Summary
Parakrin och juxtacrine cellulära interaktioner har en viktig roll i många biologiska processer, inklusive tumör progression, immunsvar, angiogenes och utveckling. Här, en proximal kultur metoden används för att studera parakrin signalering där lokaliserade koncentrationerna av de utsöndrade faktorerna upprätthålls samtidigt förhindra cellulära direktkontakt.
Abstract
Intercellulära interaktioner har en viktig roll i många biologiska processer, inklusive tumör progression, immunsvar, angiogenes och utveckling. Parakrin eller juxtacrine signalering förmedlar sådana interaktioner. Användning av en betingad medium och coculture studier är de vanligaste metoderna att diskriminera mellan dessa två typer av interaktioner. Dock effekten av lokaliserade höga koncentrationer av utsöndrade faktorer i mikromiljö under parakrin interaktioner är inte korrekt återgetts av konditionerat medium och, således, kan leda till otydliga slutsatser. För att lösa detta problem, har vi utarbetat en proximal kultur metod för att studera parakrin signalering. De två celltyper odlas på ytorna av en 10 µm tjockt polykarbonat membran med 0,4 µm porer. Porerna möjliggör utbyte av utsöndrade faktorer och, samtidigt, hämmar juxtacrine signalering. Cellerna kan samlas och lyserat på slutpunkten att avgöra effekterna av den parakrin signalering. Förutom att ge för lokaliserade koncentration övertoningar utsöndrade faktorer, är denna metod mottagliga för experiment med längre perioder av kultur, liksom användningen av hämmare. Medan vi använder denna metod för att studera interaktioner mellan äggstockscancer och de mesothelial celler som de stöter på platsen för metastaser, kan det anpassas till eventuella två vidhäftande celltyper för forskare att studera parakrin signalering i olika områden, inklusive tumör mikromiljö, immunologi och utveckling.
Introduction
Rollen av produktiva ömsesidiga växelverkan mellan cancerceller och den tumör närmiljön i tumör progression etablerad väl och har blivit ett stort fokus på forskning inom cancer biologi1. Liknande instanser av dubbelriktad signalering är avgörande under sårläkning, immunsvar, angiogenes, stamceller nischer, och under utveckling2,3,4,5,6 , 7 , 8. ett vanligt tema i alla dessa biologiska processer är att cellerna svarar på olika sätt till extracellulära signaler från sin mikromiljö som avgör cell öde, vävnad fysiologi och sjukdomsprogression. Därför har fokus alltmer vände mot utveckla en bättre förståelse för mekanismerna som är involverade i sådan cell-cell kommunikation. En majoritet av sådana interaktioner innebära parakrin eller juxtacrine signalering mellan celler. Parakrin signalering involverar utsöndringen av särskilda signalering faktorer en cell som uppfattas av motsvarande receptorer på en annan cell i närheten, utlöser ett svar i det9,10, medan juxtacrine signalering kräver direktkontakt mellan cellulära komponenter av två celler inblandade11,12.
Sådan signalering är en avgörande komponent i vävnad homeostas, liksom i den tumör mikromiljö. Cancercellerna nytta parakrin och juxtacrine faktorer från celler i tumör stroma, inklusive cancer-associerade fibroblaster (CAFs), immunceller och adipocyter13,14,15,16. Den parakrin signalering kan medlas av tillväxtfaktorer, cytokiner, chemokiner, etc., medan den juxtacrine signalering innebär bredvid ligander och receptorer som i Notch signalering eller interaktioner mellan integriner och deras respektive extracellulära matrix proteiner. Vi har visat betydelsen av ömsesidiga interaktioner mellan äggstockscancer celler och CAFs i tumör progression och metastasering14. Likaså reglera interaktioner av metastaserande äggstockscancer celler med mesothelial celler som täcker platsen för metastaser nyckel mikroRNA och transkriptionsfaktorer i cancercellerna som främjar metastaserande colonization17, 18.
