안 합니다. 또 다른 가능성은 증가 관상 동맥 저항 주머니 안에 적용된 14 mmHg 압력 때문 이었다. 또한, 우리 인간의 마음 방법은 우리의 거꾸로 돼지 심장 decellularization (~ 10%에 비해 소형 솔루션 변화에 하이퍼에서 감소 하는 관상 동맥 관류 효율 (~ 30%, 그림 ℃, 7 D)의 비슷한 추세를 보였다 거꾸로 방향9대 수직 방향으로 1-2%). 그러나,이 새로운 방법 SDS 관류 동안 솔루션 관류에 비해 관상 동맥 관류 효율성 유지 수 나타나고 따라서 우리의 이전 방법 샘플 반전의 우수한. 표 1 프로 죄수 대 종래의 직 립 관류의 반전 가압된 주머니 안에 Langendorff 관류.
유량, 이외에 유출 탁도 모니터링 하는 것은 decellularization 진보와 효율성을 평가 하는 또 다른 유용한 도구 일 수 있었다. Decellularization, 동안 PA에서 방류 수의 탁도 비 파 사이트 (그림 8B)에서 유출 보다 높았다. 이 perfused의 대부분을 제안 솔루션 "적절 한" decellularization에 대 한 맥 관 구조를 통과 했다. 그러나이 위해 유효 하, 다음을 해결 해야 합니다: 간 션트, 또는 대동맥 밸브의 patency 챔버. 신중 하 고 세심 한 검사 따라서 해 부 비 conformities 인 방법의 실패를 방지 하기 위해 필요 합니다. 전체 심장 decellularization 프로세스의 탁도 프로 파일 (그림 8B) 같이 이전, 다른 perfusates9의 초기 전환 기간 동안 갑작스러운 탁 변화와 비슷한 경향을 보여주었다.
Decellularized 조직에 대 한 주요 목표 세포와 그들을 다시 높은 세포 부착, 증식, 성숙 및 기능을 달성할 수 있을 것입니다. 우리의 decellularized 조직은 성공적으로 다양 한 애플 리 케이 션26,27, 조직을 성공적으로 cellularized 했다 및 낮은 thrombogenicity를 달성에 대 한 cellularized 되었습니다 있다. Decellularized 인간 심 혼의 우리의 생화학 분석, 우리는 다른 조직 두께 19 영역 평가. DNA와 decellularized 조직에 SDS 다양, 오른쪽과 왼쪽 안마당에서 얻은 높은 값. 이 거꾸로 구성, 세포 파편 주머니의 하단에 갇혀 있었고 어떤 점에서 또는 외부 압력 흐름을 감소 심장의 방향 때문일 수 있습니다. 관류 decellularization 그대로 coronaries와 지류를 포함 하 여 손상 되지 않은 심장 구조에 의존 합니다. 이 장기는 다 장기 기증자에서 조달, 이러한 마음 그들의 심 방 제거의 큰 부분 일반적으로 있다. 이러한 기관 및 심 방 벽의 복구의 준비 하는 동안 decellularization 솔루션의 흐름을 위태롭게 하는이 지역의 관개에 중단이 했다. 비 관류 심장 decellularization에 대 한 다른 연구 그룹 쥐28, 돼지29,30 에 각각 싱가포르로 심장에 비해 인간의31 남은 DNA를 2-6%를 보고 했다. 그러나 그들은 동결-해 동28,,2930를 사용 하는, 효소29,30 및 혈 청31 보다 더 큰 정도로 ECM을 손상 될 수 있습니다 그들의 decellularization 프로토콜에 우리의 관류 기반 기술입니다. 적절 하 게 이러한 한계를 해결 하는 방법을 개발 하는 것은 중요 한 될 것입니다.
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Disclosures
테일러 박사는 창시자 그리고 Miromatrix 의료 주식회사에서 주주 이 관계는 상충 정책에 따라 관리 하는 미네소타의 대학 및 텍사스 심장 연구소; 다른 작가를 공개 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
이 연구는 휴스턴 기부 그랜트와 텍사스 신흥 기술 기금에 의해 지원 되었다. 저자 인정 기관 조달 기관 LifeGift, 주식 회사와 본이 연구 가능한 만들기 위한 기증자의 가족.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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