Summary
Denne metode giver mulighed for decellularization af en kompleks solid orgel ved hjælp af en enkel protokol baseret på osmotisk chok og perfusion af Ioniske vaskemiddel med minimal orgel matrix forstyrrelser. Det består af en roman decellularization teknik til menneskers hjerter inde en trykisoleret pose med real-time overvågning af flow dynamics og cellular vragdele udstrømning.
Abstract
Den ultimative løsning til patienter med slutstadiet hjertesvigt er organtransplantation. Men donor hjerter er begrænset, immunosuppression er påkrævet, og i sidste ende afvisning kan forekomme. At skabe en funktionel, kunne autolog bio-kunstige hjerteklapper løse disse udfordringer. Biofabrication af et hjerte består af stillads og celler er en mulighed. En naturlig stillads med væv-specifikke sammensætning samt mikro - og makro-arkitektur kan fås ved decellularizing hjerter fra mennesker eller store dyr som grise. Decellularization indebærer udvaskning celleaffald samtidig bevare 3D ekstracellulære matrix og vaskulatur og så "cellularization" på et senere tidspunkt. Kapitalisering på vores roman at finde denne perfusion decellularization af komplekse organer er muligt, vi udviklet en mere "fysiologisk" metode til at decellularize ikke-ender menneskers hjerter ved at placere dem inde i et trykisoleret pose, i et omvendt orientering, under kontrollerede pres. Formålet med ved hjælp af en trykisoleret pose er at skabe pres forløb på tværs af aortaklappen at holde det lukket og forbedre Myokardie perfusion. Samtidige vurdering af flow dynamics og celleaffald fjernelse under decellularization tillod os at overvåge både væske tilstrømning og debris udstrømning, derved skabe et stillads, der kan anvendes enten til simple hjerte reparation (f.eks. som en patch eller ventil stillads) eller som en helhed-orgel stillads.
Introduction
Hjertesvigt fører til høj dødelighed hos patienter. Den ultimative behandlingsmulighed for slutstadiet hjertesvigt er allo-transplantation. Men der er en lang ventetid-liste for transplantation på grund af manglen på donor organer, og patienter ansigt efter transplantation hæk der spænder fra livslang immunosuppression til kronisk orgel afvisning1,2. Bioteknologi funktionelle hjerter af genopretning decellularized menneskelig størrelse hjerter med en patients egne celler kunne omgå disse forhindringer3.
Et stort skridt i "manipulation" et hjerte er oprettelsen af et stillads med passende kar og parenkymalt struktur, sammensætning og funktion til at guide tilpasningen og organisering af leverede celler. Tilstedeværelse af en passende ramme, bør celler seedede på skafottet genkende miljøet og udføre den forventede funktion som medlem af dette organ. I vores udtalelse består decellularized orgel ekstracellulære matrix (dECM) de nødvendige Karakteristik af det ideelle stillads.
Ved at udnytte iboende Vaskulaturen, kan komplekse hele-orgel decellularization opnås via antegrad eller retrograd perfusion4 til at fjerne blodlegemers samtidig bevare delikat 3D ekstracellulære matrix og Vaskulaturen2, 5,6,7. En funktionel Vaskulaturen er vigtigt i bioteknologi hele organer netop som det er i vivo, næringsstof i distributionen og bortskaffelse8. Koronar perfusion decellularization har vist sig for at være effektiv i at skabe decellularized hjerter fra rotter4eller svin4,7,9,10,11 ,12,13, og mennesker5,7,14,15,16. Endnu, integriteten af ventilerne, forkamre og andre "tynde" områder kan lide.
Human-størrelse decellularized hjerte stilladser kan fås fra svin ved hjælp af pres kontrol7,9,10,11,12 eller infusion flow sats kontrol13, 17 og fra menneskelige donorer ved hjælp af pres styre5,7,14,15. Decellularization af menneskelige donor hjerter sker over 4-8 dage under pres kontrolleret på 80-100 mmHg i opretstående orientering5,15,16 eller over 16 dage under pres kontrolleret på 60 mmHg14 . Under antegrad, pres-kontrollerede decellularization, spiller aortaklappen kompetence en afgørende rolle i at opretholde koronar perfusion effektivitet og stabil trykket i aorta-roden. Vores tidligere arbejde afslørede, at orienteringen af hjertet påvirker dens koronar perfusion effektivitet under decellularization proceduren og derfor stillads integritet i slutningen9.
