Summary
Este método permite la descelularización de un órgano sólido complejo utilizando un protocolo simple basado en choque osmótico y perfusión de detergente iónico con una interrupción mínima del órgano matriz. Se compone de una técnica de descelularización novela para los corazones humanos dentro de una bolsa presurizada con monitoreo en tiempo real de flujo dinámica y celulares residuos de la salida.
Abstract
La solución definitiva para pacientes con insuficiencia cardiaca de fase final es el trasplante de órganos. Pero corazones de donantes son limitados, inmunosupresión es necesaria y en última instancia puede ocurrir rechazo. Creación de un funcional, corazón bio-artificial autóloga podría resolver estos desafíos. Biofabrication de un corazón de andamio y de las células es una opción. Un andamio natural con composición de tejidos específicos así como micro y macro arquitectura puede obtenerse por decellularizing corazones de seres humanos o animales grandes, como cerdos. Descelularización consiste en lavar los desechos celulares mientras preserva vasculatura y 3D de la matriz extracelular y permitir que "cellularization" en un punto más adelante. Capitalizando nuestra novela encontrar eso descelularización de perfusión de órganos complejos es posible, se desarrolló un método más "fisiológica" para decellularize no transplantable corazones humanos colocándolos dentro de una bolsa a presión, en un invertido orientación, bajo presión controlada. El propósito de usar una bolsa presurizada es crear gradientes de presión a través de la válvula aórtica para mantenerlo cerrado y mejorar la perfusión miocárdica. Evaluación simultánea de la dinámica del flujo y la eliminación de detritos celulares durante la descelularización permitida monitorear flujo líquido y flujo de escombros, generando un andamio que puede ser utilizado tanto para la simple reparación cardiaca (por ejemplo, como un parche o andamio de la válvula) o como un andamio de todo órgano.
Introduction
Insuficiencia cardíaca provoca alta mortalidad en los pacientes. La opción de tratamiento definitivo por insuficiencia de la fase final es el trasplante de allo. Sin embargo, hay una larga lista de espera para el trasplante debido a la escasez de donantes de órganos y pacientes cara poste-trasplante obstáculos que van desde inmunosupresión de por vida a rechazo crónico de órgano1,2. Corazones funcionales Bioingeniería por repoblación decellularized corazones de tamaño humano con un paciente células podrían eludir estos obstáculos3.
Un paso importante en la "ingeniería" un corazón es la creación de un andamio con adecuada estructura vascular y parenquimatosa, composición y función para guiar la alineación y organización de las células entregadas. En presencia del marco adecuado, las células sembradas en el andamio deben reconocer el entorno y realizan la función esperada como parte de ese órgano. En nuestra opinión, matriz extracelular decellularized órgano (dECM) comprende las características necesarias del andamio ideal.
Mediante la utilización de vasculatura intrínseca, complejo descelularización de todo órgano puede lograrse vía anterógrada o retrógrada perfusión4 quitar componentes celulares conservando el delicado 3D matriz extracelular y la vasculatura2, 5,6,7. Una vasculatura funcional es importante en órganos enteros de Bioingeniería justo como es en vivo, para la distribución de nutrientes y eliminación de residuos8. Descelularización de perfusión coronaria ha demostrado para ser eficaz en la creación de decellularized corazones de ratas4o cerdos4,7,9,10,11 ,12,13y los humanos5,7,14,15,16. Sin embargo, puede sufrir integridad de las válvulas, aurículas y otras regiones "finas".
Corazón decellularized tamaño andamios pueden obtenerse en cerdos usando presión control7,9,10,11,12 o infusión flujo tasa control13, 17 y control de donantes humanos ejerciendo una presión de5,7,14,15. Descelularización de corazón de donante humano ocurre durante 4-8 días bajo presión controlada en 80-100 mmHg en orientación vertical5,15,16 o más de 16 días bajo presión controlada en 60 mmHg14 . Bajo anterógrado, descelularización de presión controlada, la competencia de la válvula aórtica desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la eficacia de la perfusión coronaria y presión estable en la raíz aórtica. Nuestro trabajo anterior reveló que la orientación del corazón influye en su eficacia de la perfusión coronaria durante el procedimiento de descelularización y por lo tanto la integridad del andamio en el final9.
