Summary
Deze methode kan decellularization voor een complexe solide orgel met behulp van een eenvoudig protocol gebaseerd op osmotische schok en perfusie van Ionische detergent met minimale orgel matrix verstoring. Het bestaat uit een roman decellularization-techniek voor menselijke harten binnen een hydrofoor etui met real-time bewaking van flow dynamics en cellulaire puin uitstroom.
Abstract
De ultieme oplossing voor patiënten met hartfalen einde-fase is orgaantransplantatie. Maar bij immuunsuppressie is vereist, donor harten zijn beperkt en uiteindelijk afwijzing kan optreden. Het maken van een functioneel, kon autologe bio-kunsthart deze uitdagingen oplossen. Biofabrication van een hart dat bestaat uit de steiger en cellen is een optie. Een natuurlijke steiger met weefsel-specifieke samenstelling evenals micro - en macro-architectuur kan worden verkregen door decellularizing harten van mensen of grote dieren zoals varkens. Decellularization omvat cellulaire puin terwijl behoud 3D extracellulaire matrix en therapieën en "cellularization" waardoor op een later timepoint spoelen. Inspelend op onze roman vinden dat decellularization perfusie van complexe organen is mogelijk, wij een meer "fysiologisch" methode ontwikkeld om niet-transplanteerbaar menselijke harten door ze te plaatsen binnen een hydrofoor etui, in een omgekeerde decellularize oriëntatie, onder gecontroleerde druk. Het doel van het gebruik van een hydrofoor zakje is druk om kleurovergangen te maken over de aortaklep het gesloten houden en verbeteren van myocardiale perfusie. Gelijktijdige beoordeling van de dynamiek van de stroom en cellulaire puin verwijdering tijdens decellularization konden we ten aanzien van zowel vloeistof instroom en uitstroom van puin, waardoor het genereren van een steiger die kan worden gebruikt voor eenvoudige cardiale reparatie (bijvoorbeeld als een patch of ventiel steiger) of als een geheel-orgel-steiger.
Introduction
Hartfalen leidt tot een hoge mortaliteit bij patiënten. De ultieme behandelingsoptie voor einde-fase hartfalen is allo-transplantatie. Echter, er is een lange wachtlijst voor transplantatie als gevolg van de tekort van donor-organen, en patiënten gezicht na transplantatie horden variërend van levenslang bij immuunsuppressie tot chronische orgel afwijzing1,2. Bioengineering functionele harten door repopulatie decellularized mens en middelgrote hart met een patiënt eigen cellen kunnen omzeilen deze horden3.
Een belangrijke stap in "engineering" een hart is de oprichting van een steiger met passende vasculaire en parenchymal structuur, de samenstelling en de functie voor het begeleiden van de uitlijning en de organisatie van geleverde cellen. In aanwezigheid van het geschikte kader, moeten cellen uitgezaaid op het schavot herkennen van het milieu en de verwachte functie uitvoeren als onderdeel van dat orgaan. Volgens ons omvat decellularized orgel extracellulaire matrix (dECM) de nodige kenmerken van het ideale schavot.
Door gebruik te maken van intrinsieke therapieën, kan complexe geheel-orgel-decellularization worden bereikt via antegrade of retrograde perfusie4 om te verwijderen van cellulaire componenten met behoud van de gevoelige 3D extracellulaire matrix en therapieën2, 5,6,7. Een functionele therapieën is belangrijk in bioengineering hele organen gewoon zoals het is in vivo, voor nutriënten distributie en afval verwijdering8. Coronaire perfusie decellularization heeft bewezen effectief te zijn in het creëren van decellularized harten van ratten4of varkens4,7,9,10,11 ,12,13, en mensen5,7,14,15,16. Integriteit van de kleppen, atria en andere "thin" regio's kan echter nadelig beïnvloeden.
Mens-grootte decellularized hart steigers kunnen worden verkregen van varkens met behulp van druk control7,9,10,11,12 of infusie flow rate control13, 17 encontrole van menselijke donoren druk met5,7,14,15. Decellularization van menselijke donor hart doet zich voor meer dan 4-8 dagen onder druk gecontroleerd op 80-100 mmHg in staande oriëntatie5,15,16 of meer dan 16 dagen onder druk gecontroleerd op 60 mmHg14 . Onder antegrade, druk-gecontroleerde decellularization, speelt de bekwaamheid van de aortaklep een cruciale rol bij het handhaven van de efficiëntie van de coronaire perfusie en stabiele druk in de aorta hoofdmap. Onze vorige werk is gebleken dat de richting van het hart invloed op de efficiëntie van de coronaire perfusie tijdens de procedure decellularization en dus de integriteit van de steiger in het einde9.