De flesta studier på parakrin signalering innebär användning av en betingad medium samlas in från en celltyp att behandla den andra celltypen med. Medan detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning, replikerar det effektivt inte de lokaliserade hög-halter av utsöndrade faktorn i närmiljön i den mottagande cellen. Det också misslyckas att reproducera kineticsen av ett kontinuerligt flöde av utsöndrade faktor som produceras av en cell och tas emot av den intilliggande cellen. Parakrin signalering är effektiv över korta avstånd som de utsöndrade faktorerna är vid koncentrationerna som krävs endast i närheten av cellen källa och tenderar att diffus och späd ut när avståndet ökar. Detta lokaliserade hög koncentration av utsöndrade faktorn är viktigt att utlösa en reaktion i cellen receptor. Dessutom är svaret i de mottagande cellerna också beroende av saldot av nyligen utsöndrade faktorer och deras kontinuerliga utarmning genom nedbrytning, bindande och internalisering i mottagarens celler och diffusion från cellen källa. Konditionerat medium kan vara koncentrerad till konto för de högre lokaliserade koncentrationerna som är närvarande i närmiljön, men som inte kan exakt replikera de exakta koncentrationerna. Dessutom kan inte det efterliknar naturliga kineticsen av produktion och utarmning av faktorn som är inblandade. För att mer exakt replikera parakrin signalering och skilja det från juxtacrine signalering mekanismer, har vi utarbetat en roman proximala kultur metod, som innebär växande de två celltyper på antingen ytan av ett poröst membran. Porerna är tillräckligt små för att förhindra juxtacrine interaktioner och ändå tillåta utbyte av utsöndrade faktorer vid lokaliserade höga koncentrationer. På så sätt behåller detta system kineticsen av produktion och utarmning av de parakrin faktorerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i institutionella regelverk Indiana universitetets styrelse.
1. cell förberedelse
-
Isolering och kultur av mänskliga primära mesothelial celler
- Isolera mänskliga primära mesothelial celler (HPMCs) från mänskliga omentum som beskrivs tidigare17,18 och odla dem i slutföra odlingsmedium [Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% vitaminer] vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: HPMCs odlas normalt 100% sammanflödet (figur 1A).
- Isolera mänskliga primära mesothelial celler (HPMCs) från mänskliga omentum som beskrivs tidigare17,18 och odla dem i slutföra odlingsmedium [Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror och 1% vitaminer] vid 37 ° C och 5% CO2.
-
Tillväxt villkorar av äggstockscancer celler
- Växa HeyA8 äggstockscancer celler i komplett odlingsmedium vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Använd HeyA8 celler odlas till ca 80% sammanflödet (figur 1B).
- Växa HeyA8 äggstockscancer celler i komplett odlingsmedium vid 37 ° C och 5% CO2.
2. cellkultur
-
Proximala kultur set-up
- Användning Transwell skär för 6 brunnar med 10 μm tjock vävnad-kultur-behandlat polykarbonat membran med 0,4 μm porer (108 porer/cm2) och ett 4,67 cm2 tillväxtområde. Om det behövs, optimera för olika infoga storlekar genom att skala antalet celler seedade enligt tillväxt yta. Varma komplett odlingsmedium, trypsin och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 37 ° C före användning.
-
Förbereda skären
- För att utsäde HeyA8 cellerna på det lägre ytbehandlar av membranet i skäret, ta insatsen ur förpackningen med steril pincett och placera den inverterade i en steril 15 cm kultur maträtt.
- Använd en 15 cm maträtt, som det har djup att rymma den inverterade infoga eller ersätta det med någon lämplig steril behållare. Beroende på experimentet, placera önskat antal skär i 15 cm skålen.
- Märka de tre kontrollerna och tre experimentella förhållanden med detta med en markör på kanten av skären.
-
Förbereda cancercellerna
- Att trypsinize de HeyA8 cellerna odlas på 80% confluence i en 25 cm2 kolv (~ 2 x 106 celler), tillsätt 1 mL av trypsin (0,25%) för 40 – 60 s och neutralisera trypsin med 6 mL komplett odlingsmedium.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i rumstemperatur (RT) i 3 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 mL komplett odlingsmedium. Räkna de levande cellerna med metoden trypan blått färgämne utslagning.