Como continuación de nuestro anterior trabajo9, introducimos un nuevo concepto en donde se agrega una bolsa pericardio-como mejorar la descelularización de todo corazón. Describimos la descelularización de corazones humanos colocados dentro de bolsas a presión, inversamente orientadas y bajo presión controlada a 120 mmHg en la raíz aórtica. Este protocolo incluye el monitoreo del perfil de flujo y colección de los medios de salida durante el procedimiento de descelularización para evaluar la eficacia de la perfusión coronaria y eliminación de desechos celulares. Luego se realizan ensayos bioquímicos para comprobar la eficacia del método.
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Protocol
Todos los experimentos se adhirieron a las directrices del Comité de ética del Instituto del corazón de Texas.
1. el órgano preparación
Nota: En colaboración con LifeGift, una organización de compras de órgano sin fines de lucro en Texas (http://www.lifegift.org), donada los corazones humanos no apto para trasplante fueron utilizados para investigación con consentimiento aprobado.
- Para obtener corazones, infundir por vía intravenosa 30.000 heparina U a los corazones. Bien cardioplejía cánula en la aorta de sutura y fijar una línea de perfusión afianzada con abrazadera. Perforar la vena cava inferior (IVC) para ventilar el corazón derecho. Cortar la vena pulmonar superior izquierda o en la orejuela izquierda para ventilar la cámara izquierda del corazón.
- Infundir 1 L de cardioplejía o solución salina heparinizada. Disecar ramas del arco aórtico, vena cava superior (SVC) y otras venas pulmonares para liberar el corazón de cualquier accesorio de tejido vascular o alrededores. Sumerja el corazón bien heparinizado en solución salina helada.
- Inspeccione el corazón humano donado (anterior y posterior, figura 1). Coloque el corazón en una bandeja de disección e inspeccione por daños estructurales o malformaciones anatómicas. Si el hígado o los pulmones fueron procurados para el trasplante, el corazón puede presentar con un corta vena cava inferior o la ausencia de la pared posterior auricular izquierda.
- Realizar una inspección interna por posibles defectos - comunicación interauricular (CIA), interventricular (CIV) o malformación de la válvula (aórtica, pulmonar, mitral, tricúspide).
- Si existe un defecto septal, corríjalo con suturas apropiadas (figura 2A, 2B). La corrección de defectos septales es necesario para monitorear el progreso de la descelularización mediante medición de turbiedad de salida de la arteria pulmonar (PA). Quita la corrección del defecto septal izquierda a la desviación derecha, por lo tanto, la salida de PA representa la salida de la circulación coronaria a través del seno coronario.
- Liga superior e inferior de la vena cava con sutura de seda 2-0 (figura 2).
- Disecar la aorta (Ao) del PA principal (Figura 2D) para la posterior canulación.
- Inserte los conectores, basados en el diámetro del vaso, (figura 3) en Ao y PA y fijar con suturas de seda 2-0 (Figura 4A).
- Insertar una línea de tubería a través de la aurícula izquierda (Figura 4B) y hacia el ventrículo izquierdo (LV) (figura 3), utilizando uno de los orificios de la vena pulmonar.
- Conectar una línea de infusión conector en el Ao y la línea de salida a la del PA (figura 3).
- Coloque el corazón preparado en una bolsa de poliéster en orientación invertida (boca abajo).
- Coloque la bolsa con el corazón en un recipiente de perfusión y cierre la tapa (figura 4).
- Cada una de las líneas conecta a los puertos correspondientes en el tapón de goma (basado en el diámetro del envase) e insértela en la tapa del contenedor de la perfusión para sellar la bolsa poliester (figura 4 y figura 5B).
- Tamponada fosfato salino (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 y 1,8 mM KH2PO4 en agua destilada, pH 7,4) del x 1 vía el puerto de infusión el tapón de goma para verificar la salida del PA y de la línea de perfusión insertado en LV.
- Utilice este flujo para limpiar el órgano de cualquier residuos de sangre en la vasculatura. Si no se observa flujo, ajuste las líneas de conexión que sean sueltos.