Als een voortzetting van onze eerdere werk9introduceren we een nieuw concept waarin een hartzakje-achtige zakje is toegevoegd ter verbetering van de gehele-hart decellularization. We beschrijven de decellularization van menselijke harten geplaatst binnen hydrofoor zakjes, omgekeerd georiënteerd, en onder druk gecontroleerd op 120 mmHg bij de aorta wortel. Dit protocol omvat het toezicht op het profiel van de stroom en de verzameling uitstroom media gedurende de decellularization procedure voor de evaluatie van de efficiëntie van de coronaire perfusie en cel puin verwijderen. Biochemische tests worden vervolgens uitgevoerd om te testen van de effectiviteit van de methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten vasthouden aan de richtsnoeren van de Commissie ethiek van de Texas Heart Institute.
1. orgel voorbereiding
Opmerking: In samenwerking met LifeGift, een non-profitorganisatie orgel procurement organisatie in Texas (http://www.lifegift.org), schonk menselijke harten niet geschikt is voor transplantatie werden gebruikt voor onderzoek met goedgekeurde toestemming.
- Om het hart aanschaffen, intraveneus infuus 30.000 U heparine aan het hart. Veilig hechtdraad cardioplegia canule in de aorta en hechten een geklemd perfusie-lijn. Perforate de inferior vena cava (IVC) om te ventileren van het rechterdeel van het hart. Snijd de linker superieure longader of de linker atriale aanhangsel om te ventileren van de linker kamers van het hart.
- Infundeer 1 L cardioplegia of EDTA zoutoplossing. Ontleden aortaboog takken, superieure vena cava (SVC) en andere pulmonary aders om het hart van elke bijlage vasculaire of omliggende weefsel vrij te geven. Het goed heparinized hart in iced zoutoplossing dompelen.
- Inspecteren van het gedoneerde menselijke hart (anteriorly zowel posteriorly, Figuur 1). Het hart op een ontleden lade plaatsen en te inspecteren op structurele schade of anatomische misvormingen. Als de lever-en/of longen werden aangeschaft voor transplantatie, kan het hart met een korte vena cava inferior en/of afwezigheid van links atriale achterste muur presenteren.
- Interne inspectie voor eventuele gebreken - atriale septal defect (ASD), ventriculaire septal defect (VSD) of misvorming van de klep (aorta, pulmonale, mitralisklep, tricuspidalis) uitvoeren.
- Als een septal defect aanwezig is, moet u deze corrigeren met passende hechtingen (figuur 2A, 2B). De correctie van septal gebreken is nodig om de voortgang van de decellularization via de longslagader (PA) uitstroom troebelheid meting. Correctie van het septal defect verwijdert links naar juiste shunt, vandaar de uitstroom uit PA vertegenwoordigt de uitstroom van de coronaire circulatie via de coronaire sinus.
- Afbinden superior en inferior vena cava met 2-0 zijde hechtdraad (figuur 2C).
- Het ontleden van de aorta (Ao) uit de buurt van de belangrijkste PA (figuur 2D) voor de latere cannulation.
- Plaats verbindingslijnen, gebaseerd op de diameter van het vaartuig, de (Figuur 3) naar Ao en PA en hen veilig met 2-0 zijde hechtingen (figuur 4A).
- Plaats een buis lijn via de linkerboezem (figuur 4B) en naar de linker ventrikel (LV) (Figuur 3), met behulp van een van de longader lichaamsopeningen.
- Sluit een infusie-lijn aan de connector geplaatst in de Ao en de uitstroom lijn in de PA (Figuur 3).
- Plaats het bereid hart in een polyester zak in omgekeerde richting (ondersteboven).
- Plaats het zakje met hart verpakkingsgasssen perfusie en sluit het deksel (figuur 4C).
- Elk van de lijnen verbinden met de respectieve poorten in de rubberstop (gebaseerd op de diameter van de container) en plaats deze op het deksel van de container van de perfusie te verzegelen het polyester zakje (figuur 4C en figuur 5B).
- Perfuse 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4 in gedistilleerd water, pH 7.4) via de poort van de infusie van de rubberstop om te controleren of de uitstroom van de PA en aan de lijn ingevoegd in LV.