-
Seedning cancercellerna
- Avbryta 100 000 celler/mL av levande HeyA8 celler i komplett odlingsmedium. Noggrant utsäde 80.000 HeyA8 celler upphängd i 800 μL av komplett odlingsmedium på undersidan av insatsen (som är nu uppåt, eftersom det är inverterad).
- Kärna ur cellerna för att bilda en dome-liknande form så cellerna förblir på skäret (figur 1 c). Börja från mitten av membranet och flytta utåt i koncentriska cirklar medan långsamt pipettering. Undvika att gå mer än 3 mm från kanten att förhindra eventuella spill av mediet.
Anmärkning: Antalet celler seedade beror på ökningen av cellerna och varaktigheten av experimentet. Antalet HeyA8 celler seedade för denna proximala kultur var optimerad och cellerna kommer att vara 80-90% konfluenta i slutet av den tredje dagen.
-
Cancer cell fastsättning
- Täcka 15 cm skålen och försiktigt flytta skålen som innehåller skären till CO2 inkubatorn. Det är viktigt att inte störa droppen medium och celler på Infoga i detta steg. Lämna cellerna vid 37 ° C i 4 h att cancercellerna att bifoga till Infoga.
-
Förbereda de mesothelial cellerna
- Efter ca 4 h, trypsinize de HPMCs som vuxit på 100% confluence i en 75 cm2 kolv (~ 4 x 106 celler) med 2 mL av trypsin (0,25%) för 1 – 2 min och neutralisera trypsin med 12 mL komplett odlingsmedium.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g vid RT för 3 min, Återsuspendera cellpelleten i 10 mL av komplett odlingsmedium och räkna de levande cellerna med metoden trypan blått färgämne utslagning.
-
Seedning mesothelial cellerna
- Avbryta 300 000 celler/mL av levande HPMCs i komplett odlingsmedium. Tillsätt 2,5 mL av färska komplett tillväxtmassmedia till varje brunn 6-bra platta. Försiktigt ta 15 cm skålen som innehåller skär ut till biosäkerhet huven. Med hjälp av steril pincett, flip skäret och placera den i brunnen av 6-väl plattan så att det är upprätt, med HeyA8 celler kopplad till det lägre ytbehandlar nedsänkt i komplett odlingsmedium (figur 1 c).
- Utsäde 450.000 HPMCs upphängd i 1,5 mL odlingsmedium i insidan av skären med HeyA8 celler kopplad till den ytan vänd botten av brunnen (figur 1 c) eller till skär utan någon HeyA8 celler av HPMC-kontrollerna. Tillsätt 1,5 mL odlingsmedium utan celler HeyA8 kontrollerna.
-
Växer den proximala kulturen
- Låt den proximala kulturen växa i CO2 inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för 72 h. Om det behövs kan mediet fyllas enligt följande.
- Insidan av Infoga, ta bort 750 µL och lägga till 750 µL av färska komplett odlingsmedium.
- För utsidan av skäret (6-well plate), ta bort 1 mL och tillsätt 1 mL färsk komplett odlingsmedium. 1 mL valdes för att underlätta för ändra mediet i ett steg. Om så önskas, kan 1,25 mL tas bort och ersättas i stället.
- Låt den proximala kulturen växa i CO2 inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för 72 h. Om det behövs kan mediet fyllas enligt följande.
-
Samla cellerna
- Samla in cellerna efter 72 h av proximala kultur. Var särskilt försiktig i detta steg att förhindra korskontaminering av HeyA8 celler och HPMCs. Trypsinize cellerna, Centrifugera dem och lysera pelleten i stället för lyseringslösning cellerna på membranet att förhindra en korskontaminering.
-
Trypsinizing celler
- Skölj båda sidor av insatsen med 1 x PBS.
- Överför skär till en ny brunn och tillsätt trypsin. Tillsätt 0,5 mL av trypsin till insidan av skäret och tillsätt 2 mL av trypsin till 6-väl plattan till trypsinize de cancerceller som bifogas det lägre ytbehandlar av skäret. Inkubera plattan under 2 minuter vid 37 ° C.
