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Biology

कोशिकाओं के बीच Paracrine सिगनल का अध्ययन करने के लिए एक समीपस्थ संस्कृति पद्धति

Published: August 28, 2018 doi: 10.3791/58144
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Indiana University School of Medicine, 2Urology, Indiana University Health Southern Indiana Physicians, 3Indiana University Melvin and Bren Simon Cancer Center, 4Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine

Summary

Paracrine और juxtacrine सेलुलर बातचीत कई जैविक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, ट्यूमर प्रगति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, और विकास सहित. यहां, एक समीपस्थ संस्कृति विधि paracrine संकेतन जहां स्रावित कारकों की स्थानीयकृत सांद्रता प्रत्यक्ष सेलुलर संपर्क को रोकने के बनाए रखा है अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

सेलुलर बातचीत कई जैविक प्रक्रियाओं, ट्यूमर प्रगति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, और विकास सहित में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । Paracrine या juxtacrine संकेतात्मक मध्यस्थता ऐसी बातचीत । एक वातानुकूलित मध्यम और coculture अध्ययन का उपयोग सबसे आम तरीकों के लिए इन दो प्रकार की बातचीत के बीच भेदभाव कर रहे हैं । हालांकि, paracrine बातचीत के दौरान microenvironment में स्रावित कारकों के स्थानीयकृत उच्च सांद्रता के प्रभाव वातानुकूलित माध्यम से सही ढंग से recapitulated नहीं है और, इस प्रकार, गलत निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने paracrine सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक समीपस्थ संस्कृति पद्धति ईजाद की है । दो सेल प्रकार ०.४ µm pores के साथ एक 10 µm मोटी कार्बोनेट झिल्ली की या तो सतह पर हो रहे हैं । pores स्रावित कारकों के आदान प्रदान की अनुमति है और, एक ही समय में, juxtacrine संकेतन रोकना । कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है और paracrine संकेतन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए समापन बिंदु पर लीजड ड । स्रावित कारकों के स्थानीयकृत एकाग्रता ढाल के लिए अनुमति देने के अलावा, इस विधि की संस्कृति के लंबे समय से जुड़े प्रयोगों के लिए उत्तरदायी है, साथ ही अवरोधकों के उपयोग. जब तक हम इस विधि का उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं और mesothelial कोशिकाओं वे मेटास्टेसिस के स्थल पर मुठभेड़ के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, यह शोधकर्ताओं के लिए किसी भी दो अनुयाई सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता paracrine विभिन्न क्षेत्रों में संकेतन का अध्ययन करने के लिए, जिसमें ट्यूमर microenvironment, इम्यूनोलॉजी, और विकास शामिल है ।

Introduction

कैंसर की कोशिकाओं और ट्यूमर प्रगति में ट्यूमर microenvironment के बीच उत्पादक पारस्परिक बातचीत की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और कैंसर जीवविज्ञान1में अनुसंधान के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित हो गया है । द्वि-दिशा संकेतन के समान उदाहरण घाव भरने के दौरान महत्वपूर्ण हैं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, स्टेम सेल niches, और विकास के दौरान2,3,4,5,6 , 7 , 8. इन सभी जैविक प्रक्रियाओं में एक आम विषय है कि कोशिकाओं को अपने microenvironment जो कोशिका भाग्य, ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान, और रोग प्रगति का निर्धारण से cues extracellular के लिए विभिंन तरीकों में प्रतिक्रिया । इसलिए, ध्यान तेजी से इस तरह के सेल में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ विकसित करने की ओर बदल गया है सेल संचार । ऐसी बातचीत के बहुमत paracrine या juxtacrine कोशिकाओं के बीच संकेतन शामिल है । Paracrine संकेतन एक कोशिका जो आसपास के क्षेत्र में एक और सेल पर इसी रिसेप्टर्स द्वारा माना जाता है द्वारा विशिष्ट संकेत कारक के स्राव शामिल है, यह9,10में एक प्रतिक्रिया को ट्रिगर, जबकि juxtacrine संकेतन दो कोशिकाओं के सेलुलर घटकों के बीच सीधे संपर्क की आवश्यकता होती है11,12शामिल ।

