Summary
このメソッドにより、高浸透圧刺激とイオン洗剤最小限オルガン マトリックス破壊の灌流に基づく単純なプロトコルを使用して複雑な固体器官の decellularization です。流れのダイナミクスと細胞残骸の流出のリアルタイム モニタ リングと加圧のポーチの中の人間の心の新しい decellularization 技術が装備されています。
Abstract
末期心不全患者のための究極のソリューションは、臓器移植です。しかし、ドナー心は限られて、免疫抑制は必須であり最終的に拒絶反応が発生することが。機能を作成して、自家バイオ人工心臓は、これらの課題を解決できます。足場と細胞から成る心臓の立体組織自動製造は 1 つのオプションです。マイクロおよびマクロ アーキテクチャと同様に、組織固有の構成と自然な足場は、人間や豚などの大型動物から decellularizing 心によって取得できます。Decellularization は、3 D の細胞外マトリックスと血管系を維持すると、後で timepoint で「cellularization」を許可する細胞の残骸洗浄を含みます。複雑な器官の血流 decellularization を見つける私たちの小説を生かすことが可能、内部加圧ポーチ、逆にそれらを配置することによって非可移植性の人間の心を decellularize により「生理」手法を開発しました。制御圧力下での配向。加圧ポーチを使用する目的は、閉めたままにしておくと心筋灌流を改善する大動脈弁に圧力勾配を作成します。流動ダイナミクスと流体の流入と流出の破片の両方を監視することができました decellularization 中細胞の残骸除去の同時評価は単純な心臓の修復のいずれかを使用ことができる足場を生成するため (例えばパッチとしてまたはバルブ足場) または全体器官足場として。
Introduction
心不全は、患者の高い死亡率に します。末期心不全の究極の治療法の選択肢は、同種移植です。ただし、移植ドナー臓器不足のため長い待ちリストがある、患者の顔移植後慢性臓器拒絶反応1,2生涯免疫抑制からその範囲のハードルします。患者さん自身で脱人間サイズ心の再作成によって生体機能心細胞がこれらのハードル3を回避できます。
主要なステップ「エンジニア リング」で心が適切な血管および実質の構造、構成および配置をガイドするには関数と足場の作成と配信の細胞の組織。適切な枠組みの存在下で足場に播種された細胞環境を認識し、その臓器の一部として予想される関数を実行します。我々 の意見では、脱臓器細胞外マトリックス (dECM) には理想的な足場の必要な特性が装備されています。
本質的な血管を活用し、複雑な全体器官 decellularization 達成できる順行または逆行性灌流4繊細な 3 D 細胞外マトリックスと血管2、維持しながら携帯電話のコンポーネントを削除するには 5,6,7。それは生体内で、養分分布と廃棄物の除去8の機能血管系バイオ エンジニア リング全臓器だけで重要です。Decellularization 冠動脈灌流ラット4、または豚4,7,9,10,11 から脱心の作成に効果を発揮する実証されています ,12,13, と人間5,7,14,,1516。まだ、バルブ、心房および他の「薄い」地域の整合性は苦しむことができます。
人間サイズ脱心臓の足場豚圧力制御7,9,10、11,12または注入流れ率コントロール13,を使用して得られる17および圧力を使用して人間のドナーから5,7,14,15を制御します。人間のドナー心の decellularization 発生する縦方向5,,1516または 60 mmHg14で制御圧力の下で 16 日間で 80-100 mmHg で制御圧力の下で 4-8 日間.順行、圧力制御 decellularization の下では、大動脈弁能力は、冠灌流効率と大動脈のルートで安定した圧力を維持する上で重要な役割を果たしています。我々 の以前の仕事では、decellularization プロシージャしたがって最後9の足場の整合性の中に心の向きが、冠灌流効率の影響を及ぼすことを明らかにしました。
私たちの以前の仕事9の続きは、として全体心 decellularization を改善するために膜のようなポーチを追加する前記斬新なコンセプトを紹介します。加圧袋は、反比例指向の内部と大動脈のルートで 120 mmHg で制御圧力の下で人間の心の decellularization について述べる.このプロトコルには監視フロー プロファイルと冠灌流効率と細胞の破片の除去を評価する decellularization プロシージャ全体の流出媒体のコレクションが含まれます。生化学的アッセイは、手法の有効性をテストするのには、実行されます。
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Protocol