- Gebruik deze stroom te reinigen van het orgaan van eventuele resterende sporen van bloed in de therapieën. Als stroom niet waargenomen wordt, scherpen de verbindingslijnen als ze misschien wel los.
2. de systeeminstellingen en orgel Decellularization Procedure
- Monteren van de bioreactor en plaats in een staande afdrukstand (Figuur 5). De perfusie-systeem omvat een personal computer (PC), evenredige-integraal-afgeleide (PID) controller, een peristaltische pomp voor Ao infusie, een bioreactor perfusie, een druk hoofd container voor LV perfusaat retentie (2L aspirator fles met bodem pistool), en een peristaltische pomp voor afvoer overtollige vocht uit de druk hoofd container en voor het verzamelen van de uitstroom van PA.
- In het rubber septum, verbinden met de lijn van de infusie, druk-hoofd lijn, PA-uitstroom lijn en bioreactor zuig lijn de rubber dop oppervlakte poorten geplaatst op de top van de perfusie bioreactor (figuur 5A).
- Decellularize hart onder constante druk van 120 mmHg gemeten aan de aorta wortel. Gemiddelde druk van de LV moet binnen de 14-18 mmHg gedurende het hele decellularization proces.
- Decellularize harten als volgt: 4 h van hypertonic oplossing (500 mM NaCl), 2 h van hypotone oplossing (20 mM NaCl), 120 h van het natrium dodecyl sulfaat (SDS 1%) oplossing, en een laatste wassen met 120 L 1 X PBS (figuur 6A).
- Decellularize de harten onder constante druk controle (120 mmHg). Infusie debiet in Ao is afhankelijk van de hart en bedraagt gemiddeld, 98.06±16.22 mL/min voor hypertonic oplossing, 76.14±7.90 mL/min voor hypotone oplossing, 151.50±5.76 mL/min voor SDS en 185.24±7.10 mL/min voor PBS. De totale verbruikte hoeveelheid elk reagens gemiddelden 23.36±5.70 L voor hypertonic oplossing en 9.13±1.26 L voor hypotone oplossing gebracht.
- Recirculate de laatste 60 L van 1% SDS (1 L per gram gewicht van het hart) tot het einde van SDS perfusie. Figuur 6A toont een tijdlijn voor het proces van decellularization, aanleiding kunnen geven tot eindpunten voor gegevensverzameling: tarief toezicht (Ao en PA) en uitstroom collectie (PA en niet-PA) van druk hoofd tijdens decellularization stromen.
- Aangezien de SVC en IVC als ligatuur zijn verbonden, is het redelijk te veronderstellen dat alle vloeistof verzameld van de PA is het resultaat van werkelijke coronaire perfusie (figuur 5B). Het debiet van perfusaat uit de PA door het debiet van geïnfundeerd oplossing direct te verdelen in Ao om coronaire perfusie efficiëntie te bepalen:
Coronaire perfusie efficiëntie =
(%). - Vergelijkende analyse van het perfusaat verkregen uit de PA en de LV en de geïnfundeerd oplossingen in tweevoud laden 200 μl per putje in een duidelijke bodemplaat 96-Wells en het lezen van de absorptie bij 280 nm. De waarde van de absorptie, empirisch geselecteerd na het uitproberen van verschillende waarden, werd gevonden om het beste genormaliseerde waarden.
- De troebelheid van schone geïnfundeerd reagens als het besturingselement gebruiken. De troebelheid van het perfusaat uitstroom wegspoeling van cel vuil vertegenwoordigt en direct tijdens decellularization als een hulpprogramma voor het bijhouden van het proces kan worden gekwantificeerd.
- Voeg tijdens de laatste wash met 10 L 1 X PBS, 500 mL steriele geneutraliseerde 2,1% Perazijnzuur zuuroplossing, geneutraliseerd met 10N NaOH, wat leidt tot een 0,1% Perazijnzuur zure oplossing (v/v) in PBS. Gebruik deze oplossing om de steiger te steriliseren.
(%).3. evaluatie van Decellularized hart
Opmerking: Na decellularization, representatieve harten zal worden gebruikt voor coronair angiogram beeldvorming en biochemische tests.
- Uitvoeren van Coronaire Angiografie van de representatieve decellularized menselijk hart te onderzoeken de intactheid van de coronaire therapieën. Kortom, met behulp van een fluoroscope, afbeelding decellularized menselijk hart na injectie van contrast agent door coronaire ostial canule in de belangrijkste rechter en linker kransslagaders.