-
Neutralisera trypsin
- Tillsätt 1 mL komplett odlingsmedium på insidan av insatsen att neutralisera trypsin, Pipettera upp och ner, och sedan tar cellerna och överföra dem till en märkt collection tube. Lägga till en ytterligare 2 mL komplett odlingsmedium för en fullständig neutralisering. Inte för att tränga igenom membranet medan pipettering för att förhindra en korskontaminering av cellerna bör du vara försiktig.
- Samla in cellerna längst ner på skäret, en pipett i 2 mL trypsin som lades till i steg 12,2 på bottenyta 2 – 3 x så att cellerna faller till botten av 6-väl plattan. Neutralisera trypsin på botten av plattan med 6 mL odlingsmedium och överför innehållet i plattan till en märkt samling röret.
-
Insamling och lyseringslösning cellerna
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 3 min och aspirera media. Omsuspendera och lysera cell pellets med 0,7 mL fenol - och guanidin-kaliumtiocyanat-baserade lysis reagens för den RNA-extraktionen. Isolera RNA med någon lämplig kit.
3. kvantitativa realtid Polymerase Chain Reaction
Obs: Följande steg beskriver en kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qPCR) för att studera de gen uttryck förändringarna till följd av den proximala kulturen.
- Förbereda cDNA från de RNA-proverna för qPCR. Använda någon lämplig omvänt transkriptas med en motsvarande buffert och slumpmässiga primers för att säkerställa den omvänd transkriptionen av alla mRNA (se Tabell för material).
- Bedöma förändringarna i de mRNA-uttrycksnivåerna för Fibronektin (FN1) och E-cadherin (CDH1) och omvandla tillväxtfaktor beta 1 (TGFβ1) av qPCR med glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) som intern kontroll. Det är möjligt att använda standardiserade kommersiellt tillgängliga gen uttryck analyser (se Tabell för material) eller att designa primers.
- Jämför HeyA8 cellerna odlas i proximala kultur med HPMCs med HeyA8 kontroller och de HPMCs som odlas i proximala kultur med HPMC kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metastaserande äggstockscancer celler stöta mesothelial celler på platsen av metastasering i bukhålan19. Produktiva parakrin och juxtacrine interaktioner med mesothelial celler hjälp för att framkalla adaptiv svaren i äggstockscancer celler, som möjliggör framgångsrika metastaser17,18,20,21 . För att testa effektiviteten av metoden proximala kultur, testade vi parakrin interaktioner mellan HeyA8 äggstockscancer celler och HPMCs. Det har tidigare rapporterats att en coculture av HeyA8 celler med HPMCs resulterar i ett ökat uttryck av Fibronektin i HPMCs21. Denna induktion av Fibronektin expression medieras av en ökad utsöndring av TGFβ av de HeyA8 celler21. Därför testade vi effekten av en proximal kultur av HeyA8 celler och HPMCs på mRNA nivåer av Fibronektin och TGFβ i båda dessa celler. Som förväntat, resulterade proximala kultur med HeyA8 celler i ett ökat uttryck av Fibronektin i de HPMCs jämfört med kontroller som seedade på skären utan HeyA8 celler bifogas den nedre ytan (figur 2A). Likaså den proximala kulturen av HPMCs med HeyA8 celler resulterade i ett ökat uttryck av TGFβ i tidigare (figur 2B). Uttryck för både Fibronektin och TGFβ ökade också betydligt i HeyA8 celler vid proximala kultur med HPMCs jämfört med kontroller där HPMCs inte var seedad i den övre ytan av skären (figur 2 c och 2D).
För att jämföra effekten av den klassiska luftkonditionerade medium strategin, utfört vi ett experiment som behandling av HeyA8 celler med en HPMC-villkorade medium. Det fanns en minskning av Fibronektin uttryck och en betydande förändring i TGFβ i HeyA8 celler behandlas med HPMC-villkorade medium. (Figur 3A och 3B). Vi testade också potential för att blockera den utsöndrade TGFβ med en neutraliserande antikropp i proximala kultur. Behandling med TGFβ neutraliserande antikroppen resulterade i en betydande minskning av induktion av TGFβ i HeyA8 celler i proximala kultur med HPMCs (figur 3 c). TGFβ neutraliserande antikroppen ökade något dock TGFβ uttrycket i kontroll HeyA8 cellerna, förmodligen som en kompenserande respons (figur 3 c).