Som en fortsættelse af vores tidligere arbejde9introducerer vi en roman koncept, hvori en hjertesækken-lignende pose er tilføjet for at forbedre hele-hjerte decellularization. Vi beskriver decellularization af menneskelige hjerter placeret inde trykisoleret poser, omvendt orienterede, og under pres kontrolleret på 120 mmHg aorta-roden. Denne protokol omfatter overvågning flow profil og samling af udstrømning medierne i hele decellularization proceduren til at evaluere koronar perfusion effektivitet og celle debris fjernelse. Biokemiske analyser udføres derefter for at teste effektiviteten af metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter levet op til de etiske udvalg retningslinjer fra Texas Heart Institute.
1. orgel forberedelse
Bemærk: I samarbejde med LifeGift, en nonprofit orgel indkøb organisation i Texas (http://www.lifegift.org), doneret menneskers hjerter ikke egnet til transplantation blev brugt til forskning med godkendte samtykke.
- For at skaffe hjerter, intravenøst indgyde 30.000 U heparin til hjerter. Sikkert sutur cardioplegia kanyle i aorta og vedhæfte en fastspændt perfusion linje. Perforere den ringere vena cava (IVC) at lufte de rigtige hjerte. Skære enten venstre superior pulmonal vene eller den venstre atriale vedhæng til at lufte de venstre kamre af hjertet.
- Indgyde 1 L af cardioplegia eller heparinized saltvand. Dissekere aortabuen grene, overlegen vena cava (SVC) og andre pulmonal venerne til at frigive hjertet fra enhver vaskulære eller omkringliggende væv vedhæftet fil. Dykke godt heparinized hjertet i Ice saltopløsning.
- Inspicere det donerede menneskelige hjerte (både Anteriort og posteriort, figur 1). Placer midt på en dissekere bakke og inspicere for strukturelle skader eller anatomiske misdannelser. Hvis leveren og/eller lunger blev indkøbt til transplantation, kan hjertet præsentere med en kort ringere vena cava og/eller fravær af venstre atriale posterior væg.
- Udføre interne eftersyn for eventuelle mangler - atrieseptumdefekt (ASD), Ventrikulær septal defekt (VSD) eller ventil (aorta, pulmonal, mitral, tricuspid) misdannelser.
- Hvis en septal defekt er til stede, korrigere det med passende suturer (figur 2A, 2B). Korrektion af septal defekter er nødvendig for at overvåge decellularization fremskridt via lungepulsåren (PA) udstrømning turbiditet måling. Korrektion af den septal defekt fjerner venstre til højre shunt, derfor udstrømning fra PA repræsenterer udstrømningen fra koronar cirkulation gennem koronar sinus.
- Ligate overlegne og ringere vena cava med 2-0 silke sutur (figur 2 c).
- Dissekere aorta (Ao) fra de vigtigste PA (figur 2D) for efterfølgende cannulation.
- Indsæt stik, baseret på diameteren af fartøjet, (figur 3) til Ao og PA og sikre dem med 2-0 silke suturer (figur 4A).
- Indsætte en slange linje gennem den venstre atrium (figur 4B) og mod venstre hjertekammer (LV) (figur 3), ved hjælp af pulmonale vene blænder.
- Tilslut en Dropslangen til stikket placeret i Ao og udstrømning linje til den i PA (figur 3).
- Placer forberedt hjertet i en polyester pose i inverteret orientering (hovedet).
- Læg posen med hjertet i en perfusion container og luk låget (figur 4 c).
- Forbinde hver af linjerne til de respektive havne i gummiprop (baseret på diameteren af container) og indsætte det til låget af perfusion container til at forsegle den polyester pose (figur 4 c og figur 5B).
- Perfuse 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 og 1,8 mM KH2PO4 i destilleret vand, pH 7,4) via gummiprop at kontrollere udstrømning fra PA og fra linjen infusion-port indsat i LV.
