Summary
1, 2-dithiolane의 합성에 대 한 프로토콜 펩 티 드와 펩 티 드에서 자기 조립 결과 supramolecular 구조의 특성 수정.
Abstract
이 보고서는 N-터미널 1, 2-dithiolane의 합성에 초점을 맞추고 수정 자가 조립 펩 티 드 및 그 결과의 특성은 자기 supramolecular 구조를 조립. 합성 경로 dithiolane 선구자 분자, 3-(acetylthio)-2의 수 지에 결합 된 단단한 단계 펩 티 드 종합의 이용-(acetylthiomethyl) propanoic 산, 그리고 전자 레인지를 이용한 thioacetate는 펩 티 드의 deprotection 1, 2-dithiolane를 수 지에서 최종 분열 하기 전에 N-말단 펩 티 드를 수정. 1, 2-dithiolane 펩타이드, Alzheimer의 질병과 관련 된 Aβ 펩 티 드의 nucleating 코어에서 파생 된의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 정화 후 펩 티 드 크로스-β 녹말 체 섬유에 조립 자체에 표시 됩니다. 푸리에 변환 적외선 분광학 (IR FT), 원형이 색 성 분광학 (CD) 및 전송 전자 현미경 (TEM) 녹말 체 섬유의 특성 프로토콜 표시 됩니다. 잘 특징이 자가 조립 펩 티 드를 1, 2 dithiolane moiety와 N 맨끝 수정 방법 지금 모델 시스템 조립 후 수정 전략을 개발 하 고에 동적 공유 화학 탐험 탐험 하실 수 있습니다. supramolecular 펩타이드 nanofiber 표면입니다.
Introduction
단단한 단계 펩 티 드 합성에 참여 하는 강력한 펩 티 드 결합 형성 화학 고 제어 시퀀스 길이 구성 능력 자체는 무 겁 게 연구 분야 supramolecular 구조로 조립 펩 티 드. 펩타이드 자기 조립된 구조, 입체 사이드 체인을 포함 하 여 있고 정전기 상호 작용, 수소 결합, 소수 성 효과1, 안정화 및 제어 하는 요소는 디자인 규칙의 집합으로 제공 합니다. 이러한 기본적인 디자인 규칙에 대 한 연구 진행을 계속, 펩 티 드에 논리적인 다음 단계 자기 조립 포함 한다 펩 티 드 기반 구조와 기능의 다양성을 확대. 펩 티 드를 자체 조립 하는 동안은 많은 생물 의학 응용 프로그램에 대 한 펩 티 드 순서 또는 어셈블리 조건2,3,4, 개발 전략을 조정 하 여 사용 된 다양 한 소재 펩 티 드 nanofibers5,6,7,,89 조립 후 수정 상대적으로 미개척된 지역에 남아 있다.
Supramolecular 구조의 표면에 동적 이황화 exchange thiol 화학 잠재력이 새로운 고 기능성 바이오 소재를 하나의 영역입니다. Liposome 시스템10,11, 블록 공중 합체12,13에서 것과 같이 1, 2 dithiolane moieties (일반적으로 리 포 산 (la) 또는 asparagusic 산 (aa)의 파생)의 보고 표면14,15에서 앵커를 조직. 여기, 우리 보고 합성과 자기 조립 펩 티 드에는 N-1, 2-dithiolane 기능 그룹16, 수정 된 Alzheimer의 질병과 관련 된 Aβ 펩 티 드의 nucleating 코어에서 파생 된의 17. 결과 supramolecular 섬유는 지금 녹말 체 섬유18supramolecular 표면에 이황화 교환 및 thiol 반응성 연구 실험 플랫폼 역할을 합니다.
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Protocol
1. 합성 및 1, 2-Dithiolane의 정화 수정 펩 티 드
- Dithiolane 선구자, 3-(acetylthio)-2의 합성-(acetylthiomethyl) propanoic 산19.
- 3의 1 g 추가-브로 모-2-(bromomethyl) 프로 산 (1 equiv.) 최소한의 55 ° c.에 감동과 25 mL 둥근 바닥 반응 플라스 크를 1 M NaOH (약 4 mL)에 녹 격 막으로 반응 플라스 크를 밀봉 하 고 질소 분위기에서 장소.
- 칼륨 thioacetate의 1.49 g를 포함 하는 솔루션을 준비 (3.2 equiv.) 4 ml 이온된 수의 및 2 M 황산의 3 mL (H2등4) 만드는 thioacetic 산 현장에.