Dessutom testade vi även effekten av proximala kultur på uttrycksnivåerna av epitelial markören E-cadherin. Samtidigt proximala kultur med HeyA8 celler ökade något E-cadherin uttrycket i HPMCs (figur 2E), observerades en markant minskning av E-cadherin i HeyA8 celler odlas i närheten av HPMCs jämfört med kontroller (figur 2F). Dessa resultat sammantaget och demonstrera effektiviteten av systemets proximala kultur i studera parakrin signalering mellan äggstockscancer celler och normala celler på platsen för metastaser som påverkar genuttryck i båda celltyper under den processen av metastaserande colonization.
Figur 1: montering av proximala kultur systemet. (A) denna panel visar mänskliga primära mesothelial celler (HPMCs). (B) denna panel visar HeyA8 äggstockscancer celler. Skala barer = 200 µm (A-B). (C) HeyA8 celler var seedad på det lägre ytbehandlar av en transwell sätt med 0,4 µm porer. När cellerna fästes, var skäret placerad i ett väl 6-well platta innehållande odlingsmedium. Mesothelial celler seedade sedan i Infoga så att de kopplade till den övre ytan och avskildes från de HeyA8 cellerna av membranet. 0,4 µm porerna i membranet får utbyte av utsöndras faktorer men hämmade någon direktkontakt mellan cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effekten av den proximala kulturen på mRNA uttryck. De första två paneler visar qPCR för (A) Fibronektin och (B) TGFβ1 uttryck i humana primära mesothelial celler (HPMCs) odlade proximalt till HeyA8 celler, jämfört med kontroll HPMCs. Nästa två paneler showen qPCR för (C) Fibronektin och (D) TGFβ1 uttryck i HeyA8 celler odlade proximalt till HPMCs, jämfört med kontroll Heya8 celler. De två sista panelerna visar qPCR av E-cadherin uttryck i (E) HPMCs odlade proximalt till HeyA8 och (F) HeyA8 celler odlade proximalt till HPMCs. N = 3, * p < 0,01. Felstaplar representera standardavvikelsen för de tre repetitioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekten av mänskliga primära mesothelial celler (HPMC)-luftkonditionerade medium behandling på mRNA uttryckt av HeyA8 celler. De översta två panelerna visar qPCR för (A) Fibronektin och (B) TGFβ1 uttryck i HeyA8 celler. (C), denna sista panelen visar effekten av att hämma utsöndrade TGFβ1 med en neutraliserande antikropp (TGFβ1 Ab) på HeyA8 TGFβ1 uttrycket vid en proximal kultur med HPMCs. N = 3, * p < 0,01. p < 0,05. Felstaplar representera standardavvikelsen för de tre repetitioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förstå mekanismen av parakrin och juxtacrine signalering mellan celler är nödvändig för att få bättre kunskap om normal vävnad homeostas och sjukdom villkor7,8. De flesta parakrin signalering studier utförs genom att samla luftkonditionerade medium från en celltyp och använda den för att behandla de andra celltypen. Denna metod har en fördel i dess inneboende enkelhet. Dock det inte korrekt sammanfatta lokaliserade koncentrationerna av de utsöndrade faktorerna i den cellulära närmiljön eller kineticsen av produktion och utarmning av faktorerna som är inblandade. Medan de förstnämnda kan lösas till viss del, men inte exakt, genom att koncentrera det luftkonditionerade mediet, det är mycket svårt att återskapa kinetik. Användning av transwell skär att odla cellerna i insatsen och i botten av brunnen kan, i viss utsträckning återta effekterna av kineticsen av produktion och utarmning. Dock cellerna separeras av avståndet mellan skäret och botten av brunnen och således kan inte återskapa de lokaliserade koncentrationerna av parakrin faktorer. Rapporterade vi utvecklingen av en enkel proximala kultur metod att studera ömsesidiga parakrin signalering, som behöll de lokaliserade höga koncentrationerna av de utsöndrade faktorerna, liksom dynamiken i produktionstakten och utarmning av faktorerna.