- Brug dette flow til at rense orgel af enhver resterende spor af blod i Vaskulaturen. Hvis strømmen ikke er observeret, stramme forbindelse linjer som de kan være løs.
2. systemopsætning og orgel Decellularization Procedure
- Samle bioreaktor og placere i en opretstående orientering (figur 5). Perfusion system omfatter en personlig computer (PC), proportional-integral-derivat (PID) controller, en peristaltisk pumpe for Ao infusion, en perfusion bioreaktor, pres hovedet beholder for LV perfusate fastholdelse (2L indsugningsventil flasken med bunden sidearm), og en peristaltisk pumpe til at dræne overskydende væske fra objektbeholderen pres hovedet og samle udstrømningen fra PA.
- I gummi septum, Tilslut Dropslangen, pres-head linje, PA-udstrømning linje og bioreaktor afløb linje til gummi cap overflade porte placeret på toppen af perfusion bioreaktor (figur 5A).
- Decellularize hjerter under konstant pres af 120 mmHg målt i aorta-roden. Middeltryk af LV bør være inden for 14-18 mmHg i hele den hele decellularization proces.
- Decellularize hjerter som følger: 4 h af hypertonisk løsning (500 mM NaCl), 2 h af hypotonic løsning (20 mM NaCl), 120 h sodium dodecyl sulfat (1% SDS) opløsning, og en afsluttende vask med 120 L 1 X PBS (figur 6A).
- Decellularize hjerter under konstant pres kontrol (120 mmHg). Infusion strømningshastighed i Ao er hjerte-afhængige og er i gennemsnit 98.06±16.22 mL/min. for hypertonisk løsning, 76.14±7.90 mL/min til hypotonic løsning, 151.50±5.76 mL/min. for SDS og 185.24±7.10 mL/min. til PBS. Den samlede forbrugte mængde af hver reagens gennemsnit 23.36±5.70 L for hypertonisk løsning og 9.13±1.26 L hypotonic løsning.
- Recirkulere den endelige 60 L af 1% SDS (1 L pr. gram af hjertet vægt) indtil udgangen af SDS perfusion. Figur 6A viser en tidslinje for decellularization proces, fremkalde slutpunkter for dataindsamling: flow sats overvågning (Ao og PA) og udstrømning samling (PA og ikke-PA) fra pres hovedet under decellularization.
- Da den stående Veterinærkomité og IVC er forbundet, er det rimeligt at antage at alle væske indsamlet fra PA er resultatet af faktiske koronar perfusion (figur 5B). Bestem koronar perfusion effektivitet ved direkte opdele strømningshastigheden af perfusate fra PA af strømningshastigheden af infunderet løsning i Ao:
Koronar perfusion effektivitet =
(%). - Udføre sammenlignende analyse af perfusate fremstillet af PA og LV og infunderes løsningerne i to eksemplarer af lastning 200 μl pr. brønd i en klar 96-brønd bundplade og læse absorbans ved 280 nm. Absorbans værdi, empirisk har valgt efter at have prøvet forskellige værdier, blev fundet at give bedst normaliserede værdier.
- Bruge turbiditet ren infunderes reagens som kontrol. Turbiditet af udstrømning perfusate repræsenterer nedtonet celle debris og kan kvantificeres straks under decellularization som en sporing redskab for processen.
- Under den afsluttende vask med 10 L 1 X PBS, tilsættes 500 mL sterilt neutraliseret 2,1% f.eks syre, neutraliseret med 10N NaOH, fører til en 0,1% f.eks syre (v/v) i PBS. Brug denne løsning til at sterilisere skafottet.
(%).3. vurdering af Decellularized hjerter
Bemærk: Efter decellularization, repræsentative hjerter vil blive brugt til koronar angiogram billedbehandling og biokemiske analyser.
- Udføre koronar angiografi af de repræsentative decellularized menneskelige hjerte at undersøge handelsformer af koronar Vaskulaturen. Kort, ved hjælp af en fluoroscope billede decellularized menneskelige hjerte efter injektion af kontraststof gennem koronar ostial kanyle i de vigtigste højre og venstre kranspulsårerne.