इस तरह के संकेतन ऊतक homeostasis में एक महत्वपूर्ण घटक है, साथ ही ट्यूमर microenvironment में । कैंसर कोशिकाओं ट्यूमर स्ट्रोमा में कोशिकाओं से paracrine और juxtacrine कारकों से लाभ, कैंसर से जुड़े fibroblasts (CAFs), प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और adipocytes13,14,15,16शामिल हैं । paracrine संकेतन विकास कारकों, साइटोकिंस, chemokines, आदिद्वारा मध्यस्थता किया जा सकता है, जबकि juxtacrine संकेतन पायदान संकेतन में झकझोरता लाइगैंडों और रिसेप्टर्स शामिल है, या integrins और उनके संबंधित के बीच बातचीत extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन । हम डिंबग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं और ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस14में CAFs के बीच पारस्परिक बातचीत के महत्व को प्रदर्शित किया है । इसी तरह, मेटास्टेसिस की साइट को कवर mesothelial कोशिकाओं के साथ metastasizing डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं की बातचीत कैंसर कोशिकाओं जो मेटास्टेटिक औपनिवेशीकरण17 को बढ़ावा देने में प्रमुख microRNAs और प्रतिलेखन कारकों को विनियमित 18.

paracrine संकेतन पर अधिकांश अध्ययनों के साथ दूसरे कक्ष प्रकार का इलाज करने के लिए एक कक्ष प्रकार से एकत्र एक वातानुकूलित माध्यम का उपयोग शामिल है । हालांकि इस दृष्टिकोण व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, यह प्रभावी ढंग से प्राप्त सेल के microenvironment में गुप्त कारक के स्थानीयकृत उच्च एकाग्रता के स्तर को दोहराने नहीं है । यह भी स्रावित कारक के निरंतर प्रवाह के कैनेटीक्स एक सेल द्वारा उत्पादित किया जा रहा है और पड़ोसी कोशिका द्वारा प्राप्त की प्रतिलिपि करने के लिए विफल रहता है । Paracrine संकेतन कम दूरी पर प्रभावी है के रूप में स्रावित कारक स्रोत सेल के आसपास ही में आवश्यक सांद्रता पर हैं और फैलाना और दूरी बढ़ जाती है के रूप में बाहर पतला करते हैं । स्रावित कारक के इस स्थानीयकृत उच्च एकाग्रता रिसेप्टर सेल में एक प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में प्रतिक्रिया भी नए स्रावित कारकों के संतुलन पर निर्भर है और उनके निरंतर घट क्षरण, बंधन के माध्यम से, और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में internalization और प्रसार स्रोत सेल से दूर । वातानुकूलित मध्यम उच्च स्थानीयकृत microenvironment में मौजूद सांद्रता के लिए खाते में केंद्रित किया जा सकता है, लेकिन है कि सही सटीक सांद्रता नहीं नकल कर सकते हैं । इसके अलावा, यह उत्पादन और शामिल कारक की कमी की प्राकृतिक कैनेटीक्स नकल नहीं कर सकते । और अधिक सही paracrine संकेतन दोहराने और यह juxtacrine संकेत तंत्र से अलग है, हम एक उपंयास समीपस्थ संस्कृति विधि है, जो एक छिद्रित झिल्ली की या तो सतह पर दो सेल प्रकार बढ़ शामिल है तैयार किया है । pores काफी छोटे juxtacrine बातचीत को रोकने के लिए और अभी तक स्थानीयकृत उच्च सांद्रता में स्रावित कारकों के आदान प्रदान की अनुमति है । उस रास्ते में, इस प्रणाली के उत्पादन और paracrine कारकों की कमी के कैनेटीक्स बरकरार रखती है ।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल इंडियाना विश्वविद्यालय के संस्थागत विनियामक बोर्ड के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. सेल की तैयारी

  1. अलगाव और मानव प्राथमिक mesothelial कोशिकाओं की संस्कृति
    1. पहले17,18 वर्णित के रूप में मानव ओमेंटम से मानव प्राथमिक mesothelial कोशिकाओं (HPMCs) को अलग और पूरा विकास मध्यम में उन्हें विकसित [Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% युक्त पेनिसिलिन-streptomycin, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और 1% विटामिन] ३७ ° c और 5% सह2पर ।
      नोट: HPMCs आम तौर पर १००% संगम (चित्रा 1a) के लिए उगाया जाता है ।
  2. डिंबग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति
    1. ३७ ° c और 5% सह2पर पूर्ण विकास मध्यम में HeyA8 डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं हो जाना.
      नोट: का प्रयोग करें HeyA8 कोशिकाओं के बारे में ८०% संगम (आंकड़ा 1b) हो ।