I en proof-of-principle studie har visat vi effektiviteten i metoden proximala kultur i reproducera rapporterade effekterna av interaktioner mellan äggstockscancer celler och HPMCs. Dessutom visade vi också motsatta effekterna av ömsesidiga parakrin interaktioner på uttrycket av epitelial markören E-cadherin i HeyA8 celler och HPMCs. Medan vårt experiment involverade odla cellerna under en period på 3 dagar, det kan anpassas till kortare eller längre tidpunkter genom att justera det ursprungliga antalet celler seedade. Detta gör det möjligt för forskare att studera såväl kortsiktiga som långsiktiga effekter av den parakrin signalering eller utföra tidsförlopp studier. Den här enkla metoden kan potentiellt tillämpas på någon forskning på parakrin signalering mellan två vidhäftande celltyper, inklusive immunologi, angiogenes, celltillväxt och sårläkning, förutom studier på den tumör mikromiljö.
De kritiska steg i denna metod sådd cellerna på det lägre ytbehandlar av membranet och skörd cellerna från båda ytorna på slutpunkten. Vi uppnådde en sådd på det lägre ytbehandlar av första vända på Infoga och sedan sådd cellerna som en stor droppe medium. Mer vidhäftande cellen av de två studerade bör vara seedade på bottenytan. Försiktighet måste vidtas för att inte störa insatsen medan ruvar den för att undvika denna klump av medium stör. Silikongel kan tillämpas på kanterna av insatsen att undvika den busting och spill av bubbla av vätska. I slutet av proximala kultur experiment, är cellerna på båda sidor av membranet sekventiellt trypsinized i stället för lyserat direkt, eftersom lyseringslösning dem på den membran risker föroreningen av lysates genom porerna. Genom att trypsinizing dem i deras enskilda delområden och ta hand att medium och trypsin volymen aldrig överstiger det fastställda beloppet av protokollet, undviks eventuella korskontaminering. Varje celltyp som samlas in i separata rör, centrifugeras, och cellpelleten är sedan lyserat.
Även om denna teknik tillåter effektiv studiet av parakrin interaktioner samtidigt undvika overt direkta interaktioner, kan inte vi utesluta interaktioner genom tunneling nanotubules (TNTs). Några av dessa TNTs kan vara tillräckligt smal för att passera genom 0,4 µm porerna och tillräckligt länge för att spänna 10 µm tjocklek av membranet. Medan våra försök att kontrollera deras närvaro i porerna av konfokalmikroskopi var ofullständiga (inga data anges), kunde elektronmikroskopi potentiellt vara anställd för att bekräfta sin närvaro. Därför, denna metod utesluter inte den potentiella cell-cell kommunikationen genom TNTs om kandidaten cellerna kan bilda dem och interagera genom dem. På samma sätt, vi kan inte utesluta ökade autokrin signalering till följd av potentiella blockering av porer av celler på båda sidor av membranet, förhindra cross-diffusion.
Växande celler på antingen ytan av en membran med 0,4 µm porer kan också potentiella utbyte av exosomes. Exosomes betraktades traditionellt som soppåsar av celler, men senare forskning har visat att dessa blåsor med sin last av proteiner, mikroRNA, och även mRNA och DNA utgöra viktiga mediatorer av parakrin mobilkommunikation22 , 23 , 24. därför metoden proximala kultur effektivt kan användas för att studera cellulära kommunikationer genom exosomes. Denna metod är dessutom mottagliga för behandling med hämmare av signalering eller neutraliserande antikroppar mot utsöndrade ligand eller motsvarande receptor. Sammanfattningsvis rapporterade vi utvecklingen av en enkel och mångsidig proximala kultur metod, som exakt kan replikera parakrin signalering samtidigt förhindra direkta interaktioner mellan celler. Enkelheten i denna metod möjliggör dess utbredd tillämpning inom olika områden som cancerbiologi, utveckling och immunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi står i skuld till patienter för deras deltagande i samlingen vävnad för dessa experiment. En DoD OCRP ovariell Cancer Academy Award (W81XWH-15-0253) och en pilot award från Colleen's Dream Foundation till Anirban K. Mitra stöds denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