- Dissekere til decellularized hjertet for at få prøver fra 19 områder til at evaluere de resterende deoxyribonukleinsyre (DNA), glykosaminoglykan (GAG) og SDS niveauer i decellularized væv. Fjern bunden af hjertet fra hjertekamrene og dissekere hjertekamrene i 4 lige store sektioner (figur 6 c). Opdele hvert afsnit i den forreste og bagerste højre ventrikel (RV), forreste og bagerste LV og den interventrikulært septum (IVS). Det væv, som indeholder apex er dissekeret i LV og RV for prøveudtagning.
- Skære vævsprøver for DNA, GAG og SDS assays (~ 15 mg våd vægt).
- Uddrag dobbelt-strenget DNA (dsDNA) af fordøje prøver i 1 M NaOH i 3 timer ved 65 ° C og justere pH til 7 ved hjælp af 10 x Tris-EDTA (TE) buffer og 1 M saltsyre (HCl).
- Kvantificere dsDNA ved hjælp af en dsDNA Assay kit med en kalv thymus standard (Se Tabel af materialer). Læs prøver i dubletter ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade læser (excitation på 480 nm og emission ved 520 nm). Beregne procentdelen af resterende dsDNA i decellularized hjerter ved at sammenligne dsDNA koncentrationen i hver væv som i dødt (% dødt).
- Få sulfated GAGs i løsning ved at fordøje vævsprøver et papain ekstraktionsopløsning (0,2 M natrium fosfat buffer med EDTA dinatrium salt, cystein HCl, natriumacetat og papain) på 65 ° C i 3 timer. Måle GAG indhold (i duplikat) ved hjælp af en glykosaminoglykan Assay Kit.
- Lyophilize prøver for SDS assay i en opvarmet vakuum og foranstaltning tørvægt. Tilføje 200 µL ultrarent vand til hver tørrede prøve og homogeniseres for at udvinde den resterende SDS i løsning. Bland dette SDS løsning til chloroform og en methylenblåt (12 mg methylenblaat i 1 liter 0,01 M HCl). Strategien for bæredygtig udvikling vil adskille i de organiske lag af binding til methylenblåt farvning.
- Ved hjælp af et fluorescens mikrotiterplade læser, læse absorbans (655 nm) af standarder og prøver i to eksemplarer til at beregne den resterende SDS. Normalisere denne SDS værdi til væv tørvægt.
- Billede prøver fra tykke regioner (dvs., LV, RV og septum) af menneskelige hjerte med ikke-lineære Optisk mikroskopi (NLOM) at bekræfte cellulære fjernelse efter decellularization. NLOM setup er detaljeret beskrevet i vores tidligere publikationer18,19,20. NLOM giver os mulighed for at billedet celle, elastin, kollagen og myosin fibre gennem sine to-foton fluorescens (TPF) og anden-harmonisk generation (SHG) kanaler uden brug af enhver udefrakommende pletter eller farvestof21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter en 7-dages decellularization med antegrad aorta perfusion under konstant pres af 120 mmHg vendte det menneskelige hjerte gennemskinnelige (fig. 6B). Hjertet var groft dissekeret i 19 sektioner for biokemiske (DNA, GAG og SDS) analyse (figur 6 c) for at vurdere den endelige decellularized produkt.
Under hele decellularization, var infusion strømningshastigheden af forskellige løsninger varierede som trykket holdes konstant. Strømningshastigheden i Ao (figur 7A) gradvist faldt fra 96.68±23.54 til 80.59±12.41 mL/min. (16.64%) som perfusion løsning ændret fra hypertonisk til hypotonic. Derimod strømningshastighed steg fra 71.68±10.63 til 110.61±14.40 mL/min. (54.31%) når perfusion løsning ændres fra hypotonic til SDS. Under SDS perfusion svingede infusion strømningshastighed mellem 110±14.40 og 176.31±44.03 mL/min. Udstrømning sats fra PA (figur 7B) oprindeligt viste en lignende tendens (figur 7A). Dog blev udstrømning sats under 1% SDS perfusion faldt fra 35.77±9.07 til 27.08±4.09 mL/min. koronar perfusion effektivitet brugt til at vurdere aortaklappen passage og lignende tendenser. Effektivitet faldt over tid som forskellige reagenser perfunderet via Vaskulaturen (figur 7C). I den første time af 1 X PBS vask, perfusion effektivitet blev restaureret til den oprindelige værdi, pre hypotonic løsning (28.39±3.61% på 1-h PBS vs 31.02±7.16% 1-t hypotonic). De gennemsnitlige koronare perfusion effektivitetsfordele var 46.08±9.89%, 28.08±7.12%, 25.70±5.30% og 28.39±3.61% med den hypertonisk løsning, den hypotonic opløsning, 1% SDS og 1 X PBS, henholdsvis (figur 7 d).