- 플라스틱 일회용 10 mL 주사기로 thioacetic 산 성 솔루션을 당겨 하 고 주사기에 바늘을 놓습니다. 추가 혼합물 dropwise 반응 플라스 크에는 septa 통해 바늘과 피어 싱으로. 55 ° c.에 반응을 밤새 계속
- 메탄올과 dichloromethane (1:9)의 혼합물을 사용 하 여 실리 카 젤 60 F254 접시에 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 반응을 모니터링 합니다. Bromocresol 녹색 얼룩에 의해 반응 진행을 시각화. 제품에는 Rf = 0.57.
- 반응이 완전 하 고 실내 온도에 냉각 후 시 어 지 다 pH 1 2 M H2에 혼합 그래서4. 노란 기름 솔루션에서 분리합니다.
- 감기 클로 프롬 (40 mL x 3)와 함께 제품을 압축을 풉니다. 유기 레이어를 결합 하 고 황산 마그네슘에 건조. 감소 된 압력 하에서 클로 프롬을 제거 합니다.
- 그림 1B 와 C에서 같이 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 절연된 제품, 1의 id를 확인 합니다. 다음과 같은 결과: 1H NMR, CDCl3, 300 MHz: d = 10.1 (b, 1 시간), 3.2 (m, 4 시간), (m, 1 시간) 2.9, 2.4 (s, 6 H); 13 C NMR, CDCl3, 75 MHz: d 195.1 (채널3C운영 체제-) = 177.6 (-C우), 45.1 (-CH2S-), 30.5 (CH), 29.2 (-SCOCH3).
참고: 제품 노란색 오일 이며, 83%의 전반적인 수확량을 있다. 더 정화 없이 제품을 사용 합니다.
- SPPS과 Dithiolane 전조의 수 지에 결합
참고: 아래 설명 된 단단한 단계 펩 티 드 합성 자동된 펩타이드 합성기, 권장된 제조업체의 프로토콜 다음에 실시 됐다. 특수 아미노산을 사용 하는 경우 설정 및 시 약 또는 다른 상업적인 악기에 대 한 적응 수 있습니다.- 그리고 링크 아 미드 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) 수 지 (0.1 m m o l)의 0.156 g 밖으로 무게는 반응 용기에. 합성의 시작 이전에 적어도 15 분 동안 dimethylformamide (DMF)에서 수 지를 팽창.
- 4 해당 각 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)의 밖으로 무게 순서에 0.152 g의 아미노산 (0.4 mmol) 보호 N, N, N', N'-tetramethyl-O-(1H-benotriazol-1-yl) 우라늄 hexafluorophosphate (0.4 mmol, HBTU)에 대 한 시퀀스에 있는 각 아미노산의 산. 각 카트리지는 보호 Fmoc 아미노산 및 HBTU 포함 되어 있습니다.
- 모든 사전 합성 신디사이저에 대 한 검사를 실행 한 후 (리필 시 약, 시 약 라인 플러시 및 가압 모든 시 약 병), c에서 회전 목마에 아미노산 카트리지를 놓고 ' n ' 종점 방향. 마지막 N 맨끝 Fmoc deprotection 단계에 대 한 최종 아미노산 위치 후 빈 카트리지를 놓습니다.
- 표준 권장된 설정을 사용 하 여 펩 티 드를 음성 합성.
- DMF (5 분 x 2)에서 20 %piperidine 5 mL와 수 지에서 Fmoc 그룹 deprotect
- 커플링 단계 전에 DMF (6 x 5 mL)와 수 지를 세척.
- 단일 결합 단계에 대 한 보호 Fmoc 아미노산을 HBTU 사용 DMF에 0.4 M N-methylmorpholine의 4 mL을 추가 합니다. 30 아미노산 Fmoc 보호 솔루션 활성화 솔루션 반응 배를 전송 하기 전에 s.
참고: 자동된 펩타이드 합성기는 수 지와 혼합 솔루션 버블링 N2 가스에 의해 모든 30의 커플링 반응 하면서 20 분 걸립니다 장소. 수동 펩 티 드 합성에 대 한 연결 단계 동안 낮은 속도로 궤도 셰이 커에 반응 배를 놓습니다. - 솔루션 배수와 DMF (3 x 5 mL)와 수 지를 세척.
- 1.2.4.1 1.2.4.4 통해 단계를 반복 하 여 C에서 각 보호 Fmoc 아미노산에 대 한 ' n '-관심의 펩 티 드를 합성 하 종점 방향.
- 마지막 N 맨끝 deprotection 단계 후 일회용 fritted 주사기에 수 지를 전송 합니다. DMF (3 x 5 mL)와 dichloromethane (DCM, 3 x 5 mL) 수 지를 세척.