すべての実験は、テキサス心臓研究所から倫理委員会ガイドラインに従います。
1. 臓器準備
注: 寄付の LifeGift、テキサス州 (http://www.lifegift.org) の非営利臓器調達機関連携人間の心移植には適していない研究承認の同意を得て使用されました。
- 心を調達するには、心に 30,000 の U ヘパリン静脈内注入します。安全にカニュラ大動脈にカニューレを縫合し、固定灌流線を接続します。下大静脈 (IVC) 右心を発散するために穴を開けます。左上肺静脈や左心耳、左心室を発散するためにカットします。
- 心術のヘパリン生理食塩水 1 L を吹き込みます。血管や周囲の組織添付ファイルから心を解放する他の肺静脈、上大静脈 (SVC) と大動脈弓枝を解剖します。アイスの食塩でよくヘパリンの心に浸します。
- 寄付された人間の心検査 (前方と後方に,図 1)。解離性のトレイに中心を置き、構造上の損傷または解剖学的奇形の検査します。肝臓や肺移植のため調達された、中心部は短い下大静脈や左心房後壁の不在の場合があります。
- 心房中隔欠損症 (ASD)、心室中隔欠損 (VSD)、またはバルブ (肺、大動脈弁、僧帽弁、三尖弁) 奇形 - 可能な欠陥の内部検査を実行します。
- 中隔欠損が存在する場合は、適切な縫合糸 (図 2 a、2 b) で修正します。肺動脈 (PA) 流出濁度測定による decellularization の進行状況を監視する中隔欠損の修正です。隔欠損症の補正は左右短絡を削除します、したがって、PA からの流出は、冠静脈洞を介して冠循環での流出を表しています。
- 2-0 絹糸 (図 2) と優れたと劣るの上大静脈を結紮します。
- その後穿刺のメイン PA (図 2 D) から大動脈 (Ao) を解剖します。
- Ao と PA に (図 3) 容器の直径に基づいてコネクタを挿入し、2-0 絹縫合糸 (図 4 a) で安全を確保します。
- 肺静脈開口部のいずれかを使用してチューブ (図 4 b) 左心房と左心室 (LV) (図 3)、方行を挿入します。
- Ao と流出の行 PA (図 3) の 1 つには、コネクタに輸液ラインを接続します。
- 準備された心を逆向きでポリエステル ポーチ (逆さまに) 配置します。
- 灌流コンテナーに心でポーチを配置し、蓋 (図 4) を閉じます。
- (コンテナーの直径に基づいて) ゴム栓のそれぞれのポートにそれぞれの線を接続し、(図 4および図 5 b) のポリエステルの袋を密封するために灌流容器のふたにそれを挿入します。
- 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (136 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4蒸留水、pH 7.4 で 1.8 mM KH2PO4 ) 流出 PA からラインを確認するゴム栓の注入ポートを介して灌流します。左に挿入
- この流れを使用すると、血管の血液の残留痕跡器官をきれいにします。流れを見られない場合は、彼らは緩いかもしれない接続線を締めます。
2. システムのセットアップとオルガン Decellularization 手順
- バイオリアクターをアセンブルして縦方向 (図 5) を配置します。灌流システムには、パーソナル コンピューター (PC)、比例・積分・微分 (PID) 制御、Ao 注入の蠕動性ポンプ、灌流型バイオリアクター、LV による固定 (2 L 吸引ボトル底の圧力ヘッド コンテナーが含まれていますsidearm)、および圧力ヘッド容器から余分な水分を排出し、ペンシルバニア州から流出を収集する蠕動性ポンプ
- ゴム隔壁、輸液ライン、圧力ヘッド ライン、PA 流出ライン、バイオリアクター ドレイン線を灌流型バイオリアクター (図 5 a) の上に置かれたゴム キャップ表面ポートに接続します。
- 大動脈ルートで測定 120 mmHg の一定圧力の下で心を decellularize します。LV の平均圧力は、全体 decellularization プロセス全体で 14-18 mmHg 内する必要があります。
- 次のように心を decellularize: 高張液 (500 mM NaCl)、低張液 (20 mM NaCl)、ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (1 %sds) ソリューションの 120 h の 2 h の 4 h と 1 × PBS (図 6 a) の 120 l の最終的な洗浄。