- Het ontleden van het decellularized hart om monsters uit 19 gebieden de resterende deoxyribonucleic acid (DNA), glycosaminoglycaan (GAG) en SDS niveaus in decellularized weefsels te evalueren. Neem de voet van het hart van de ventrikels en ontleden de ventrikels in 4 gelijke delen (Figuur 6 c). Verdeel elke sectie in de voorste en achterste rechterventrikel (RV), de voorste en achterste LV en het hart septum (IVS). Het weefsel bevattende de apex is ontleed in de LV en RV voor bemonstering.
- Gesneden weefselmonsters voor DNA, GAG en SDS assays (~ 15 mg van versgewicht).
- Double-stranded DNA (dsDNA) te halen door het verteren van monsters in 1 M NaOH gedurende 3 uur bij 65 ° C en breng pH op 7 met behulp van 10 x Tris-EDTA (TE) buffer en 1 M zoutzuur (HCl).
- Kwantificeren van dsDNA een dsDNA Assay kit met een kalf thymus standaard (Zie Tabel van materialen). Lees monsters in tweevoud fluorescentie microplate lezer gebruikt (excitatie bij 480 nm en emissie bij de 520 nm). Bereken het percentage van de resterende dsDNA in de decellularized harten door het vergelijken van dsDNA concentratie in elk weefsel dat in dode foetussen (% dode foetussen).
- Krijgen sulfated GAGs in oplossing door het verteren van weefselmonsters een extractievloeistof papaïne (0,2 M natriumfosfaat buffer met EDTA Dinatrium zout, cysteïne HCl, natriumacetaat en papaïne) bij 65 ° C gedurende 3 uur. GAG inhoud (in tweevoud) meten met behulp van een glycosaminoglycaan Assay Kit.
- Lyophilize monsters voor SDS assay in een verwarmde vacuüm en maatregel drooggewicht. 200 µL ultrazuiver water toevoegen aan elk gedroogde monster en homogeniseren om uit te pakken van de resterende SDS in oplossing. Meng deze SDS-oplossing met chloroform en een methyleenblauwoplossing (12 mg methyleenblauw in 1 L 0,01 M HCl). De SDS zal in de organische laag door binding aan de kleurstof methyleenblauw scheiden.
- Met behulp van een fluorescentie microplate lezer, lees de extinctie (655 nm) van het standards and monsters in tweevoud voor de berekening van de residuele SDS. Normaliseren deze SDS waarde aan weefsel drooggewicht.
- Foto's van dikke regio's (dat wil zeggen, LV, RV en septum) van menselijk hart met niet-lineaire optische microscopie (NLOM), cellulaire verwijdering na decellularization te bevestigen. Het NLOM-setup wordt gedetailleerd beschreven in onze eerdere publicaties18,19,20. NLOM ons in staat stelt aan beeld cel elastine, collageen en myosin vezels via haar twee-foton fluorescentie (TPF) en de tweede-harmonische generatie (SHG) zenders zonder gebruik te maken van een exogene vlek of kleurstof21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na een 7-daagse decellularization met antegrade aorta perfusie onder constante druk van 120 mmHg draaide het menselijk hart doorschijnend (figuur 6B). Het hart was Grove ontleed in 19 secties voor biochemische (DNA, GAG en SDS) analyse (Figuur 6 c) voor de evaluatie van het eindproduct van de decellularized.
Tijdens het proces van decellularization, was de infusie debiet van verschillende oplossingen, gevarieerd als de druk constant gehouden. Het debiet in de Ao (figuur 7A) daalde geleidelijk van 96.68±23.54 tot 80.59±12.41 mL/min (16.64%) als de perfusie-oplossing van gewijzigd hypertonic hypotone. In tegenstelling, debiet verhoogd van 71.68±10.63 naar 110.61±14.40 mL/min (54.31%), wanneer perfusie oplossing van hypotone SDS gewijzigd. Tijdens de SDS perfusie schommelden infusie debiet tussen 110±14.40 en 176.31±44.03 mL/min. Het tarief van de uitstroom van PA (figuur 7B) bleek in eerste instantie een soortgelijke trend (figuur 7A). Echter werd het uitstroom percentage tijdens 1% SDS perfusie daalde van 35.77±9.07 tot 27.08±4.09 mL/min. coronaire perfusie-efficiëntie gebruikt om te evalueren van de aortaklep bij en soortgelijke trends. Efficiëntie daalde na verloop van tijd als verschillende reagentia geperfundeerd via de therapieën (Figuur 7 c). Tijdens het eerste uur van de 1 X PBS-wash, perfusie-efficiëntie werd hersteld in de oorspronkelijke waarde van de vooraf hypotone oplossing (28.39±3.61% op 1-h PBS vs. 31.02±7.16% bij 1-h hypotone). De gemiddelde coronaire perfusie efficiencyverbeteringen respectievelijk 46.08±9.89%, 28.08±7.12% 25.70±5.30% en 28.39±3.61% met de hypertonic oplossing, de hypotone oplossing, 1% SDS en 1 X PBS, (figuur 7D).