참고: 수 지 DCM 진공 desiccator 세척 후 저장할 수 있습니다. 수 지 커플링 이전 저장 된 경우 커플링 반응 전에 DMF에 수 지를 확인 합니다. - N, N-diisopropylethylamine (DIPEA)의 HBTU의 4 등가물와 10 1, DMF의 5 mL의 4 항목을 추가 하 여 dithiolane 전조 (1)-수 지 펩 티 드의 N-말단에 결합. 미리 fritted 주사기를 포함 하는 수 지를 추가 하기 전에 10 분 동안 커플링 혼합물을 활성화 합니다.
- 흔들어 2 h에 대 한 커플링 반응. 2 시간 후 DMF (3 x 5 mL)와 수 지를 세척 하 고 하룻밤 떨고와 커플링 반응 반복 합니다.
- 두 번째 연결 후 DCM (3 x 5 mL)와 DMF (3 x 5 mL) 수 지를 세척.
참고: 수 지 저장할 수 있습니다 진공에서이 시점에서 분열까지.
- Thioacetate Deprotection 및 수 지에서 펩 티 드 분열
- N-말단 dithiolane 전조에서 thioacetate 그룹 deprotect, 10 mL 전자 레인지 반응 관에 말린된 수 지를 전송를 DMF의 2 개 mL를 추가 합니다. 팽창, 선박, 작은 자석 볶음 바를 추가 하 고 다시 15 분 동안 자석 교 반 속도가 낮은 중단에 수 지를 수 있습니다.
- 수산화 암모늄 농도의 2 개 mL를 추가, 실리콘 격 막과 반응 배 모자 고 반응 배 감동으로 45 분 75 ° C의 전자 레인지 설정을 사용 하 여 전자 레인지 반응 합니다.
- 전자 레인지 반응 완료 후 깨끗 한 일회용 fritted 주사기에 수 지를 전송 합니다. DMF (2 x 5 mL)와 메탄올 (MeOH, 2 x 5 mL) 씻으십시오.
- 5 mL의 전체 볼륨에 대 한 메탄올 (1:4)에 집중된 수산화 암모늄의 솔루션을 추가 합니다. Dithiolane 링에서 이황화 결합의 intramolecular 산화를 증가 하룻밤 흔들어 둡니다.
- 워시 MeOH (2 x 5 mL)와 DCM (3 x 5 mL) 수 지.
참고: 말린된 수 지 저장할 수 있습니다 진공 desiccator에이 시점에서. - 부드럽게 1.5 h에 대 한 동요와 주사기를 포함 하는 수 지에 분열 칵테일을 추가 합니다. 사용 분열 칵테일 95 %trifluoroacetic 산 (TFA), 2.5 %triisopropylsilane (팁), 그리고 2.5% 물 5 mL의 총 볼륨입니다.
주의: 화학 연기 후드만 작동 합니다. TFA는 휘발성과 부식성.
참고: 시퀀스 펩 티 드와 아미노산 sidechain 보호 그룹의 대부분 위의 절단 칵테일 솔루션은 충분 한; 그러나, 다른 분열 칵테일 보호 그룹 (Arg, Trp, 메트로, Cys 포함 된 특정 펩 티 드) 또는 다른 수 지 화학20특정 아미노산 사이드 체인에 대 한 필요할 수 있습니다. - Fritted 주사기에서 dropwise 추가 의해 원유 펩 티 드 25 mL 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 diethyl 에테르로 침전. 펩 티 드 흰색 고체로 침전. 펠 릿 10 분 대 한 1300 x g에서 원심 분리 하 여 펩타이드는 신중 하 게 쓰레기 수 거에 대 한 별도 용기에 diethyl 에테르를 가만히 따르다.
- Diethyl 에테르의 또 다른 25 mL 원뿔 튜브를 추가 하 고 다시 침전 vortexing에 의해 일시 중단. 10 분 동안 1300 x g에서 원심 분리를 반복 하 고 다시 diethyl 에테르를 가만히 따르다. 진공에서 펠 릿 건조.
- 1, 2-Dithiolane의 정화 수정 펩 티 드
참고: 역 상 HPLC에 의해 원유 펩 티 드를 정화. 수집 및 결합 하는 펩 티 드 봉우리 고 TOF MALDI 질량 분석에 의해 질량을 확인 합니다.- 최소한의 양의 0.1% 이기에 원유 펩 티 드 펠 릿 분해 TFA. 펩 티 드의 hydrophobicity 및 집계 성향, 가용성에 원조를 40 ° C에서 샘플을 열 부드럽게.