- 吐出し圧力一定制御 (120 mmHg) の下で心を decellularize します。Ao に輸液流量は心に依存しは、平均では、高張液 98.06±16.22 mL/分、低張液 76.14±7.90 mL/分、SDS の 151.50±5.76 mL/min と PBS 185.24±7.10 mL/分。高張液の 23.36±5.70 L、9.13±1.26 L 低張液の各試薬消費量の平均値します。
- SDS 灌流末まで 1 %sds (心重量のグラム当たり 1 L) の最終 60 L を循環させます。図 6 aは、データ収集のためのエンドポイントを引き出す decellularization プロセスのタイムラインを示しています: モニタリング (Ao と PA) および流出コレクション (PA と非 PA 圧力ヘッドから decellularization の間) の流れ。
- SVC と下大静脈を結紮、それは仮定する合理的な実際の冠動脈灌流 (図 5 b) の結果は、すべての流体が PA から収集されました。Ao に直接注入溶液の流量による PA 外液の流量を割って冠灌流効率を決定します。
冠動脈灌流効率 =
(%)。 - 透明な底の 96 ウェル プレートのウェルあたり 200 μ L をロードして 280 吸光度を読み PA と LV と重複して注入ソリューションから得られる出納の比較分析を行う nm。正規化された値の最高を与えるため経験的を選択した異なる値を試した後、吸光度値が見つかりました。
- コントロールとして、きれいな注入された試薬の濁度を使用します。流出液の濁度は、細胞の残骸のウォッシュ アウトを表し、プロセスのトラッキング ツールとして decellularization 中に即座に定量化することができます。
- 1x PBS の 10 l、最終洗浄中に 500 mL の滅菌中和 2.1% 過酢酸酸溶液、PBS で 0.1% 過酢酸酸ソリューション (v/v) につながる、10 n NaOH で中和を追加します。このソリューションを使用して、足場を滅菌します。
(%)。3. 脱心の評価
注: decellularization 後、代表的な心は冠動脈造影画像・生化学アッセイに使用されます。
- 冠動脈の血管の厳守を調べる代表的な decellularized の人間の心の冠動脈造影検査を実行します。簡単に言えば、メイン右と左冠動脈冠動脈入口部カニューレを通して造影剤の注入後、人間の心を脱することが、イメージ透視装置を使用して。
- 残りのデオキシリボ核酸 (DNA)、グリコサミノグリカン (GAG) と脱組織 SDS レベルを評価する 19 の地域からサンプルを取得する decellularized の心臓を解剖します。心室から心のベースを削除し、4 つの等しいセクション (図 6) に心室を解剖します。前部と後部の右心室 (RV)、前部と後部左心室と心室中隔 (IVS) に各セクションを分割します。頂点を含む組織がサンプリングの左心室と右心室に解剖しました。
- DNA、ギャグおよび SDS 試金 (湿重量の 〜 15 mg) のための組織サンプルをカットします。
- 65 ° C で 3 時間 1 M NaOH でサンプルの消化によって二本鎖 DNA (dsDNA) を抽出し、7 10 x トリス EDTA (TE) バッファーと 1 M 塩酸 (HCl) を使用して pH を調整します。
- DsDNA アッセイ キットを用いた標準的な子牛の胸腺 dsDNA の定量化 (材料の表を参照してください)。蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して重複のサンプルを読む (480 nm および 520 放射で励起 nm)。死体 (脳死 %) を各組織に dsDNA 濃度を比較することによって decellularized の心の中の残留 dsDNA の割合を計算します。
- 3 時間の 65 ° C でパパイン抽出溶液 (0.2 M リン酸ナトリウム EDTA 二ナトリウム塩、システイン塩酸バッファー、酢酸ナトリウム、パパイン) で組織サンプルの消化によってソリューションに硫酸化ギャグを取得します。グリコサミノグリカンのアッセイ キットを使用して (重複) でギャグ コンテンツを測定します。
- 温水真空とメジャーの乾燥重量で SDS 試金のためのサンプルを凍結乾燥します。乾燥に各サンプルに純水 200 μ L を追加し、ソリューションに残留の SDS を抽出する均質化します。クロロホルムにこの SDS ソリューションとメチレン ブルー溶液 (0.01 M 塩酸の 1 L のメチレン ブルーの 12 mg) を混ぜます。SDS は、メチレン ブルー色素に結合して有機層の分離されます。
- 蛍光マイクロ プレート リーダーを使用して吸光度を読む (655 nm) 基準と残留の SDS を計算する重複のサンプルの。組織の乾燥重量にこの SDS 値を正規化します。