2. सेल संस्कृति

  1. समीपस्थ संस्कृति सेट अप
    1. एक 10 माइक्रोन-मोटी ऊतक-संस्कृति-०.४ माइक्रोन pores (108 pores/cm2) और एक ४.६७ सेमी2 विकास क्षेत्र के साथ--------------------------- यदि आवश्यक हो, तो वृद्धि सतह क्षेत्र के अनुसार वरीयता प्राप्त कक्षों की संख्या स्केलिंग करके विभिन्न सम्मिलित आकारों के लिए ऑप्टिमाइज़ करें. उपयोग करने से पहले गर्म पूर्ण विकास मध्यम, trypsin, और फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) ३७ ° c करने के लिए ।
  2. आवेषण की तैयारी
    1. डालने की झिल्ली की निचली सतह पर HeyA8 कोशिकाओं बीज, बाँझ संदंश का उपयोग कर अपनी पैकेजिंग से डालने हटाने और यह एक बाँझ 15 सेमी संस्कृति पकवान में औंधा जगह.
    2. एक 15 सेमी पकवान का प्रयोग करें, के रूप में यह गहराई के लिए औंधा डालने, या किसी भी उचित बाँझ कंटेनर के साथ विकल्प को समायोजित किया है । प्रयोग के आधार पर, 15 सेमी डिश में आवेषण की आवश्यक संख्या जगह है ।
    3. तीनों नियंत्रणों और तीन प्रायोगिक शर्तों के हिसाब से आवेषण के किनारे पर एक मार्कर के साथ लेबल ।
  3. कैंसर की कोशिकाओं की तैयारी
    1. HeyA8 कोशिकाओं को trypsinize करने के लिए एक 25 सेमी2 कुप्पी (~ 2 x 106 कोशिकाओं) में ८०% संगम पर उगाया जाता है, 40 के लिए trypsin (०.२५%) के 1 मिलीलीटर-60 एस जोड़ें और पूर्ण विकास मध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर ।
    2. कमरे के तापमान पर ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक (आरटी) 3 मिनट के लिए, supernatant त्यागें, और पूर्ण विकास माध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । trypan नीले रंग अपवर्जन विधि का उपयोग कर लाइव कोशिकाओं की गणना ।
  4. कैंसर की कोशिकाओं को बोने
    1. पूर्ण विकास मध्यम में लाइव HeyA8 कोशिकाओं के १००,००० कोशिकाओं/ ध्यान से बीज ८०,००० HeyA8 कोशिकाओं डालने के तल पर पूरा विकास मध्यम के ८०० μL में निलंबित (जो अब ऊपर का सामना करना पड़ रहा है, क्योंकि यह औंधा है) ।
    2. कोशिकाओं को एक गुंबद की तरह आकार बनाने के लिए बीज तो कोशिकाओं को डालने पर रहते है (चित्रा 1C) । झिल्ली के केंद्र से शुरू और गाढ़ा हलकों में जावक कदम है, जबकि धीरे pipetting । मध्यम के किसी भी फैल को रोकने के लिए बढ़त से 3 मिमी से अधिक जाने से बचें ।
      नोट: बीजों की कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं की वृद्धि दर और प्रयोग की अवधि पर निर्भर करेगी । HeyA8 इस समीपस्थ संस्कृति के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या और अनुकूलित कर रहे थे कोशिकाओं 80-90% तीसरे दिन के अंत में धाराप्रवाह होगा ।
  5. कर्क कोशिका मोह
    1. 15 मुख्यमंत्री पकवान कवर और ध्यान से सीओ2 मशीन को आवेषण युक्त पकवान ले जाएं । यह महत्वपूर्ण है के लिए इस कदम पर डालने पर मध्यम और कोशिकाओं की बूंद को बाधित नहीं है । कोशिकाओं के लिए ३७ ° c 4 एच के लिए कैंसर की कोशिकाओं को डालने के लिए संलग्न करने की अनुमति देने के लिए छोड़ दें ।
  6. mesothelial कक्षों को तैयार करना
    1. लगभग 4 घंटे के बाद, trypsinize HPMCs एक ७५ सेमी2 कुप्पी में १००% संगम पर हो (~ 4 x 106 कोशिकाओं) trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ (०.२५%) 1 के लिए-2 मिनट और पूर्ण विकास मध्यम के 12 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर ।
    2. 3 मिनट के लिए आरटी पर ५०० x जी में कोशिकाओं के केंद्रापसारक, पूरा विकास माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और लाइव trypan ब्लू डाई अपवर्जन विधि का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती ।
  7. mesothelial कोशिकाओं सीडिंग