참고: 잠재적인 이황화 교환 반응21,,2223을 방지 하기 위해 높은 온도 및 펩 티 드의 쥡니다 피하십시오. - 원유 펩 티 드의 1 mL HPLC 정화를 준비 하려면 추가할 집중된 펩 티 드의 400 μ 이기에 H2O 0.1 %TFA 필터의 600 μ 22 μ m 주사기 필터를 통해 HPLC 유리병에. 추가 5% 소 프로 파 놀 펩타이드 집계 및 강 수를 방지 하기 위해 추가할 수 있습니다.
- 정화 C-18 반 대리점 열을 사용 하 여 20 분 세트 15-55% 이기의 선형 그라데이션을 통해 3 mL/min의 유량과 펩 티 드 222에 UV 검출기 (아 미드 백본) 및 330 nm (이황화 결합). 수집 하 고 (그림 2A)의 봉우리를 결합.
- MALDI TOF 질량 분석기 reflectron 모드 (그림 2B)에 의해 펩 티 드 제품 질량을 확인 합니다. 분석, 2, 5-dihydroxybenzoic 산 (DHB) 매트릭스의 0.5 μ MALDI 격판덮개에 수집 된 피크의 0.5 μ 혼합 (10 mg/mL DHB 50% 이기, 0.1 %TFA).
참고: 일반적인 adducts MALDI TOF에서 질량 분석 포함 나트륨 및 칼륨 소금 adduct ([M + 나]+ [M + k]+) 봉우리. 권장 분석 전에 샘플 담 소금 adduct 봉우리 주요 [M + H]+ 의 신호를 억제. 또한, [M + O]+ 의 산화 피크 감지 1, 2-dithiolane 수정 펩 티 드에. DHB 매트릭스를 사용 하 여 MALDI 이온화에서 레이저 유도 된 산화에 대 한 보고서 샘플 농도, 용 매, 및 레이저 강도 포함 하 여 요인 제한 MALDI 유발 산화 유물24수정할 수 있습니다 제안 합니다. - 정확한 질량의 MALDI TOF 확인, 후 플래시 동결 후 펩 티 드를 lyophilize. 어셈블리까지 진공에서 동결 건조 된 펩 티 드 분말을 유지.
- 최소한의 양의 0.1% 이기에 원유 펩 티 드 펠 릿 분해 TFA. 펩 티 드의 hydrophobicity 및 집계 성향, 가용성에 원조를 40 ° C에서 샘플을 열 부드럽게.
2. 특성화 Supramolecular의 자기 조립 구조
-
녹말 체 섬유의 형성
- 자기 집합 솔루션을 준비 하려면 분석 균형을 사용 하 여 펩 티 드 분말의 1 밀리 그램으로 무게. 20% 이기와 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 1 mg/mL의 펩 티 드 어셈블리 혼합물의 최종 농도에 1.5 mL microcentrifuge 튜브 혼합 (pH 7.5)로. 소용돌이 어셈블리 솔루션 고 떠나 실 온에서 조립.
-
녹말 체 섬유의 분 광 특성
- 며칠 마다 퓨 리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학을 통해 펩 티 드 어셈블리 프로세스를 따릅니다. 1670 c m-1 을 중심으로 광범위 한 피크 샘플17unassembled 펩 티 드에서 발생 하는 IR 서명입니다. 펩 티 드 어셈블리 샘플은 보통 1 ~ 2 주 사라지고 성숙에 도달 하는 광범위 한 unassembled 피크에 대 한 가져가 라.
- ATR 다이아몬드 크리스탈에 박막으로 어셈블리 솔루션의 8-10 μ의 약 수를 건조. 드라이 필름 양식으로 1640에서 1630 cm-1 에 크고 넓은 물 피크의 실종을 모니터링 합니다.
- 2 cm-1 해상도 50 검사 평균 1500-1800 c m-1 에서 IR 스펙트럼을 취득 합니다. 취득 하 고 각 샘플 스캔 이전 배경 검사를 뺍니다. Β-시트 어셈블리에 대 한 IR 서명을 1625 및 1635 c m-1 (그림 3A)25,26사이 예리한 피크입니다.
- 원형이 색 성 (CD)에 의해 β 시트 풍부한 supramolecular 구조로 펩 티 드 어셈블리를 특징. Peltier 온도 조절 시스템 CD spectropolarimeter를 사용 하 여 스펙트럼을 기록 합니다.