Da udstrømning perfusate fra PA og LV blev samtidig indsamlet, deres vragrester indhold kunne være sammenlignet (figur 8A) af spektroskopi absorbansen målt på 280 nm (fig. 8B). Turbiditet spildevand fra PA og LV faldt over tid under perfusion af hver løsning; Turbiditet fra PA viste imidlertid en mere brat skifte i forhold til observeret fra LV indledende perfusion i perioden. Efter at have skiftet fra en hypertonisk til en hypotonic løsning, turbiditet PA udstrømning ændret fra 1.15±0.03 til 1.40±0.07 (21.73% stigning) og LV ændret fra 1.13±0.05 til 1.24±0.07 (9.73% stigning). I den første time af 1% SDS perfusion, turbiditet ændret fra 1.17±0.04 til 2.77±0.15 (136.75% stigning) til PA og 1.11±0.04 til 1.75±0.26 (56.65% stigning) for LV spildevand. Sammenhængen mellem udstrømning Turbiditet og celle debris udvaskning blev evalueret ved hjælp af bicinchoninic syre (BCA) protein assay, når proteinkoncentration var kvantificeret i udstrømning prøver. Resultaterne fra decellularization af 6 menneskers hjerter afslørede en lineær korrelation mellem proteinkoncentration og spildevand turbiditet med R2 = 0,95 (fig. 8 c).
Efter afslutningen af hele hjertet decellularization bekræftede de koronar angiogram bevarelse af intakte koronar Vaskulaturen (figur 9). Ulineære optiske billeddannelse af myokardiet lag fra tykke områder (dvs., RV, LV og septum) i decellularized menneskelige hjerte bekræftet celle fjernelse, som ingen celle tilstedeværelse blev observeret i TPF kanaler (figur 10). Celler (dvs. cardiomyocytes eller hjerte fibroblaster) med deres autofluorescence kan let identificeres i TPF kanal ved deres oval og aflange form morfologier. For at sikre effektiviteten af decellularization og celleaffald fjernelse, blev decellularized menneskers hjerter yderligere indtjente i 19 regioner (figur 6 c) at kvantificere niveauet af DNA, sulfated GAGs og SDS tilbage i disse regioner. DNA i alle regioner var mindre end 10% af dødt hjerte. DNA i højre atrium (8.39-10,38% i forhold til dødt) og venstre atrium (5.11-7,60%) var højeste (fig. 11A).