Aangezien het perfusaat uitstroom van PA en LV gelijktijdig werden verzameld, hun puin inhoud kon worden vergeleken (figuur 8A) door spectroscopie extinctie gemeten op 280 nm (Figuur 8). De troebelheid van het effluent van PA en LV daalde na verloop van tijd tijdens perfusie van elke oplossing; troebelheid van de PA bleek echter een meer abrupte kleurverandering in vergelijking met waargenomen vanaf LV tijdens de periode van de eerste perfusie. Nadat u bent overgeschakeld van een hypertonic tot een hypotone oplossing, de troebelheid van PA uitstroom gewijzigd van 1.15±0.03 naar 1.40±0.07 (21.73% toename) en LV gewijzigd van 1.13±0.05 naar 1.24±0.07 (9,73% stijging). Tijdens het eerste uur van 1% SDS perfusie, troebelheid gewijzigd van 1.17±0.04 naar 2.77±0.15 (136.75% toename) voor PA en 1.11±0.04 naar 1.75±0.26 (56.65% toename) voor de LV afvalwater. De correlatie tussen uitstroom turbiditeit en cel puin wassen werd geëvalueerd aan de hand van de bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling wanneer eiwitconcentratie werd gekwantificeerd in de uitstroom monsters. De resultaten van de decellularization van 6 menselijke harten geopenbaard een lineaire correlatie tussen de eiwitconcentratie en afvalwater troebelheid met R2 = 0.95 (figuur 8C).
Na voltooiing van geheel-hart decellularization bevestigd de coronair angiogram het behoud van intact coronaire therapieën (Figuur 9). Niet-lineaire optische beeldvorming van myocard lagen uit dikke gebieden (dat wil zeggen, RV, LV en septum) in decellularized menselijk hart bevestigd cel verwijderen, zoals de aanwezigheid van geen cel werd waargenomen in TPF kanalen (Figuur 10). Cellen (dat wil zeggen, cardiomyocytes of cardiale fibroblasten) met hun autofluorescence kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd in TPF kanaal door hun morphologies ovaal en langwerpig van vorm. Teneinde de effectiviteit van het proces van decellularization en cellulaire puin verwijderen, werden de decellularized menselijke harten verder bracht in 19 gebieden (Figuur 6 c) te kwantificeren van de niveaus van DNA, sulfated GAGs en SDS resterende in die regio's. DNA in alle regio's was minder dan 10% van dode foetussen hart. DNA in juiste atrium (8.39-10.38% ten opzichte van dode foetussen) en links atrium (5.11 7.60 procent) was de hoogste (Figuur 11).