- 30 μ를 0.1 m m 경로 길이 microcuvette에서 어셈블리 솔루션의 플라스틱
참고: 셀 홀더 클램프 및 악기의 짧은 경로 길이 셀 위치에 필요 합니다. - 각 스펙트럼에 대 한 다음 매개 변수를 CD 악기 설정: 스캔 300의 파장 180 nm, 100/min의 스캐닝 비율, 밴드 너비 1 nm, 25 ° C, 평균 3 검사의 nm.
- 버퍼 (20% 이기/10 mM HEPES, pH 7.5)의 스펙트럼을 수집 하 고 각 샘플 스캔 컨트롤에서 뺍니다. Β-시트의 CD 서명을 한 타원 최소 중심 약 220 nm (그림 3B)27이다.
- 30 μ를 0.1 m m 경로 길이 microcuvette에서 어셈블리 솔루션의 플라스틱
- 며칠 마다 퓨 리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학을 통해 펩 티 드 어셈블리 프로세스를 따릅니다. 1670 c m-1 을 중심으로 광범위 한 피크 샘플17unassembled 펩 티 드에서 발생 하는 IR 서명입니다. 펩 티 드 어셈블리 샘플은 보통 1 ~ 2 주 사라지고 성숙에 도달 하는 광범위 한 unassembled 피크에 대 한 가져가 라.
-
녹말 체 섬유의 현미경 검사 법
- Β-시트 풍부한 supramolecular 구조로 성숙 펩 티 드 샘플에 대 한 2 ~ 3 주가 소요 됩니다.
참고: 어셈블리 수 수 몇 군데 뿐만 아니라 어셈블리 프로세스의 이전 단계에서 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여.- 10 μ 가장 탄소 격자의 표면에 펩 티 드 어셈블리 솔루션의 플라스틱
참고:을 격자 표면에 피 펫 팁을 건드리지 않도록 주의 합니다. 높은 정밀도, 자동 닫기 핀셋 준비 도중 가장 그리드를 개최 하는 데 사용 됩니다. - 어셈블리 격자 표면에 흡착 수 있도록 1-2 분 기다립니다. 격자의 가장자리에 필터 종이 만져 초과 샘플을 제거 합니다.
- 이온을 제거 된 물 100 μ 상용 4 %uranyl 아세테이트 솔루션에 추가 하 여 2 %uranyl 아세테이트 얼룩을 준비 합니다. 플라스틱 격자 표면에 2 %uranyl 아세테이트 얼룩의 10 μ 그리고 2-3 분 동안 품 어. 부 화 후는 격자의 가장자리에 필터 종이 만져 초과 얼룩을 제거 합니다.
- 밤새 진공 desiccator에 가장 격자 배치 합니다. 진공에서 영상까지 저장 합니다.
- 가장 (그림 3C)와 함께 준비 된 샘플 이미지. 현미경 검사 법에 대 한 일반 매개 변수는 다음과 같습니다: 9300 X에서에서 23 일 까지의 배율에서 이미지 000 X, 텅스텐 필 라 멘 트 120의 가속 전압 kV.
참고: ImageJ supramolecular 구조의 획득된 가장 이미지28의 평균 섬유 폭을 측정 하는 사용할 수 있습니다.
주의: 사용 하기 전에 모든 관련 안전 데이터 시트 (SDS)를 참조 하십시오. 여러 화학 물질 합성, 정화, 사용 그리고 설명된 1, 2-dithiolane의 수정 자가 조립 펩 티 드의 부식성 또는 독성 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다. 항상 적절 한 개인 보호 장비 (안전 안경, 연구실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발 포함)를 사용 하 여 실험실에서 작업 하는 경우.
- 10 μ 가장 탄소 격자의 표면에 펩 티 드 어셈블리 솔루션의 플라스틱
- Β-시트 풍부한 supramolecular 구조로 성숙 펩 티 드 샘플에 대 한 2 ~ 3 주가 소요 됩니다.
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Representative Results
Dithiolane 선구자 분자의 초기 단계 합성 이외에도 1, 2-dithiolane 수정 펩 티 드 종합의 나머지 고체 지원 (그림 1A)에서 발생합니다. 3의 변환-브로 모-2-(bromomethyl) 프로 산 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl) propanoic 산, dithiolane 전조 1H에 의해 확인 되 고 전에 13C NMR (그림 1B 와 C)는 자유에 결합 여전히 수 지에 펩 티 드의 N-말단 아민. 수산화 암모늄과 thiols에 thioacetate의 deprotection 전자 레인지 반응 기를 사용 하 여 수행 되 고 1, 2-dithiolane 수정 펩 티 드 수 지에서 죽 습 하기 전에 1, 2-dithiolane 메탄올에서 하룻밤 산화 이다. 원유 펩 티 드 역 상 HPLC (그림 2A) 정화 하 고 제품의 질량 TOF MALDI 질량 분석 (그림 2B)에 의해 확인 됩니다.