2. sistema y procedimiento de la descelularización de órgano
- Montar el biorreactor y en una orientación vertical (figura 5). El sistema de perfusión incluye un ordenador personal (PC), regulador del proporcional-integral-derivado (PID), una bomba peristáltica de infusión del Ao, un biorreactor de perfusión, un depósito presurizado de cabeza para la retención de la solución de LV (frasco de aspirador de 2L con fondo mano) y una bomba peristáltica para drenar el exceso de líquido del recipiente de presión principal y para recoger la salida de PA
- En la membrana de goma, conecte la línea de infusión, línea de la cabeza de la presión, PA-salida y línea de drenaje biorreactor a los puertos de superficie de tapón de goma colocados en la parte superior del biorreactor de perfusión (figura 5A).
- Decellularize corazones bajo la constante presión de 120 mmHg, medida a la raíz aórtica. La presión media del LV debe ser dentro de 14-18 mmHg durante todo el proceso de descelularización todo.
- Decellularize corazones como sigue: 4 h de la solución hipertónica (500 mM de NaCl), 2 h de una solución hipotónica (20 mM de NaCl), 120 h de sodio dodecil sulfato (SDS 1%) en solución y un lavado final con 120 L de 1 X PBS (figura 6A).
- Decellularize los corazones bajo el control de presión constante (120 mmHg). Tasa de flujo de infusión en Ao depende del corazón y es, en promedio, 98.06±16.22 mL/min de solución hipertónica, 76.14±7.90 mL/min de una solución hipotónica, 151.50±5.76 mL/min para SDS y 185.24±7.10 mL/min para PBS. El volumen total consumido de cada reactivo es de 23.36±5.70 L de solución hipertónica y 9.13±1.26 L de una solución hipotónica.
- Recircular el final 60 L de SDS 1% (1 L por gramo de peso del corazón) hasta el final de la perfusión de la SDS. La figura 6A muestra un cronograma para el proceso de descelularización, obtención de puntos finales para la recolección de datos: flujo tasa de monitoreo (Ao y PA) y la colección salida (PA y PA no) de la cabeza de presión durante la descelularización.
- Puesto que el SVC y la vena cava inferior se unen, es razonable asumir que todo el líquido Obtenido de la Autoridad Palestina es el resultado de la perfusión coronaria real (figura 5B). Determinar la eficacia de la perfusión coronaria dividiendo directamente el flujo de la solución del PA por el caudal de solución infundida en Ao:
Eficacia de la perfusión coronaria =
(%). - Realizar análisis comparativo de la solución obtenida del PA y el LV y las soluciones infundidas por duplicado por carga 200 μL por pozo en una placa de 96 pocillos de fondo claro y la lectura de absorbancia a 280 nm. El valor de absorbancia, seleccionado empíricamente después de probar diferentes valores, se encontró dar mejor normalizaron los valores.
- Usar la turbiedad de reactivo limpio infundido como el control. La turbidez de la solución de salida representa el lavado de restos celulares y puede ser cuantificada al instante durante la descelularización como una herramienta de seguimiento del proceso.
- Durante el lavado final con 10 L de 1 X PBS, agregar 500 mL de estéril neutralizado 2,1% peracético solución de ácido neutralizada con NaOH 10N, conduce a una solución ácida (v/v) de 0.1% peracético en PBS. Use esta solución para esterilizar el andamio.
(%).3. evaluación de corazones Decellularized
Nota: Después de descelularización, representante de corazones se utilizará para los análisis de proyección de imagen y bioquímicos angiograma coronario.
- Realizar angiografía coronaria del corazón humano decellularized representante para examinar la integridad de la vasculatura coronaria. Brevemente, utilizando un fluoroscopio, imagen decellularized corazón humano después de la inyección de medio de contraste a través de la cánula ostiaria coronaria en las principales arterias coronarias derecha e izquierdas.