Figur 1: dødt menneske hjerte fra et orgel indkøb agentur. Anterior og posterior udsigt over dødt menneske hjerte. Ringere vena cava og en del af højre atrium er mangler, som observeres i stiplet region. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: inspektion for septal og/eller ventil anatomiske anomalier. (A) inspicere hvis patent foramen ovale (PFO) er til stede (kommunikation mellem højre og venstre atrium). (B) en 5-0 polypropylen sutur er anvendt på en sammenhængende måde at lukke PFO. (C) højre atrium er lukket med en løbende sutur af 5-0 polypropylen. (D) de vigtigste lungepulsåren er dissekeret fra den opstigende aorta af stump dissektion. FO: foramen ovale; PA: lungepulsåren; Ao: aorta. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: komponenter af infusion bioreaktor. Decellularization systemet består af (A) gummihætte med 4 porte; (B) udstrømning linje kan tilsluttes lungepulsåren (PA); (C, F) stik med luer lock til PA og aorta (Ao), (D) indsætningslinjen for den venstre hjertekammer (LV), (E) infusion linje kan kobles til aorta, (G) polyester pose og (H) Perfusion container. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: menneskelige hjerte cannulation og infusion bioreaktor forsamling. (A) forreste udsigt over hjertet viser lungepulsåren (PA) og aorta (Ao) individuelt kanylerede. (B) Posterior udsigt over hjertet viser kanyle rettet til venstre ventrikel (LV) gennem pulmonal vene (PV). (C) menneskelige hjerte indeni Infusion bioreaktor efter forsamling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: System setup af inverteret orienteret decellularization med pres hovedet. (A) fuldstændig decellularization system består af: en computer, en proportional-integral-derivat (PID) controller, pumper, en bioreaktor og bassiner til opsamling af spildevand fra lungepulsåren (PA) og venstre hjertekammer (LV). Ao: aorta. Pilene angiver strømningsretning. (B) skematiske af opsætningen af menneskelige hjerte indeni perfusion bioreaktor og de tilknyttede flow stier perfusate/udslip under decellularization. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: skematisk fremstilling af en decellularization procedure og efter decellularization undersøgelse af et menneskehjerte. (A) Diagram af proceduren for decellularization. (B) Anterior og posterior undersøgelse af et decellularized menneske hjerte. (C) brutto dissektion af et menneske hjerte i fire tværsnit (afsnit A til sektion D) for biokemiske assay analyse. Farve i den menneskelige hjerter er forårsaget af resterende lipofucin deposition. Farve præsenterer normalt i indre ventrikulær overflade eller grænsen mellem epicardium og myokardiet. LA: venstre atrium; RA: højre atrium; LV: venstre ventrikel; RV: højre hjertekammer; Ant: forreste; Post: posterior; Hyper: hypertonisk; Hypo: hypotonic; SDS: dodecyl natriumsulfat; PBS: fosfatbufferet saltopløsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Time-lapse flow dynamics under decellularization. (A) Infusion strømningshastigheden af decellularization løsninger til aorta under proceduren. (B) Flow sats af spildevand fra PA under decellularization. (C) koronar perfusion effektivitet under decellularization. (D) : koronar perfusion effektiviteten under perfusion af forskellige løsninger/reagenser. N = 6. Data repræsenterer mean±SEM. PA: lungepulsåren; Hyper: hypertonisk; Hypo: hypotonic; SDS: dodecyl natriumsulfat; PBS: fosfatbufferet saltopløsning; SEM: standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Time-lapse celle debris nedtonet under decellularization. (A) udstrømning mediesamling fra PA og ikke-PA (venstre ventrikel). (B) resultatet af turbiditet måling på 280 nm. (C) lineær korrelation mellem proteinkoncentration og turbiditet. n = 6 menneskers hjerter. Kontrollen var ren decellularization løsning. Data repræsenterer mean±SEM. PA: lungepulsåren; Hyper: hypertonisk; Hypo: hypotonic; SDS: dodecyl natriumsulfat; SEM: standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: koronar angiogram af decellularized menneskelige hjerte bekræfter thevascular passage efter decellularization. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: billeder fremstillet ved hjælp af ikke-lineær Optisk mikroskopi fra dødt og decellularized myokardiet viser ingen tilstedeværelse af celler (dvs. cardiomyocytes eller hjerte fibroblaster) med ovale eller langstrakt form morfologier i den decellularized LV, RV og septum. LV: venstre ventrikel; RV: højre hjertekammer; TPF: to photon fluorescens; SHG: anden harmonisk generation. Nogle hjerte celler er angivet med pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: biokemiske assay resultater. (A) resterende DNA i forhold til dødt hjertet i decellularized væv. (B) resterende GAG i forhold til dødt hjertet i decellularized væv. (C) resterende SDS i decellularized væv. n = 6 menneskers hjerter. Data repræsenterer mean±SEM. LA: overladt atrium; RA: højre atrium; LV: venstre ventrikel; RV: højre hjertekammer; Ant: forreste; Post: posterior; SDS: dodecyl natriumsulfat; SEM: standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Metode | Pro | Con |
| Konventionelle oprejst Langendorff perfusion | · Let adgang til hjertet til at reparere under decellularization | · For stor belastning af aorta på grund af hjerte vægt |
| · Høj infusion strømningshastighed under SDS perfusion under konstant pres kontrol | ||
| · Lav koronar perfusion effektivitet under SDS perfusion | ||
| · Del af aorta/pulmonal arterie over kanyle ligatur linje kunne få dehydreret og let forurenet | ||
| Inverteret Langendorff perfusion inde en trykisoleret pose | · Minimere pres udøves på aorta på grund af hjerte vægt | · Svært at adgang hjertet hvis reparation er nødvendig. |
| · Lav infusion strømningshastighed under SDS perfusion under konstant pres kontrol | ||
| · Forbedret koronar perfusion effektivitet under SDS perfusion | ||
| · Ingen væv bliver tørret ud, da det hele hjertet er neddykket/hydreret. |
Tabel 1: En oversigt over fordele og ulemper ved hele-hjerte decellularization ved hjælp af konventionelle oprejst perfusion vs. inverted Langendorff perfusion inde en trykisoleret pose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til vores viden er dette den første undersøgelse at betænkningen inverteret decellularization af menneskelige hjerter inde en trykisoleret pose med time-lapse overvågning af flow sats og celle debris fjernelse. At hjertesækken-lignende pose holder retningen af hjertet stabile i hele decellularization proceduren. Sænkes ned og vende hele hjerte indeni en pose forhindrer dehydrering og minimerer for stor belastning af aorta (fra hjertet vægt) Hvornår i forhold til de konventionelle oprejst Langendorff perfusion decellularization metode9. Dette, til gengæld bevarer kompetenceudvikling af aortaklappen.
For at opnå maksimal decellularization effektivitet, skal koronar vaskulære modstand være lav til at sikre passende og konsekvent perfusion af væske gennem hele myokardiet. I det hele-hjerte decellularization model ved hjælp af retrograd perfusion, væske ophobes i hjertekamrene og hæver intraventrikulært tryk, som til gengæld øger koronar vaskulære modstand og begrænser strømmen af væsker. Selv om aortaklappen er intakt, den ventrikulære hulrum fylder sekundært til fysiologiske lækage og komprimerer igen den ventrikulære væg.
Vores teknik, decellularizing et hjerte indeni en trykisoleret pose har til formål at afhjælpe dette problem og øge decellularization effektivitet. Et tryk på 120 mmHg aorta-roden og 14 mmHg i posen opretholdes under hele decellularization. Disse pres værdier er meget tæt på fysiologiske interval (80-120 mmHg i aorta) og 15 mmHg for venstre ventrikel ende-diastolisk tryk22. Ifølge Pernille et al. 23, myokardial blod flow sats spænder fra 0,61 til 1,10 mL/min/g, og de menneskelige hjerte vægt24,25 er ca. 245 til 308 g; Derfor, den fysiologiske koronare flow er omkring 149.45 til 338.80 mL/min, men afhænger af hjertet vægt. Vores udstrømning sats fra PA varierede fra 20 til 50 mL/min., hvilket er mindre end værdien af fysiologiske koronar flow og kunne have resulteret i 2 forskellige situationer: 1) infusion af løsninger til hjertet producerer ødem og der er også normale anatomiske dræning af koronar systemet til venstre hjertekammer hulrum; 2) som decellularization opstår, væske er også tabt gennem decellularized væggene på grund af en naturlig stigning i deres permeabilitet. Dette pres differential forhindrer sammenbrud af fartøjerne og tillader dem at forblive patent. Desuden, denne systemet vedligeholder hjertet i relative anatomiske forhold uden at komprimere Myokardie væggen, som ville øge koronar vaskulære modstand og forringe intravaskulær cirkulation af decellularization løsninger. Infusion flow sats profil af menneskelige hjerter (figur 7A) er meget lig hvad vi