Figuur 1: dode foetussen menselijk hart van een orgel voor overheidsopdrachten wordt opgericht. Anterieure en posterieure weergaven van dode foetussen menselijk hart. Vena cava inferior en een gedeelte van de juiste atrium ontbreken, zoals waargenomen in onderbroken regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: inspectie voor septal en/of klep van anatomische afwijkingen. (A) inspecteren als patent foramen ovale (PFO) presenteren (communicatie tussen rechter en linker atrium). (B) een 5-0 polypropyleen hechtdraad wordt toegepast op een continue wijze te sluiten PFO. (C) de juiste atrium wordt afgesloten met een lopende hechtdraad van 5-0 polypropyleen. (D) de belangrijkste longslagader wordt doorsneden door botte dissectie van de oplopende aorta. FO: foramen ovale; PA: longslagader; Ao: aorta. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: onderdelen van de infusie bioreactor. Het decellularization systeem bestaat uit (A) rubberen dop met 4 poorten; (B) uitstroom lijn worden aangesloten op de longslagader (PA); (C, F) connectoren met luer lock voor PA en aorta (Ao), (D) Invoeglijn voor het linker ventrikel (LV), (E) infusie lijn om te worden aangesloten op de aorta, polyester zak (G) en (H) perfusie container. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: menselijk hart cannulation en infusie bioreactor montage. (A) Anterior weergave van het hart (PA) van longslagader en aorta (Ao) individueel gecanuleerd tonen. (B) Posterior weergave van het hart tonen canule gericht aan linker ventrikel (LV) via de longader (PV). (C) menselijk hart binnen de infusie bioreactor na montage. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: systeeminstellingen van omgekeerde georiënteerde decellularization met druk hoofd. (A) de volledige decellularization-systeem bestaat uit: een computer, een evenredige-integraal-afgeleide (PID) controller, pompen, een bioreactor en reservoirs voor het opvangen van het afvalwater van de longslagader (PA) en linker ventrikel (LV). Ao: aorta. Pijlen geven aan stroomrichting. (B) het schema van de installatie van menselijk hart binnen perfusie bioreactor en de bijbehorende stroom paden van perfusaat/afvalwater tijdens decellularization. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: schematische weergave van het decellularization procedure en na decellularization onderzoek van een menselijk hart. (A) -Diagram van de decellularization procedure. (B) anterieure en posterieure onderzoek van het hart van een decellularized mens. (C) bruto dissectie van een menselijk hart in vier dwarsdoorsneden (deel A naar sectie D) voor de biochemische bepaling analyse. De kleuren in de menselijke harten wordt veroorzaakt door afzetting van overblijvende lipofucin. De kleuring presenteert normaal in ventriculaire binnenzijde of de grens tussen Epicard en myocard. LA: linkerboezem; RA: juiste atrium; LV: linkerventrikel; RV: rechterventrikel; Ant: anterior; Post: posterior; Hyper: hypertonic; Hypo: hypotone; SDS: natrium dodecyl sulfaat; PBS: met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Time-lapse flow dynamics tijdens decellularization. (A) infusie debiet van decellularization oplossingen in de aorta tijdens procedure. (B) Flow rate van afvalwater van PA tijdens decellularization. (C) de efficiëntie van de coronaire perfusie tijdens decellularization. (D) betekent dit een efficiëntie van de coronaire perfusie tijdens perfusie van verschillende oplossingen/reagentia. N = 6. Gegevens vertegenwoordigen mean±SEM. PA: longslagader; Hyper: hypertonic; Hypo: hypotone; SDS: natrium dodecyl sulfaat; PBS: met fosfaat gebufferde zoutoplossing; SEM: de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Time-lapse cel puin wassen tijdens decellularization. (A) de verzameling van de media van het uitstroom van PA en niet-PA (linker ventrikel). (B) resultaat van de meting van de troebelheid bij 280 nm. (C) lineaire correlatie bestaat tussen de eiwitconcentratie en turbiditeit. n = 6 menselijke harten. Controle was schoon decellularization oplossing. Gegevens vertegenwoordigen mean±SEM. PA: longslagader; Hyper: hypertonic; Hypo: hypotone; SDS: natrium dodecyl sulfaat; SEM: de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: coronair angiogram van decellularized menselijk hart bevestigt thevascular bij na decellularization. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: beelden verkregen met behulp van niet-lineaire optische microscopie van dode foetussen en decellularized myocard tonen geen aanwezigheid van cellen (dat wil zeggen, cardiomyocytes of cardiale fibroblasten) met ovaal of langwerpig vorm morphologies in de decellularized LV en RV tussenschot. LV: verlaten ventrikel; RV: rechterventrikel; TPF: twee-foton fluorescentie; SHG: tweede harmonische generatie. Sommige hartcellen worden aangegeven met pijlen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: biochemische kwantitatieve analyse resultaten. (A) overige DNA ten opzichte van dode foetussen hart in decellularized weefsels. (B) overige GAG ten opzichte van dode foetussen hart in decellularized weefsels. (C) overige SDS in decellularized weefsels. n = 6 menselijke harten. Gegevens vertegenwoordigen mean±SEM. LA: links atrium; RA: juiste atrium; LV: linkerventrikel; RV: rechterventrikel; Ant: anterior; Post: posterior; SDS: natrium dodecyl sulfaat; SEM: de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Methode | Pro | CON |