- Diseccionar el corazón decellularized para obtener muestras de 19 áreas para evaluar las restantes ácido desoxirribonucleico (ADN), glicosaminoglicano (GAG) y niveles de SDS en los tejidos decellularized. Retire la base del corazón de ventrículos y diseccionar los ventrículos en 4 partes iguales (figura 6). Dividir cada sección en el ventrículo derecho anterior y posterior (RV), el LV anterior y posterior y el tabique interventricular (IVS). El tejido que contiene el ápice es disecado en la LV y la RV para el muestreo.
- Cortar muestras de tejido para análisis de ADN, mordaza y SDS (~ 15 mg de peso húmedo).
- Extracto de ADN bicatenario (dsDNA) por extracción de muestras en 1 M NaOH por 3 h a 65 ° C y ajustar pH a 7 con 10 x de buffer Tris-EDTA (TE) y 1 M de ácido clorhídrico (HCl).
- Cuantificar dsDNA utilizando un dsDNA kit de ensayo con un timo de becerro estándar (véase Tabla de materiales). Leer las muestras por duplicado utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación a 480 nm y emisión a 520 nm). Calcular el porcentaje de dsDNA residual en los corazones decellularized comparando la concentración de dsDNA en cada tejido cadavérico (% cadavérico).
- Obtener GAGs sulfatados en solución por extracción de muestras de tejido en una solución de extracción de la papaína (tampón de fosfato de sodio de 0,2 M con cisteína, sal disódica de EDTA ácido clorhídrico, acetato de sodio y papaína) a 65 ° C durante 3 horas. Medir el contenido GAG (por duplicado) mediante el uso de un Kit de análisis de glicosaminoglicanos.
- Liofilizar muestras para análisis de SDS en un caliente vacío y medida de peso seco. Añadir 200 μL de agua ultrapura para cada muestra seca y homogeneizar para extraer el SDS residual en la solución. Mezcle esta solución de SDS a cloroformo y una solución de azul de metileno (12 mg de azul de metileno en 1 L de 0.01 M HCl). El SDS se separará en la capa orgánica por Unión al tinte de azul de metileno.
- Usando un lector de microplacas de fluorescencia, leer la absorbancia (655 nm) de los estándares y las muestras por duplicado para el cálculo de la SDS residual. Normalizar este valor SDS para peso seco de tejido.
- Muestras de regiones gruesas (es decir, del LV, RV y tabique) del corazón humano con la microscopía óptica no lineal (NLOM) para confirmar la eliminación celular después de descelularización en imagen. La configuración NLOM se detalla en nuestras anteriores publicaciones18,19,20. NLOM nos permite imagen célula, elastina, colágeno y miosina de las fibras por su fluorescencia de dos fotones (TPF) y segundo canales de generación armónico (SHG) sin utilizar cualquier mancha o tinte exógeno21.
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Representative Results
Tras una descelularización de 7 días con perfusión aórtica anterógrada bajo constante presión de 120 mmHg, el corazón humano volvió translúcida (Figura 6B). El corazón fue disecado groseramente en 19 secciones para el análisis bioquímico (ADN, mordaza y SDS) (figura 6) para evaluar el producto final decellularized.
Durante el proceso de descelularización, tasa de flujo de infusión de diferentes soluciones variadas como la presión se mantuvo constante. La tasa de flujo en el Ao (Figura 7A) gradualmente se redujo de 96.68±23.54 a 80.59±12.41 mL/min (16.64%) como la solución de perfusión cambió de hipertónico a hipotónico. En cambio, tasa de flujo aumentó de 71.68±10.63 a 110.61±14.40 mL/min (54,31%) cuando cambia los solución de perfusión de hipotónica a SDS. Durante la perfusión de la SDS, tasa de flujo de infusión fluctuó entre 110±14.40 y 176.31±44.03 mL/min. La tasa de salida de PA (figura 7B) inicialmente mostraron una tendencia similar (Figura 7A). Sin embargo, la frecuencia de salida durante la perfusión de SDS 1% disminuida de 35.77±9.07 a 27.08±4.09 mL/min eficacia de la perfusión coronaria se utilizó para evaluar la permeabilidad de la válvula aórtica y tendencias similares. Eficacia disminuye con el tiempo como diferentes reactivos perfundidos a través de la vasculatura (figura 7). Durante la primera hora de 1 lavado X PBS, eficacia de la perfusión fue restaurada al valor original de una solución hipotónica previamente (28.39±3.61% en PBS 1 h vs 31.02±7.16% a 1-h hipotónica). Las eficiencias de la perfusión coronaria media fueron de 46.08±9.89%, 28.08±7.12%, 25.70±5.30% y 28.39±3.61% con la solución hipertónica, la solución hipotónica, 1% SDS y 1 X PBS, respectivamente (figura 7).