자체 정화 1, 2-dithiolane 펩 티 드 2-3 주 동안 성숙한 녹말 체 섬유에 조립. FT-적외선 (그림 3A)와 CD 분광학 (그림 3B) 어셈블리 프로세스를 수행 하 고 확장된 β 장 구조 특성에 사용 됩니다. 섬유는 가장 (그림 3C)에 의해 몇 군데.
그림 1입니다. 1, 2 dithiolane 선구자 분자의 특성에 대 한 합성 체계. 최종 1, 2-dithiolane 수정 펩 티 드, 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2의 (A) 합성 체계. (B) 1H NMR의 3-(acetylthio)-2-300 MHz. (C)13C NMR의 3-(acetylthio)-2 CDCl3 propanoic 산 (acetylthiomethyl)-(acetylthiomethyl) propanoic 산 CDCl3 에 75 MHz. 에서에서 여기를 클릭 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면.
그림 2입니다. 1, 2-dithiolane의 합성 펩 티 드를 수정. 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2의 정화에서 (A) HPLC 크로마. (B) reflectron 모드 DHB 매트릭스를 사용 하 여 HPLC 정화 (~17.5 분의 보존 기간)에서 주요 피크의 MALDI TOF 질량 스펙트럼의 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2계산 된 질량을 확인 합니다. 공통 adducts도 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 1, 2-dithiolane의 supramolecular 특성 수정 펩 티 드. (A) FT-적외선 1 mg/mL 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 섬유의 조립 10 mM HEPES, pH 7.5에 20%에서에서 CH3CN. 1627 c m-1 에서 피크는 펩 티 드 β 장 구조에 일치 합니다. (B) 1 mg/mL 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 섬유의 CD 10 mM HEPES, pH 7.5에 20% 채널3CN에서에서 조립. 218에서 최소 타원 nm β 장 구조에 조립 하는 펩 티 드와 일치 하는. (C) 가장에 의해 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 녹말 체 섬유 (2 %uranyl 아세테이트의 부정적인 얼룩)의 이미지. 눈금 막대는 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서는 모두 종합의 세부 사항 및 N 맨끝 1, 2-dithiolane 수정 자가 조립 펩타이드의 정화와 결과 supramolecular 구조의 특성을 설명합니다. 여기에서 보고 된 1, 2-dithiolane 펩타이드의 합성 장점이, dithiolane 선구자, 3-(acetylthio)-2 생산 하기 위해 한 단계 합성을 포함 하 여-(acetylthiomethyl) propanoic 산, 고 수 지에의 deprotection 반응 전자 레인지는 히드라 진 독성 deprotection 안전한 대안 보고 이전29수산화 암모늄을 이용 하 여 산화 1, 2-dithiolane moiety를 그룹을 보호 하는 선구자 thioacetate. (그림 1A) 1, 2 dithiolane 펩 티 드의 전반적인 단단한 단계 펩 티 드 합성 시퀀스 길이 및 구성, Fmoc 보호 부자연 스러운 아미노산, 및 C 터미널 수 지 화학에 맞게 사용 하는 등 변경 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 많은 다른 연구 응용 프로그램입니다.
방지 하기 위해 원치 않는 펩 티 드 부산물 및 사이드 체인 아미노산 또는 아미노산 그룹 보호와 사후 분열 제품 있을 때, 추가적인 청소부 분열 칵테일20에 추가 되어야 합니다. 작은 부분 (10% 미만 총 수 지의)의 테스트 분열 커플링 반응의 높은 수익률을 보장 하는 수 지에 전자 레인지 deprotection 단계 전에 수행할 수 있습니다. 열 및 HPLC 조건 보고서에 설명 된 사용 하 여, thioacetate 보호 1, 2-dithiolane 전조 펩타이드 피크 uncoupled 무료 아민 펩 티 드 후 5 분을 elutes. 경우 무료 아민 펩 티 드의 상당량 남아, 다른 커플링 단계 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl) propanoic 산 것이 좋습니다. Intramolecular 1, 2-dithiolane 이황화 결합에서 HPLC에 330에 약한 이황화 결합 흡 광도 모니터링 하 여 감지 되 nm. HPLC 피크에 해당 하는 산화 1, 2-dithiolane를 실행 하는 별도 HPLC에 펩 티 드 샘플 100 m m tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)의 100 L을 추가 하 여 확인 된다. TCEP 감소 thiol 펩 티 드를 포함 하는 산화 이황화 펩 티 드 보다는 다른 보존 시간이 있을 것 이다. Thiol 펩 티 드를 포함 하는 약 1 분 나중에 보고서에 설명 된 조건과 열을 사용 하 여 이황화 펩 티 드 보다 elutes. 펩 티 드에 대 한 적당 한 대체 MALDI 행렬은 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 및 0.1%와 50% 이기의 1 mL을 추가 하 여 준비 TFA CHCA의 5 밀리 그램. 샘플 (+ Na와 K+) 소금 adduct 봉우리는 크게 [M + H]+ 피크 억제 TOF MALDI 질량 분석 전에 C18 zip-팁을 사용 하 여 desalted 될 수 있습니다.