observeret i vores inverteret decellularization af svin hjerte9, med laveste infusion strømningshastighed opstår under den hypotonic perfusion og en svag stigning i flow sats (110.61±14.40 mL/min til 176.31±44.03 mL/min) opstår under 1% SDS perfusion. Vores infusion strømningshastighed (mener værdi = 151.50±3.71 mL/min) under 1% SDS perfusion var sammenlignelig med, eller endda mindre end for menneskelige hjerte decellularization rapporteret af Guyette et al. 14 dog vores metode er udført med trykregulering af 120 mmHg og deres metode brugt 60 mmHg. Denne forskel i perfusion pres antyder en overlegen effektiviteten af aortaklappen lukning i vores teknik, da mindre infusion gennemstrømningshastighed kunne opretholde højere tryk. En anden mulighed er, at den øgede koronare modstand var på grund af de anvendte 14 mmHg tryk inde i posen. Derudover vores menneskelige hjerte metode viste en lignende tendens til faldende koronar perfusion effektivitet (~ 30%, figur 7C, 7 D) fra hyper hypotonic løsning ændring i forhold til vores inverteret svin hjerte decellularization (~ 10% i inverteret orientering9vs 1-2% i opretstående orientering). Men denne nye metode kunne bevare koronar perfusion effektivitet under SDS perfusion løsning perfusion kan sammenlignes og dermed vises overlegen i forhold til vores tidligere metode til prøven inversion. Tabel 1 viser en liste over fordele og ulemper ved konventionelle oprejst perfusion vs. inverted Langendorff perfusion inde en trykisoleret pose.
Ud over strømningshastighed, kunne udstrømning turbiditet overvågning være et andet nyttigt værktøj til at evaluere decellularization fremskridt og effektivitet. Under decellularization var turbiditet spildevand fra PA højere end i overløbet fra ikke-PA websteder (fig. 8B). Dette tyder på, at de fleste af de perfused løsning gik gennem Vaskulaturen for "ordentlig" decellularization. Men det skal være gyldig, følgende skal løses: indbyrdes kammerværker shunts, eller passage af aortaklappen. Forsigtig og omhyggelig inspektion er derfor nødvendig for at forhindre fejl i metoden på grund af anatomiske afvigelser. Turbiditet profilen (fig. 8B) af hele hjertet decellularization processen viste lignende tendenser som tidligere vist, med bratte turbiditet ændring i den første overgangsperiode af forskellige perfusates9.
En primær målsætning for decellularized væv er at Fyld dem med celler og opnå høje celle vedhæftet fil, spredning, modning og funktionalitet. Vores decellularized væv har været succesfuldt cellularized for forskellige applikationer26,27, hvor væv var med held cellularized og opnåede lavere thrombogenicity. I vores biokemiske analyser af decellularized menneskers hjerter evalueret vi 19 regioner med forskellige væv tykkelser. DNA og SDS i decellularized væv varieret, med den højeste værdi i den højre og venstre atrium. Dette kunne være forårsaget af orientering af hjertet i en upside-down konfiguration, hvori celle debris blev fanget i bunden af posen eller hvor pres udefra reduceret flow. Perfusion decellularization afhængig af ubeskadiget hjerte strukturer, herunder intakt kranspulsårer og bifloder. Da disse organer er indkøbt fra flere organdonorer, har disse hjerter normalt en stor del af deres forkamre fjernet. Under udarbejdelsen af disse organer og reparation af den atriale væggen var der forstyrrelser i vanding af disse regioner, at strømmen af decellularization løsninger. For ikke-perfusion hjertet decellularization, har andre forskergrupper rapporteret 2-6% sidesten DNA i rotte28, svin29,30 og menneskelige31 forhold respektive dødt hjerte. Men de brugt fryse-tø28,29,30, enzym29,30 og serum31 i deres decellularization protokol, som kan skade ECM i højere grad end vores perfusion-baseret teknik. Udvikling af metoder til tilstrækkelig højde, disse begrænsninger bliver kritisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Taylor er grundlægger og aktionær i Miromatrix medicinsk, Inc. Denne relation administreres i overensstemmelse med interessekonflikt politikker ved University of Minnesota og Texas Heart Institute; andre forfattere har nogen interessekonflikt at videregive.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Houston Endowment grant og Texas Emerging Technology Fund. Forfatterne anerkender agenturets orgel indkøb LifeGift, Inc. og donors familier for at gøre denne undersøgelse mulig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