| Conventionele rechtop Langendorff perfusie | · Gemakkelijk toegang tot het hart te repareren tijdens decellularization | · Overmatige krachten op de aorta ten gevolge van hart gewicht |
| · Hoge stroom de infusiesnelheid tijdens SDS perfusie onder constant drukregeling | ||
| · Lage coronaire perfusie-efficiëntie tijdens SDS perfusie | ||
| · Het gedeelte van de aorta/pulmonaire slagader boven canule afbinding lijn kon krijgen uitgedroogd en gemakkelijk besmet | ||
| Omgekeerde Langendorff perfusie binnen een hydrofoor etui | · Druk uitgeoefend op de aorta ten gevolge van hart gewicht minimaliseren | · Moeilijk toegankelijke het hart als reparatie nodig is. |
| · Lage stroom de infusiesnelheid tijdens SDS perfusie onder constant drukregeling | ||
| · Verbeterde efficiëntie van de coronaire perfusie tijdens SDS perfusie | ||
| · Geen weefsels zal worden uitgedroogd, aangezien het hele hart ondergedompeld/gehydrateerd is. |
Tabel 1: Een overzicht van de voors en tegens van geheel-hart decellularization met behulp van conventionele rechtop perfusie vs. omgekeerde Langendorff perfusie binnen een hydrofoor etui.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om onze kennis is dit de eerste studie verslag omgekeerde decellularization van menselijke harten binnen een hydrofoor etui met time-lapse toezicht op stroom tarief en cel puin verwijderen. Het pericard-achtige zakje houdt de richting van het hart stabiel gedurende de hele procedure decellularization. Inlaten en omkeren van de hele hart binnen een zakje voorkomt uitdroging en minimaliseert overmatige krachten op de aorta (van hart gewicht) wanneer vergeleken met de conventionele rechtop Langendorff perfusie decellularization methode9. Dit, beurtelings, behoudt de bevoegdheid van de aortaklep.
Om te bereiken maximale decellularization efficiëntie, moet coronaire vasculaire weerstand laag zijn om te zorgen voor toereikende en consistente perfusie van vloeistof via het hele myocardium. In het geheel-hart decellularization model met behulp van retrograde perfusie, vocht hoopt zich op in de ventrikels en verheft intraventricular druk, die op zijn beurt verhoogt de coronaire vasculaire weerstand en beperkt de stroom van vloeistoffen. Hoewel de aortaklep intact is, de ventriculaire holte vult ondergeschikt aan fysiologische lekkage en op zijn beurt comprimeert de ventriculaire muur.
Onze techniek van decellularizing een hart binnen een hydrofoor zakje is gericht op het verlichten van dit probleem en de efficiëntie van de decellularization verhogen. Een druk van 120 mmHg bij de aorta wortel en 14 mmHg in het zakje wordt onderhouden gedurende het proces van decellularization. Deze waarden zijn zeer dicht bij de fysiologische bereik (80-120 mmHg in aorta) en 15 mmHg voor linker ventriculaire einde-diastolische druk22. Volgens Murthy et al. 23, de myocardiale bloed stroom tarief varieert van 0,61 tot 1.10 mL/min/g, en het menselijk hart gewicht24,25 bedraagt ongeveer 245-308 g; Vandaar, de fysiologische coronaire debiet is ongeveer 149.45 tot 338.80 mL/min, maar hangt af van het gewicht van het hart. Ons tarief van de uitstroom van PA varieerden van 20 tot 50 mL/min, dat is minder dan de waarde van fysiologische coronaire debiet en gevolg kan zijn van 2 verschillende situaties: 1) de infusie van oplossingen voor het hart produceren oedeem en er is ook normaal anatomische drainage van de coronaire systeem het linkerventrikel holte; 2) als de decellularization optreedt, de vloeistof is ook verloren door de decellularized muren als gevolg van een natuurlijke verhoging van hun permeabiliteit. Dit drukverschil verhindert ineenstorting van de vaartuigen en staat hen te blijven patent. Bovendien houdt dit systeem het hart in relatieve anatomische voorwaarden zonder te comprimeren de myocardiale muur, die zou coronaire vasculaire weerstand verhogen en afbreuk doen aan de intravasculaire omloop van de decellularization-oplossingen. De infusie stroom tarief Profiel van menselijke harten (figuur 7A) is zeer vergelijkbaar met wat we in onze omgekeerde decellularization van varkens hart9, met laagste infusie debiet die zich voordoen tijdens de hypotone perfusie en een lichte stijging waargenomen flow rate (110.61±14.40 mL/min aan 176.31±44.03 mL/min) die zich voordoen tijdens 1% SDS perfusie. Onze infusie debiet (gemiddelde waarde = 151.50±3.71 mL/min) tijdens 1% SDS perfusie was vergelijkbaar met, of zelfs minder dan die voor menselijk hart decellularization gerapporteerd door Guyette et al. 14 echter onze methode is uitgevoerd met drukregeling van 120 mmHg en hun methode gebruikt 60 mmHg. Dit verschil in druk van de perfusie suggereert een superieure effectiviteit van aortaklep sluiting in onze techniek omdat een lager debiet van infusie hogere druk kon handhaven. Een andere mogelijkheid is dat de toegenomen coronaire weerstand als gevolg van de toegepaste 14 mmHg druk in het zakje was. Bovendien, onze menselijk hart methode toonde een soortgelijke trend van het verlagen van de coronaire perfusie efficiëntie (~ 30%, Figuur 7 c, 7 D) van hyper hypotone oplossing verandering in vergelijking met onze omgekeerde varkens hart decellularization (~ 10% in Omgekeerde oriëntatie9vs. 1-2% in de staande afdrukstand). Echter deze nieuwe methode kan behouden coronaire perfusie-efficiëntie tijdens SDS perfusie vergelijkbaar met oplossing perfusie en lijkt dus superieur aan onze voorafgaande methode van monster inversie. Tabel 1 bevat de voors en tegens van conventionele rechtop perfusie vs. ondersteboven Langendorff perfusie binnen een hydrofoor etui.