Puesto que la solución de la salida del PA y del LV fueron recogidos al mismo tiempo, su contenido de residuos podría ser comparados (figura 8A) por espectroscopia de absorbancia medida a 280 nm (figura 8B). La turbiedad del efluente de PA y LV disminuyó con el tiempo durante la perfusión de cada solución; sin embargo, la turbidez del PA demostró más abrupto cambio de color en comparación con el observado del LV durante la perfusión inicial. Después de la conexión de una hipertónica con una solución hipotónica, la turbiedad de salida PA cambiada de 1.15±0.03 a 1.40±0.07 (21.73% de aumento) y de LV cambiado de 1.13±0.05 a 1.24±0.07 (9.73% de incremento). Durante la primera hora de perfusión de 1% SDS, turbidez cambió de 1.17±0.04 a 2.77±0.15 (136.75% de aumento) para PA y 1.11±0.04 a 1.75±0.26 (56.65% de aumento) para el efluente del LV. La correlación entre la turbiedad de salida y lavado de desechos celulares se evaluó mediante análisis de proteína (BCA) ácido bicinchoninic cuando se cuantificó la concentración de proteína en las muestras de la salida. Los resultados obtenidos de la descelularización de 6 corazones humanos revelaron una correlación lineal entre la concentración de proteína y turbiedad efluente con R2 = 0.95 (figura 8).
Después de la terminación de la descelularización de todo corazón, la angiografía coronaria había confirmada la preservación de la vasculatura coronaria intacta (figura 9). Imágenes ópticas no lineales de las capas del miocardio de áreas gruesas (es decir, RV, LV y tabique) en decellularized corazón humano confirman retiro del celular, no hay presencia de células se observó en los canales TPF (figura 10). Células (es decir, cardiomiocitos o fibroblastos cardíacos) con su autofluorescencia pueden identificarse fácilmente en el canal TPF por su morfología de forma oval y alargada. Para garantizar la efectividad del proceso de descelularización y eliminación de desechos celulares, los corazones humanos decellularized más se recaudó en 19 regiones (figura 6) para cuantificar los niveles de ADN, GAGs sulfatados y SDS en esas regiones. ADN en todas las regiones fue inferior al 10% de corazón cadavérico. ADN en aurícula derecha (8.39-10,38% en relación con cadáveres) y a la izquierda atrio (5.11-7.60%) fue mayor (Figura 11A).
Figura 1: corazón humano cadavérico de una agencia de contratación del órgano. Vistas anteriores y posteriores del corazón humano cadavérico. Vena cava inferior y una porción de atrio derecho faltan, como se observa en la región discontinua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: inspección de septal o anomalías anatómicas de la válvula. (A) Revise si el foramen oval permeable (FOP) es presente (comunicación entre aurícula derecha e izquierda). (B) se aplica una sutura de polipropileno 5-0 de manera continua para cerrar la persistencia del agujero oval. (C) aurícula derecha se cierra con una sutura corriente de polipropileno 5-0. (D) se diseca la arteria pulmonar principal de la aorta ascendente por disección Roma. FO: foramen oval permeable; PA: la arteria pulmonar; AO: aorta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: componentes del biorreactor infusión. El sistema de descelularización se compone de tapa de goma (A) con 4 puertos; (B) línea de salida para conectarse a la arteria pulmonar (PA); Conectores (C, F) , con conector luer lock para el PA y la aorta (Ao), (D) línea de inserción para el ventrículo izquierdo (LV), línea de infusión (E) para conectarse a la aorta, bolsa poliester (G) y (H) contenedor de perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: montaje de biorreactor la canalización y la infusión de corazón humano. (A) vista Anterior del corazón mostrando la arteria pulmonar (PA) y aorta (Ao) canulados individualmente. (B) Vista Posterior del corazón mostrando la cánula dirigida al ventrículo izquierdo (VI) a través de la vena pulmonar (PV). Corazón humano (C) en el biorreactor de infusión después del montaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: configuración del sistema de descelularización orientado invertida con la cabeza de presión. (A) el sistema de descelularización completa se compone de: un ordenador, un controlador proporcional-integral-derivado (PID), bombas, un biorreactor y depósitos para recoger el efluente de la arteria pulmonar (PA) y ventrículo izquierdo (LV). AO: aorta. Las flechas indican la dirección del flujo. (B) el esquema de la configuración del corazón humano dentro del biorreactor de la perfusión y los