- Decellularization 後の携帯電話の削除を確認する非線形光学顕微鏡 (NLOM) と人間の心の厚い部分 (すなわちLV、RV および中隔) から画像のサンプル。NLOM セットアップは、私たち以前の出版物18,19,20の詳細です。NLOM は、外因性の汚れや色素21を使用せずイメージ セル、エラスチン、コラーゲンとミオシン繊維の 2 光子蛍光 (TPF) と第二高調波発生 (SHG) チャネルを通じて私たちをできます。
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Representative Results
120 mmHg の一定の圧力下で順行大動脈送血法を 7 日間 decellularization 後、は、人間の心は、半透明 (図 6 b) をなった。心は、生化学 (DNA、ギャグおよび SDS) 分析最終 decellularized 製品を評価する (図 6) のための 19 のセクションに肉眼的解剖されました。
Decellularization プロセス全体にわたって注入流量、圧力など様々 なさまざまなソリューションが一定に保たれました。徐々 に 96.68±23.54 から灌流液として 80.59±12.41 mL/分 (16.64%) に減少した Ao (図 7 a) に流量は高張から低張に変更。対照的に、流量は 110.61±14.40 mL/分 (54.31%) に 71.68±10.63 から増加した灌流液は SDS に低張性から変更されたとき。SDS 灌注入流量変動 110±14.40 と 176.31±44.03 mL/分の間。PA (図 7 b) から流出率は当初 (図 7 a) 同様の傾向を示した。ただし、35.77±9.07 から冠灌流効率 27.08±4.09 mL/分に低下した 1 %sds 灌流出率は、大動脈弁の開存性と同様の傾向を評価する使用されました。効率は、異なる試薬 (図 7) 血管を介して灌流として時間の経過とともに減少しました。灌流効率 1 × PBS 洗浄の最初の時間の間に元の事前低張液値に復元 (1 h PBS で 28.39±3.61% 31.02±7.16%対1 h 低張性)。平均の冠動脈灌流効率が 46.08±9.89%、28.08±7.12%、25.70±5.30%、28.39±3.61% 高張液、低張液、1 %sds および 1x PBS、それぞれ (図 7)。
PA と LV からの流出液は、同時に収集されたので、破片コンテンツ可能性があります (図 8 a) の分光吸光度 280 測定比較 nm (図 8 b)。各ソリューションの灌流中に時間をかけて減少した PA と LV から排水の濁度しかし、PA から濁度は、初期灌流期間中 LV から観察したものと比較してより急激な色の変化を示した。低張液、高張から切り替えて後、PA 流出 1.40±0.07 (21.73% 増) に 1.15±0.03 から変更と LV の濁度は、1.13±0.05 から 1.24±0.07 (9.73% 増) に変更。1 %sds 灌流の最初の 1 時間、濁度は、PA と 1.75±0.26 に 1.11±0.04 (56.65% 増) LV 排水のための 2.77±0.15 (136.75% 増) に 1.17±0.04 から変更。流出サンプルの蛋白質の集中の定量化を行ったときビシンコニン酸 (BCA) の蛋白質の試金を使用して流出濁水および細胞残骸のウォッシュ アウトの相関を評価しました。6 の人間の心の decellularization から得られた結果を明らかにした蛋白質濃度と R2と排水の濁度の線形相関 = 0.95 (図 8)。
全体心 decellularization の完了後、冠動脈造影はそのまま冠動脈血管 (図 9) の保全を確認しました。脱人間の心の厚い地域 (すなわち、右心室、左心室と中隔) 心筋層の非線形光学イメージングは、TPF チャンネル (図 10) で細胞の存在が認められず、細胞の除去を確認しました。(すなわち、心筋細胞や心臓線維芽細胞) 細胞の蛍光は、楕円形と細長い形状の形態で TPF チャネルで簡単に識別できます。Decellularization プロセスおよび細胞残骸の取り外しの効果を確保するため decellularized の人間の心がさらに DNA、硫酸化ギャグと SDS のそれらの領域の残りのレベルを定量化するために 19 の領域 (図 6) に興行収入。すべての地域で DNA は死体心の 10% 未満だったDNA 右心房 (8.39%-10.38% 死体を基準)、左心房 (5.11%-7.60%) が高い (図 11 a)。