이러한 연구에 대 한 선택 하는 펩 티 드 순서30, Alzheimer의 질병 관련 된 Aβ-펩타이드의 네덜란드 돌연변이에서 파생 됩니다 그리고 이전 자체 평행 β-시트16,17의 녹말 체 섬유에 조립 보여왔다 . 대표 결과,-C, 그림 3A같이 1, 2-dithiolane-KLVFFAQ-NH2 펩 티 드 또한 녹말 체 섬유에 조립. FTIR 아 미드 나 스트레칭 1627 c m-1 와 CD 타원 218에서 최소 중심으로 nm는 β-시트 어셈블리25,,2627, 1676 cm-1에 생성 CO 스트레치의 분 광 서명을 글루타민 사이드 체인 상호 작용 제안 병렬 β-가닥16,,3132에 펩 티 드 구성 됩니다 주문에 해당 하.
2 %uranyl 아세테이트 부정적인 얼룩를 사용 하 여 전송 전자 현미경 이미지 표시 확장 및 왜곡 supramolecular 섬유를 약 10 nm 폭에서. N 맨끝 acetylated 펩 티 드, Ac-KLVFFAQ-NH2의 섬유는 부드럽고 거의 12 nm16의 약간 더 큰 폭으로 직선. 이므로 가장 격자를 준비 하 고 이미지 획득 시간 집중 과정, 한 번에 다양 한 펩 티 드 농도의 동일한 어셈블리 샘플에서 여러 편 격자 준비 최상 이다. 원래 어셈블리 솔루션 샘플 함께 가장 1시 50분 (1: 100)에 대 한 희석된 샘플을 준비 합니다. 높은 농도에서 녹말 체 섬유 수 있습니다 덩어리 또는 패치 그리드를 준수 하 고 개별 섬유의 이미지를 획득 하는 어려울 수 있습니다. 폭 측정에 대 한 개별 섬유의 가장자리를 참조 하는 것이 중요 하다 고 섬유 helicity의 시각화는 종종 밀된 샘플에 의해 가려진.
Supramolecular 생체 재료를 사용 하 여 더 많은 응용 프로그램을 탐험 되 고는, 자기 조립 자가 조립 단위체에 프로세스에 직교 하는 잠재적으로 반응성 기능 그룹을 통합할 필요가 있다. 이 보고서에 설명 된 방법을 supramolecular 구조의 광 특성 및 1, 2-dithiolane 수정 자가 조립 펩 티 드의 합성 수 지에 접근을 강조 표시 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 B. 엘렌 Scanley 그녀의 기술 교육에 대 한 감사 하 고 사용 하 여 도움말에서 가장 코네티컷 주립 대학 및 대학 (CSCU) 센터에 나노기술 및 박사 크레이지 Mukerji 웨슬리언 대학에서 그녀의 CD에 대 한 접근 하 고 싶습니다. 분 광 광도 계입니다. 페어필드 대학, NASA 코네티컷 공간 그랜트 협회에서 과학 연구소 및 국립 과학 재단 그랜트 수 체-1624774에서 보고 작업 부분에 지원 한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rink amide MBHA resin, high load | Gyros Protein Technologies | RAM-5-HL | Avoid contact with skin and eyes; do not inhale |
| N,N-Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | Flammable liquid and vapor; irritating to eyes and skin; Use personal protective equipment; keep away from open flame |
| Fmoc-L-Val-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-V | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Leu-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-L | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-KBC | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Phe-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-F | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Ala-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-A | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH | Gyros Protein Technologies | FLA-25-QT | Wear personal protective equipment; do not inhale |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate | Gyros Protein Technologies | 26432 | Causes skin, eye and respiratory irritation; do not inhale; use under hood or in well ventilated area |
| 0.4 M N-methylmorpholine in DMF | Gyros Protein Technologies | PS3-MM-L | highly flammable; wear personal protective equipment; keep away from heat and keep container tightly closed; do not inhale or swallow; wash skin thoroughly after handling |
| 20% piperidine in DMF | Gyros Protein Technologies | PS3-PPR-L | Causes severe eye and skin burns; Flammable Liquid and vapor; Do not inhale |
| dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | May cause cancer; Do not inhale; Wear personal protective equipment; use under hood only; if contacted rise with water for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | Flammable; irritating to eyes; Use personal protective equipment; Use only under a fume hood; keep away from open flame or hot surface; if contacted rinse wiith water for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | A116-50 | Causes severe burns; do not inhale; harmful to aquatic life; use personal protective equipment; use only under fume hood; if contacted rinse with water for at least 15 minutes and obain immediate medical attention |
| 4% uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-4 | Do not inhale; harmful to aquatic life |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Acros Organics | AC172571000 | Do not inhale; use outdoors or in well-ventilated area |