caminos de flujo asociado de solución/efluente durante la descelularización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: representación esquemática de la examinación del procedimiento y después de la descelularización de descelularización de un corazón humano. (A) diagrama del procedimiento de descelularización. (B) Anterior y posterior examen de un corazón humano decellularized. (C) bruto disección de un corazón humano en cuatro secciones (sección A sección D) para el análisis de análisis bioquímicos. El colorante en el corazón humano es causado por la deposición de residuales lipofucin. La coloración presenta normalmente en la superficie ventricular interna o el límite entre el epicardio y el miocardio. LA: aurícula izquierda; RA: aurícula derecha; LV: ventrículo izquierdo; RV: ventrículo derecho; Hormiga: anterior; Post: posterior; Hyper: hipertónica; Hipo: hipotónica; SDS: sodio dodecil sulfato; PBS: fosfato tampón salino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: dinámica del time-lapse de flujo durante la descelularización. (A) velocidad de flujo de infusión de soluciones de descelularización en la aorta durante el procedimiento. (B) caudal del efluente de la PA durante la descelularización. (C) eficacia de la perfusión coronaria durante la descelularización. (D) significa la eficacia de la perfusión coronaria durante la perfusión de soluciones/reactivos diferentes. N = 6. Los datos representan ±SEM. PA: arteria pulmonar; Hyper: hipertónica; Hipo: hipotónica; SDS: sodio dodecil sulfato; PBS: solución salina tamponada con fosfato; SEM: error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: lavado de residuos de Time-lapse de la célula durante la descelularización. Colección de medios de salida (A) de PA y no PA (ventrículo izquierdo). (B) resultado de la medida de la turbidez a 280 nm. (C) existe una correlación lineal entre turbidez y concentración de la proteína. n = 6 corazones humanos. Control era solución de descelularización limpio. Los datos representan ±SEM. PA: arteria pulmonar; Hyper: hipertónica; Hipo: hipotónica; SDS: sodio dodecil sulfato; SEM: error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: angiograma coronario del corazón humano decellularized confirma la permeabilidad de la thevascular después de descelularización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: imágenes obtenidas mediante microscopía óptica no lineal de miocardio cadavérico y decellularized no muestran ninguna presencia de las células (es decir, cardiomiocitos o fibroblastos cardíacos) con morfologías de forma oval o alargada en la decellularized LV, RV y tabique. LV: izquierda ventrículo; RV: ventrículo derecho; TPF: fluorescencia de dos fotones; SHG: segunda generación armónica. Algunas células cardíacas están indicados por flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: resultados de análisis bioquímicos. (A) ADN restante relativa a corazón cadavérico en tejidos decellularized. (B) mordaza restantes en relación con corazón cadavérico en tejidos decellularized. (C) SDS restante en los tejidos decellularized. n = 6 corazones humanos. Los datos representan ±SEM. LA: a la izquierda atrio; RA: aurícula derecha; LV: ventrículo izquierdo; RV: ventrículo derecho; Hormiga: anterior; Post: posterior; SDS: sodio dodecil sulfato; SEM: error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Método | Pro | Con |
| Perfusión de Langendorff vertical convencional | · Fácil acceso pleno a reparar durante descelularización | · Excesiva tensión en la aorta debido al peso del corazón |
| · Tasa de flujo de infusión alta durante perfusión SDS bajo el control de presión constante | ||
| · Eficacia de la baja perfusión coronaria durante la perfusión de SDS | ||
| · La porción de arteria pulmonar aorta sobre línea de ligadura la cánula podría conseguir deshidratada y fácilmente contaminada | ||
| Perfusión de Langendorff invertida dentro de una bolsa a presión | · Minimizar la tensión en la aorta debido al peso del corazón | · Difícil acceso el corazón si la reparación es necesaria. |
| · Tasa de flujo de infusión baja durante perfusión SDS bajo el control de presión constante | ||
| · Mayor eficiencia de la perfusión coronaria durante la perfusión de SDS | ||
| · No tejidos se secó desde el corazón todo es sumergido/hidratado. |
Tabla 1: Resumen de los pros y los contras de todo corazón descelularización mediante perfusión convencional vertical vs perfusión de Langendorff invertida dentro de una bolsa presurizada.