    1. पूर्ण विकास माध्यम में ३००,००० कोशिकाओं/एमएल लाइव HPMCs के निलंबित । एक 6-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा पूरा विकास मीडिया के २.५ मिलीलीटर जोड़ें । ध्यान से 15 सेमी के लिए बाहर आवेषण युक्त डिश लाने के लिए बाहर की सुरक्षा हूड । बाँझ संदंश का प्रयोग, डालने फ्लिप और यह 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से जगह है कि यह ईमानदार है, HeyA8 कोशिकाओं के साथ संलग्न करने के लिए निचली सतह में डूबे पूर्ण विकास मध्यम (चित्रा 1C).
    2. बीज ४५०,००० HPMCs में १.५ मिलीलीटर के अंदर में निलंबित HeyA8 कोशिकाओं के साथ सम्मिलित करता है की सतह के नीचे का सामना करना पड़ (चित्रा 1C) या HPMC नियंत्रण के लिए किसी भी HeyA8 कोशिकाओं के बिना सम्मिलित करता है. HeyA8 नियंत्रण के लिए कोशिकाओं के बिना विकास मध्यम के १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. समीपस्थ संस्कृति बढ़ रही है
    1. समीपस्थ संस्कृति ३७ ° c और 5% सह2 में सह2 मशीन में बढ़ने के लिए ७२ एच । यदि आवश्यक हो, तो माध्यम के रूप में इस प्रकार मंगाया जा सकता है ।
      1. डालने के अंदर के लिए, निकालें ७५० µ एल और ताजा पूरा विकास मध्यम के ७५० µ एल जोड़ें ।
      2. डालने के बाहर के लिए (6 अच्छी तरह से प्लेट), 1 मिलीलीटर निकालें और ताजा पूरा विकास मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक कदम में माध्यम बदलने की सुविधा के लिए 1 मिलीलीटर चुना गया था । यदि वांछित, १.२५ मिलीलीटर निकाला जा सकता है और बदले की जगह ।
  9. कोशिकाओं का संग्रह
    1. समीपस्थ संस्कृति के ७२ एच के बाद कोशिकाओं को इकट्ठा । HeyA8 कोशिकाओं और HPMCs के पार संदूषण को रोकने के लिए इस कदम पर विशेष ध्यान रखें । कोशिकाओं Trypsinize, उंहें केंद्रापसारक, और लाइसे के बजाय गोली lysing झिल्ली पर कोशिकाओं को रोकने के लिए एक पार संदूषण ।
  10. कक्षों को Trypsinizing
    1. 1x पंजाबियों के साथ डालने के दोनों पक्षों कुल्ला ।
    2. संमिलित करता है एक नई अच्छी तरह से स्थानांतरण और trypsin जोड़ें । डालने के अंदर के लिए trypsin के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और trypsin के 2 मिलीलीटर 6-अच्छी तरह से प्लेट को जोड़ने के लिए trypsinize की निचली सतह से जुड़ी कैंसर कोशिकाओं को जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए थाली मशीन ।
  11. trypsin को बेअसर
    1. सम्मिलित करें के अंदर करने के लिए पूर्ण विकास मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें trypsin बेअसर करने के लिए, ऊपर और नीचे पिपेट, और फिर कोशिकाओं को लेने के लिए और एक लेबल संग्रह ट्यूब करने के लिए उन्हें स्थानांतरित. एक पूर्ण बेअसर के लिए पूर्ण विकास माध्यम के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें । देखभाल करने के लिए झिल्ली पियर्स नहीं लिया जाना चाहिए, जबकि pipetting कोशिकाओं के एक पार संदूषण को रोकने के लिए ।
    2. सम्मिलित करें के निचले भाग पर कक्षों को एकत्रित करने के लिए, पिपेट 2 मिलीलीटर trypsin जो चरण १२.२ में निचली सतह 2 – 3x पर जोड़ा गया था ताकि कक्ष 6-well प्लेट के निचले भाग में गिर जाते हैं । विकास माध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ प्लेट के तल पर trypsin बेअसर और एक लेबल संग्रह ट्यूब करने के लिए थाली की सामग्री हस्तांतरण ।
  12. कक्षों को एकत्रित करना और lysing करना
    1. 3 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और मीडिया महाप्राण । resuspend और आरएनए निष्कर्षण के लिए phenol-और guanidine-thiocyanate-आधारित lysis एजेंट के ०.७ मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों लाइसे । किसी भी उपयुक्त किट का उपयोग कर आरएनए को अलग ।

3. मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

नोट: निम्न चरणों का वर्णन एक मात्रात्मक रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) समीपस्थ संस्कृति का एक परिणाम के रूप में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए.

  1. qPCR के लिए आरएनए नमूनों से सीडीएनए तैयार करें. सभी mRNA की रिवर्स प्रतिलिपि सुनिश्चित करने के लिए एक इसी बफर और यादृच्छिक प्राइमरों के साथ किसी भी उपयुक्त रिवर्स transcriptase का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. fibronectin (FN1) और ई-cadherin (CDH1) के mRNA अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन का आकलन और विकास कारक बीटा 1 (TGFβ1) qPCR 3-फास्फेट glyceraldehyde (डिहाइड्रोजनेज) के साथ एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में रूपांतरण । यह मानकीकृत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीन अभिव्यक्ति परख का उपयोग करने के लिए संभव है ( सामग्री की तालिकादेखें) या डिजाइन प्राइमर ।
  3. HeyA8 नियंत्रण और HPMC नियंत्रण के साथ समीपस्थ संस्कृति में उगाया HPMCs के साथ HPMCs के साथ समीपस्थ संस्कृति में उगाया HeyA8 कोशिकाओं की तुलना करें ।

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Representative Results

Metastasizing डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं पेरिटोनियल गुहा19के भीतर मेटास्टेसिस की साइट पर mesothelial कोशिकाओं मुठभेड़ । उत्पादक paracrine और mesothelial कोशिकाओं के साथ juxtacrine बातचीत डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं है, जो सफल मेटास्टेसिस17,18,20,21 में सक्षम अनुकूली प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण में मदद . समीपस्थ संस्कृति विधि की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए, हम HeyA8 डिंबग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं और HPMCs के बीच paracrine बातचीत का परीक्षण किया । यह पहले से सूचित किया गया है कि एक coculture के साथ HeyA8 कोशिकाओं की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति में HPMCs परिणाम fibronectin में HPMCs21. fibronectin अभिव्यक्ति की इस प्रेरण HeyA8 कोशिकाओं द्वारा TGFβ की एक वृद्धि हुई स्राव द्वारा मध्यस्थता है21. इसलिए, हम इन दोनों कोशिकाओं में fibronectin और TGFβ के mRNA स्तरों पर HeyA8 कोशिकाओं और HPMCs के एक समीपस्थ संस्कृति के प्रभाव का परीक्षण किया । के रूप में की उंमीद है, समीपस्थ HeyA8 कोशिकाओं के साथ संस्कृति HPMCs में fibronectin की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप नियंत्रण है कि HeyA8 कोशिकाओं को निचली सतह (चित्रा 2a) से जुड़ी बिना आवेषण पर वरीयता प्राप्त थे । इसी प्रकार, HeyA8 कोशिकाओं के साथ HPMCs के समीपस्थ संस्कृति पूर्व (चित्रा बी) में TGFβ की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप । दोनों fibronectin और TGFβ की अभिव्यक्ति भी काफी HPMCs के साथ समीपस्थ संस्कृति पर HeyA8 कोशिकाओं में वृद्धि के रूप में नियंत्रण की तुलना में जहां HPMCs आवेषण की ऊपरी सतह में बीज नहीं थे (चित्रा 2c और 2d) ।

क्लासिक वातानुकूलित मध्यम दृष्टिकोण के प्रभाव की तुलना करने के लिए, हम एक HPMC-वातानुकूलित माध्यम के साथ HeyA8 कोशिकाओं के इलाज के प्रयोग किया । fibronectin अभिव्यक्ति में कमी आई और HPMC-वातानुकूलित माध्यम से इलाज करने वाले HeyA8 कोशिकाओं में TGFβ में उल्लेखनीय परिवर्तन हुआ । (चित्रा 3 बीऔर) । हम भी समीपस्थ संस्कृति में एक बेअसर एंटीबॉडी के साथ गुप्त TGFβ अवरुद्ध की क्षमता का परीक्षण किया । एंटीबॉडी बेअसर TGFβ के साथ उपचार HPMCs (चित्रा 3सी) के साथ समीपस्थ संस्कृति में HeyA8 कोशिकाओं में TGFβ की प्रेरण में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप । हालांकि, TGFβ बेअसर एंटीबॉडी थोड़ा नियंत्रण HeyA8 कोशिकाओं में TGFβ अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, शायद एक क्षतिपूरक प्रतिक्रिया (आंकड़ा 3सी) के रूप में ।