図 1: 臓器調達機関から死体の人間の心です。死体の人間の心の前部と後部の眺め。下大静脈と右心房の一部が表示されない、破線の領域で観測されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 検査中隔バルブの解剖学的異常および/または。(A)検査孔開存 (PFO) があれば (右および左心房間の通信)。(B) 5-0 ポリプロピレン縫合糸が PFO を閉じるに連続的な方法で適用されます。(C)右心房が 5-0 ポリプロピレンの実行縫合糸で閉じています。(D)肺動脈上行大動脈から鈍的切離による解剖です。FO: 卵円孔;PA: 肺動脈;Ao: 大動脈。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 注入型バイオリアクターのコンポーネント。(A) 4 ポートとゴムキャップの decellularization システムを構成します。肺動脈 (PA); に接続する(B)流出線PA の大動脈 (Ao)、 (D)左心室 (LV)、挿入行ロック(C, F)コネクタ(E)注入は、大動脈、 (G)のポリエステル袋、および(H)灌流コンテナーに接続するラインします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 人間の心挿管および注入バイオリアクター アセンブリ。(A)肺動脈 (PA) と個別に cannulated 大動脈 (Ao) を示す心臓の前面像。(B)カニューレを示す心臓の後方ビューは肺静脈 (PV) を介して左心室 (LV) に送られます。アセンブリ後注入型バイオリアクター内(C)人間の心。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 圧力と逆方向 decellularization のシステム セットアップします。(A)完全な decellularization システムから成るです: コンピューター、比例・積分・微分 (PID) コント ローラー、ポンプ、バイオリアクター、および肺動脈 (PA) と左心室 (LV) から、排水を収集するための貯水池。Ao: 大動脈。矢印は流れの方向を示します。(B)内部灌流型バイオリアクターの人間の心のセットアップおよび出納/排水 decellularization 中の関連付けられたフロー パスの概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 人間の心の decellularization プロシージャとポスト decellularization 試験の概略図。(A) decellularization プロシージャの図。(B)前方と後方学 decellularized 人間の心。(C)は総 4 セクション (セクション D にセクション A) 生化学的な試金分析のために人間の心臓の解剖です。人間の心のカラーリングは、残留 lipofucin 沈着が原因です。着色は通常、心室の内面または心外膜と心筋の間の境界線。LA: 左房;RA: 右房;LV: 左心室;RV: 右心室。Ant: 前部;投稿: 後部;ハイパー: 高張;ハイポ: 低張性;SDS: ナトリウム dodecyl 硫酸塩;PBS: リン酸緩衝生理食塩水です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: decellularization の中にコマ撮り流動ダイナミクス。(A) decellularization ソリューションの手順中に大動脈の注入流量。(B)は、decellularization の中に、PA から排水の流量します。(C) decellularization 時の冠灌流効率。(D)は、異なるソリューション/試薬の灌冠灌流効率を意味します。N = 6。データを表す mean±SEM PA: 肺動脈;。ハイパー: 高張;ハイポ: 低張性;SDS: ナトリウム dodecyl 硫酸塩;PBS: リン酸緩衝生理食塩水;SEM: 平均の標準誤差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: decellularization の中にコマ撮り細胞残骸ウォッシュ アウト。(A)流出メディア コレクション PA と非 PA (左心室) から。280 濁度測定結果(B) nm。(C)蛋白質濃度と濁度の間に線形相関が存在します。n = 6 の人間の心。コントロールは、きれいな decellularization のソリューションでした。データを表す mean±SEM PA: 肺動脈;。