Naast debiet zou uitstroom troebelheid toezicht een ander nuttig hulpmiddel voor de evaluatie van de vooruitgang van de decellularization en efficiëntie. Tijdens decellularization was troebelheid van het afvalwater van de PA hoger dan die van het effluent van niet-PA sites (Figuur 8). Dit suggereert dat het merendeel van de perfused oplossing ging door de therapieën voor "goede" decellularization. Maar om dit te gelden, het volgende moet worden aangepakt: Inter kamer shunts of bij van de aortaklep. Zorgvuldige en zorgvuldige inspectie is dus noodzakelijk om te voorkomen dat de mislukking van de methode als gevolg van anatomische niet-conformiteiten. Het profiel (Figuur 8) van de troebelheid van het ganse hart decellularization proces aangetoond vergelijkbare trends als eerder is laten zien, met abrupte troebelheid verandering tijdens de eerste overgangsperiode van verschillende perfusates9.
Een hoofddoel voor decellularized weefsels is om hen opnieuw met cellen en bereiken hoge cel bijlage, proliferatie, maturatie en functionaliteit te kunnen. Onze decellularized weefsels hebben met succes zijn cellularized voor diverse toepassingen26,27, waar de weefsels met succes werden cellularized en lagere thrombogeniciteit bereikt. We geëvalueerd in onze biochemische analysen van decellularized menselijke harten, 19 regio's met verschillende weefsel diktes. Het DNA en SDS in decellularized weefsels gevarieerd, met de hoogste waarde verkregen in het rechter en linker atrium. Dit kan worden veroorzaakt door de richting van het hart in een ondersteboven configuratie, waarin de cel puin aan de onderkant van het zakje zat gevangen of waar externe druk verminderd stroom. Perfusie decellularization is afhankelijk van onbeschadigde hart structuren, met inbegrip van intact kransslagaders en zijrivieren. Deze organen zijn multi orgaandonoren verkregen, hebben deze harten meestal een groot deel van hun atria verwijderd. Tijdens de voorbereiding van deze organen en de reparatie van de atriale muur was er een verstoring in de irrigatie van deze regio's, de stroom van de oplossingen van de decellularization in gevaar te brengen. Voor niet-perfusie hart decellularization, hebben andere onderzoeksgroepen 2-6% overgebleven DNA in rat28, varkens29,30 en menselijke31 ten opzichte van de respectieve dode foetussen hart gemeld. Echter ze gebruikt bevriezen-ontdooien28,29,30, enzym29,30 en serum31 in het protocol van hun decellularization, dat schade aan de ECM in grotere mate dan veroorzaken kan onze perfusie gebaseerde techniek. Ontwikkelen van methoden adequaat inspelen op deze beperkingen zal van doorslaggevend belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Taylor is de oprichter en aandeelhouder van Miromatrix Medical, Inc. Deze relatie wordt beheerd overeenkomstig het beleid van belangenconflict door de Universiteit van Minnesota en Texas Heart Institute; de andere auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de Houston Endowment grant en de Texas Emerging Technology Fund. De auteurs erkennen de overheidsopdrachten orgel LifeGift, Inc. en van de donor gezinnen om dit onderzoek mogelijk te maken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al.
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al.
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