| nitrogen Gas | TechAir | Contents under pressure, may explode if heated | |
| 3-bromo-2-(bromomethyl)propionic acid | Alfa Aesar | AAA1963014 | Do not inhale; causes irritation to skin and eyes; corrosive |
| sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Use personal protective equipment; use only under fume hood; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| potassium thioacetate | Acros Organics | AC221300250 | Causes skin and eye irritation; do not inhale; use personal protective equipment |
| sulfuric acid | Fisher Scientific | SA213 | Causes burns; keep away from water; keep away from combustible material; do not inhale; use personal protective equipment; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| N,N-diisopropylethylamine | Acros Organics | AC367841000 | Highly flammable; harmful to aquatic life; wear personal protective equipment; do not swallow |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Corrosive; do not inhale |
| methanol | Fisher Scientific | A452-4 | Flammable liquid and vapor; use personal protective equipment; do not inhale; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention |
| triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781 | Flammable; use personal proctective safety equipment; keep container tightly closed |
| diethyl ether | Fisher Scientific | E138-1 | Extremely flammable; Irritating to skin and eyes; Use personal protective equipment |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich | 39319-10x10MG-F | do not inhale; irritating to skin and eyes |
| alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Alfa Aesar | AAJ67635EXK | |
| c18 zip-tip | Millipore | ZTC18S096 | |
| tris(2-carboxyethyl) phospine hydrochloride | Thermo Scientific | PI20490 | |
| silica gel 60 F254 coated aluminum-backed TLC sheets | EMD Millipore | 1.05549.0001 | |
| Thin walled Precision NMR tubes | Bel-Art | 663000585 | 5mm O.D. |
| All-plastic Norm-Ject syringes | Air Tite | AL10 | |
| single-use needle | BD PrecisionGlide | BD 305185 | used needles get disposed on in sharps waste container |
| disposable fritted syringe | Torviq | SF1000LL | 10mL fritted syringes were used in the report, but larger syringes are avaibale if needed for larger scale synthesis. |
| carbon grid | Ted Pella, Inc. | CF200-CU | Make sure to prepare samples and staining on the carbon grid side, not the shiny copper side of grid |
| self-closing tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78318-3X | very sharp tips, length: 120 mm |
| 0.1 mm short path length cell | Starna Cells, Inc. | 20/C-Q-0.1 | Fragile |
| 10mL Vessel Caps | CEM | 909210 | |
| 10mL Pressure Vessels | CEM | 908035 | |
| Aeris Semi-Prep HPLC column | Phenomenex | 00F-4632-N0 | 150 x 10mm |
| cell holder | Starna Cells, Inc. | CH-2049 | Needed when using short pathlength cells |
| PS3 peptide synthesizer | Gyros Protein Technologies | ||
| DiscoverSP Microwave Reactor | CEM | ||
| centrifuge | HERMLE | Z 206 A | used a fixed 6x50 mL rotor |
| HPLC | Shimadzu | UV Detector | |
| nuclear magnetic resonance spectrometer | Avance, Bruker | 300 MHz | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Axima Confidence, Shimadzu | ||
| lyophilizer | Millrock Technology | BT85A | |
| Fourier-Transform Infrared Spectrometer | Alpha Tensor, Bruker | ||
| Transmission Electron Microscope | Tecnai Spirit, FEI | Used with Gatan Orius Fiberoptic CCD digital camera. Accessed at CSCU Center for Nanotechnology | |
| Circular Dichroism Spectropolarimeter | J-810, JASCO | Used with a six-cell Peltier temperature controller. Accessed at Wesleyan University. |
References
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