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Discussion
A nuestro conocimiento, éste es el primer estudio a descelularización Informe invertida del corazón humano dentro de una bolsa presurizada con control Time-lapse del retiro de escombros célula y tasa de flujo. La bolsa de pericardio-como mantiene la orientación del corazón estable durante todo el procedimiento de descelularización. Sumergir los corazones todo dentro de una bolsa de inversión previene la deshidratación y minimiza la excesiva tensión en la aorta (del peso del corazón) cuando en comparación con el convencional vertical Langendorff perfusión descelularización método9. Esto, a su vez, conserva la competencia de la válvula aórtica.
Para lograr la eficiencia máxima descelularización, la resistencia vascular coronaria debe ser baja para asegurar la perfusión adecuada y coherente a través del miocardio todo líquido. En el modelo de todo corazón descelularización mediante perfusión retrógrada, el líquido se acumula en los ventrículos y eleva la presión intraventricular, que, a su vez, aumenta la resistencia vascular coronaria y limita el flujo de fluidos. A pesar de que la válvula aórtica está intacta, la cavidad ventricular llena secundaria a pérdidas fisiológicas y alternadamente comprime la pared ventricular.
Nuestra técnica de decellularizing un corazón dentro de una bolsa presurizada se dirige a aliviar este problema y aumentar la eficiencia de la descelularización. Una presión de 120 mmHg en la raíz aórtica y 14 mmHg en la bolsa se mantiene durante todo el proceso de descelularización. Estos valores de presión son muy cerca de la gama fisiológica (80-120 mmHg en aorta) y 15 mmHg de presión diastólica final ventricular izquierdo22. Según Murthy et al. 23, las gamas de tasa flujo sanguíneo miocárdico de 0,61 a 1,10 mL/min/g y el corazón humano peso24,25 será de unos 245 a 308 g; por lo tanto, la velocidad de flujo coronaria fisiológica es 149.45 a 338.80 mL/min aproximadamente, pero depende del peso del corazón. Nuestra tasa de salida de PA varió de 20 a 50 mL/min, que es menor que el valor de velocidad de flujo coronaria fisiológica y podría haber resultado de 2 situaciones diferentes: 1) la infusión de soluciones al corazón producen edema y también es normal anatómica drenaje del sistema coronario a la cavidad del ventrículo izquierdo; 2) como se produce la descelularización, líquido también se pierde a través de las paredes decellularized debido a un aumento natural en su permeabilidad. Este diferencial de presión previene el colapso de los vasos y les permite seguir siendo patente. Por otra parte, este sistema mantiene el corazón en condiciones anatómicas relativa sin comprimir la pared miocárdica, lo que aumentaría la resistencia vascular coronaria y afectar la circulación intravascular de las soluciones de descelularización. El perfil de tasa de flujo de infusión de corazones humanos (Figura 7A) es muy similar a lo que observamos en nuestro descelularización invertida del corazón porcino9, con la tasa más baja de la flujo de infusión que ocurre durante la perfusión hipotónica y un ligero aumento en flujo de tasa (110.61±14.40 mL/min a 176.31±44.03 mL/min) que ocurre durante la perfusión de SDS 1%. Nuestra tasa de flujo de infusión (valor medio = 151.50±3.71 mL/min) durante 1% SDS perfusión era comparable a, o incluso menor que el de la descelularización de corazón humano por Guyette et al. 14 sin embargo, nuestro método se realiza con control de presión de 120 mmHg y 60 mmHg utiliza su método. Esta diferencia en las presiones de perfusión sugiere una eficacia superior de cierre de la válvula aórtica en la técnica, puesto que una tasa más baja de la flujo de infusión podría mantener una presión más alta. Otra posibilidad es que el aumento de la resistencia coronario debido a la presión aplicada de 14 mmHg en la bolsa. Además, nuestro método de corazón humano mostraron una tendencia similar de disminución de eficacia de la perfusión coronaria (~ 30%, figura 7, 7 D) de hyper a cambio de una solución hipotónica en comparación con la descelularización de corazón porcino invertida (~ 10% en invirtió la orientación9vs 1-2% en orientación vertical). Sin embargo, este nuevo método podría preservar la eficacia de la perfusión coronaria durante la perfusión SDS comparable a la perfusión de solución y así aparece superior a nuestro previo método de inversión de la muestra. La tabla 1 enumera los pros y contras de perfusión vertical convencional vs invierten dentro de una bolsa a presión de la perfusión de Langendorff.