ハイパー: 高張;ハイポ: 低張性;SDS: ナトリウム dodecyl 硫酸塩;SEM: 平均の標準誤差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 脱人間の心の冠動脈造影が decellularization 後 thevascular の開存性を確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 死体と脱心筋から非線形光学顕微鏡像、脱で楕円形または細長い図形形態と (すなわち、心筋細胞や心臓線維芽細胞) の細胞の存在を示さないLV, RV および中隔。LV: 左心室;RV: 右心室。TPF: 2 光子蛍光;SHG: 第二高調波発生。一部の心筋細胞は、矢印で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: 生化学的アッセイ結果。(A)脱組織で死体の中心を基準にして残りの DNA。(B)残りの脱組織で死体の中心を基準にしてギャグ。(C)残り SDS 脱組織。n = 6 の人間の心。データを表す mean±SEM LA: 左房;。RA: 右房;LV: 左心室;RV: 右心室。Ant: 前部;投稿: 後部;SDS: ナトリウム dodecyl 硫酸塩;SEM: 平均の標準誤差です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| メソッド | プロ | コン |
| 従来の直立した蛍光灌流 | ·Decellularization 中に修復する中心部にアクセスしやすい | ·心重量により大動脈に過大な負担 |
| ·吐出し圧力一定制御の下で SDS 灌高注入流量 | ||
| ·SDS 灌低冠動脈灌流効率 | ||
| ·大動脈・肺動脈カニューレ結紮線の上の部分は、脱水を取得し、簡単に汚染されること | ||
| 灌流蛍光倒立加圧ポーチ中 | ·心重量により大動脈に及ぼすひずみを最小限に抑える | ·アクセスするは難しい心の場合は修理が必要です。 |
| ·低い注入圧一定制御の下で SDS 灌流量 | ||
| ·SDS 灌冠灌流効率の向上 | ||
| ·以来、心臓全体が冠水した水和組織は乾燥しません。 |
表 1: 全体心 decellularization 加圧ポーチ内倒立蛍光灌流対従来の直立灌流を使用しての長所と短所の概要。
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Discussion
私たちの知る限り、これはフロー率および細胞残骸の取り外しの時間経過モニタリングと加圧のポーチの中の人間の心の反転レポート decellularization に最初の研究です。心膜のようなポーチは、decellularization プロシージャ全体で安定した心の向きを保持します。水没しポーチの中の全体の心を反転脱水を防ぐことができ、とき (心重量) から大動脈に過大な負担を最小限に抑える、従来直立蛍光灌流 decellularization 方法9と比較して。これは、順番に、大動脈弁の能力が保持されます。
最大 decellularization の効率を達成するため、冠血管抵抗が低適切で一貫した流体全体の心筋血流を確保するため必要があります。全体心 decellularization モデルで逆行性血流を使用して、流体は心室に蓄積し、ターンでは、冠動脈の血管抵抗が増加し、流体の流れを制限内圧を高めます。にもかかわらず、大動脈弁はそのまま、心室キャビティは生理漏れにセカンダリを塗りつぶし、順番心室壁が圧縮されます。
Decellularizing 加圧ポーチの内側の心の我々 の技術は、この問題を軽減するため、decellularization を効率化する対象です。大動脈ルートで 120 mmHg とポーチで 14 mmHg の圧力が decellularization プロセス全体にわたって維持されます。これらの圧力値が非常に生理学的な範囲 (大動脈内 80-120 mmHg) と左心室拡張末期圧2215 mmHg の近くにあります。マーシーらによると23日 1.10 mL/分 0.61 から心筋局所血流率の範囲/約 245 に 308 g; は、人間の心重量24,25 g、したがって、冠血流の生理学的な率は約 149.45 に 338.80 mL/分ですが、心重量によって異なります。PA からの流出率冠血流の生理学的な率の値より少ない値である 50 mL/分 20 から 〜 し、2 のさまざまな状況に起因している可能性があります: 1) 心にソリューションの注入は、浮腫を生産し、通常もある解剖学的冠動脈左心室キャビティ; システムの排水液体はまたによって失われた 2) と、decellularization が発生すると、透磁率.の自然増加のため decellularized の壁この圧力差は血管の崩壊を防ぎ特許を維持することができます。さらに、このシステムは、冠血管抵抗を増加し、decellularization のソリューションの血管内の循環を損なう心筋壁を圧縮することがなく相対的な解剖学的条件の心を保持します。人間の心 (図 7 a) の注入流量率プロファイルは非常に低張性灌流とのわずかな増加の間に発生する低い注入流量とブタ心臓9の私たちの逆 decellularization で見ましたに似てフロー レート (176.31±44.03 mL/分 110.61±14.40 mL/分) が 1 %sds 灌流中に発生します。私たちの輸液の流量 (平均値 = 151.50±3.71 mL/分) 1 %sds の中に灌流が匹敵する、か Guyetteらによって報告された人間の心の decellularization のそれよりもさらに少ない14 120 mmHg の圧力制御の手法を実行し、彼らの方法は、60 mmHg を使用します。灌流圧の違いは低い輸液流量より高い圧力を維持できるので我々 の手法では大動脈弁の閉鎖の優れた有効性を示唆しています。別の可能性は、冠動脈の抵抗の増加は、袋の中 14 mmHg 圧力が原因だったことです。また、私たち人間の心法はハイパー低張液変更する私たちの倒立のブタ心臓 decellularization (~ 10% と比較されたときから冠灌流効率 (~ 30%、図 7、 7 D) の減少のと同様の傾向を示した逆向き9対縦方向で 1-2%)。しかし、この手法は SDS 灌の灌流に匹敵する冠動脈灌流効率を保持できる、従って現われるサンプル反転の私達の従来の方法よりも優れて。表 1一覧長所と短所対従来の直立した灌流の倒立蛍光灌流圧ポーチの中。
流量、に加えて流出濁度監視 decellularization の進捗状況と効率を評価するもう一つの便利なツール可能性があります。Decellularization、中に PA から排水の濁度は非パ (図 8 b) 廃液のそれより高かった。灌流のほとんどが示唆されたソリューションが「適切な」decellularization の血管を通過しました。これを有効にする、次を対処しなければならないまだ: 間シャント、または大動脈弁の開存の部屋。慎重かつ細心の検査は、したがって解剖学的不適合による故障を防ぐために必要です。心をこめて decellularization プロセスの濁度プロファイル (図 8 b) は、以前に示すように、異なる perfusates9の初期移行期間中に濁度の急激な変化、同様の傾向を示した。
脱組織の主な目標は、細胞でそれらを再作成し高い細胞接着、増殖、成熟、機能を達成することができます。私たちの decellularized の組織は、さまざまなアプリケーション26,の27組織が正常に cellularized され、低い血栓を達成正常に cellularized されています。脱人間の心の私達の生化学的解析、異なる組織の厚さ 19 地域を評価されます。DNA と SDS 脱組織では、右および左心房で得られた最大の値と様々 です。逆さまに構成、前記細胞の残骸は、袋の下部に閉じ込められていたまたは外部圧力が流量を減少でハートの向きがある可能性があります。灌流 decellularization は、破損していない心の構造、そのまま冠動脈の支流などに依存します。これらの器官は多臓器ドナーから手に入れられるようこれら心通常削除の心房の大部分があります。これらの臓器や心房の壁の修復の準備中、decellularization ソリューションの流れを保ち、これらの地域の灌漑の中断があった。非灌流心 decellularization の他の研究グループは、ラット28、ブタ29,30とそれぞれの死体心に比べて人間31 2-6% 残っている DNA を報告しています。しかし、彼らは凍結融解28,29,30を使用酵素29,30と血清31 decellularization プロトコルよりも大きい程度に ECM に損傷を与える可能性がありますの私たちの灌流ベースの手法。適切にこれらの制限に対処する方法の開発が重要です。
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Disclosures
博士はテイラーが創設者、Miromatrix、株式会社の株主この関係は、ミネソタ大学とテキサス心臓研究所での利害の対立の方針に基づき管理されます。他の著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
この研究は、ヒューストン基金助成金とテキサスの新興技術基金によって支持されました。著者認める臓器調達機関株式会社 LifeGift、この研究を可能にするためドナーの家族。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
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