Además de flujo, control de turbiedad de salida podría ser otra herramienta útil para evaluar la eficacia y el progreso de descelularización. Durante descelularización, turbiedad del efluente del PA fue mayor que el de los efluentes de los sitios no-PA (figura 8B). Esto sugiere que la mayoría de la perfusión solución iba a través de la vasculatura de descelularización "adecuada". Pero para que esto sea válido, deberá considerarse lo siguiente: la cámara shunts o permeabilidad de la válvula aórtica. Inspección cuidadosa y meticulosa, por tanto, es necesario para prevenir fallas del método debido a no conformidades anatómicas. El perfil de turbidez (figura 8B) del proceso de la descelularización de todo corazón demostró tendencias similares según lo demostrado previamente, con el cambio brusco de la turbidez durante el período de transición inicial de diferentes perfusates9.
Un objetivo principal para los tejidos decellularized es poder repoblar con las células y lograr la funcionalidad, la proliferación, maduración y adjunto de la celular alta. Nuestros tejidos decellularized han sido cellularized con éxito para varias aplicaciones26,27, donde los tejidos se cellularized con éxito y logra menor trombogenicidad. En nuestros análisis bioquímicos de los corazones humanos decellularized, se evaluaron 19 regiones con espesores de tejido diferentes. El ADN y la SDS en los tejidos decellularized variaron, con el mayor valor obtenido en el atrio derecho e izquierdo. Esto puede ser causado por la orientación del corazón en una configuración boca abajo, en donde fue atrapado restos celulares en la parte inferior de la bolsa o flujo reducido donde presión externa. Descelularización de perfusión se basa en las estructuras del corazón intacto, incluyendo afluentes y coronaries intactos. Como estos órganos se obtienen de donantes de órganos múltiples, estos corazones tienen generalmente una porción grande de sus aurículas quitado. Durante la preparación de estos órganos y reparación de la pared auricular, hubo interrupción de la irrigación de estas regiones, poniendo en peligro el flujo de las soluciones de descelularización. Para descelularización de no perfusión corazón, otros grupos de investigación han reportado ADN sobrante 2-6% en rata28, porcino29,30 y humano31 en comparación con los respectivo corazón cadavérico. Sin embargo, utilizaron una congelación y descongelación28,29,30, enzima29,30 y suero31 en su Protocolo de descelularización, que puede dañar el ECM a un mayor grado que nuestra técnica de perfusión. Desarrollo de métodos para abordar adecuadamente estas limitaciones será crítica.
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Disclosures
El Dr. Taylor es el fundador y accionista de Miromatrix Medical, Inc. Esta relación es administrada conforme a las políticas de conflicto de intereses por la Universidad de Minnesota y el Instituto del corazón de Texas; otros autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la concesión de la dotación de Houston y el fondo de tecnología emergente de Texas. Los autores reconocen la Agencia de contratación del órgano LifeGift, Inc. y las familias de los donantes por hacer posible este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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