इसके अलावा, हम भी उपकला मार्कर ई-cadherin की अभिव्यक्ति के स्तर पर समीपस्थ संस्कृति के प्रभाव का परीक्षण किया. जबकि HeyA8 कोशिकाओं के साथ समीपस्थ संस्कृति थोड़ा HPMCs (चित्रा 2E) में ई-cadherin अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है, ई-cadherin में एक चिह्नित कमी HeyA8 की निकटता में हो कोशिकाओं में मनाया गया के रूप में नियंत्रण (चित्रा HPMCs) की तुलना में. साथ में ले लिया, इन परिणामों में समीपस्थ संस्कृति प्रणाली की प्रभावशीलता का प्रदर्शन डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं और मेटास्टेसिस की साइट पर सामान्य कोशिकाओं है कि दोनों के दौरान कोशिका प्रकार में जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित के बीच संकेतन paracrine का अध्ययन मेटास्टेटिक औपनिवेशीकरण की प्रक्रिया ।

Figure 1
चित्रा 1: समीपस्थ संस्कृति प्रणाली के विधानसभा । (क) यह पैनल मानव प्राथमिक mesothelial कोशिकाओं (HPMCs) को दिखाता है. (ख) इस पैनल HeyA8 डिंबग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को दर्शाता है । स्केल बार्स = २०० µm (A-B) । (ग) HeyA8 कोशिकाओं ०.४ µm pores के साथ एक transwell डालने की निचली सतह पर वरीयता प्राप्त थे । एक बार कोशिकाओं संलग्न थे, डालने के एक कुआं में रखा गया था एक 6 अच्छी तरह से वृद्धि मध्यम युक्त प्लेट । Mesothelial कोशिकाओं को तो सम्मिलित करने में वरीयता दी गई थी ताकि वे ऊपरी सतह से जुड़ी हुई और झिल्ली द्वारा HeyA8 कोशिकाओं से अलग हो गईं. ०.४ µm झिल्ली में pores स्रावित कारकों के आदान प्रदान की अनुमति दी, लेकिन कोशिकाओं के बीच किसी भी सीधे संपर्क बाधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: mRNA अभिव्यक्ति पर समीपस्थ संस्कृति का प्रभाव । पहले दो पैनलों (क) fibronectin और (ख) मानव प्राथमिक mesothelial कोशिकाओं में TGFβ1 अभिव्यक्ति के लिए qPCR दिखाने (HPMCs) समीपस्थ HeyA8 कोशिकाओं को संस्कृति, नियंत्रण HPMCs की तुलना में । अगले दो पैनलों के लिए qPCR दिखाने के लिए (ग) fibronectin और (घ) HeyA8 कोशिकाओं में TGFβ1 अभिव्यक्ति HPMCs को समीपस्थ संस्कृति, HeyA8 कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में । पिछले दो पैनलों ई में cadherin अभिव्यक्ति के लिए qPCR दिखाने के (ई) HPMCs HeyA8 कोशिकाओं को और (च) HeyA8 प्रसंस्कृत कोशिकाओं को समीपस्थ HPMCs. N = 3, * p करने के लिए (कल्चर्ड कल्चरed < ०.०१ । त्रुटि पट्टियां तीन दोहराता के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मानव प्राथमिक mesothelial कोशिका का प्रभाव (HPMC)-HeyA8 कोशिकाओं की mRNA अभिव्यक्ति पर वातानुकूलित मध्यम उपचार. शीर्ष दो पैनलों (क) fibronectin और (ख) HeyA8 कोशिकाओं में TGFβ1 अभिव्यक्ति के लिए qPCR दिखाओ । (ग) यह पिछले पैनल TGFβ1. N = 3, * p < ०.०१ के साथ एक समीपस्थ संस्कृति पर HeyA8 HPMCs अभिव्यक्ति पर एक बेअसर एंटीबॉडी (TGFβ1 अटल बिहारी) के साथ TGFβ1 स्रावित करने वाली बाधा के प्रभाव से पता चलता है । * * p < ०.०५ । त्रुटि पट्टियां तीन दोहराता के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

paracrine और juxtacrine कोशिकाओं के बीच संकेतन के तंत्र को समझना सामान्य ऊतक homeostasis और रोग की स्थिति7,8का एक बेहतर ज्ञान विकसित करने के लिए आवश्यक है. अधिकांश paracrine सिग्नलिंग अध्ययन एक कोशिका प्रकार से वातानुकूलित माध्यम का संग्रह और अन्य कोशिका प्रकार के इलाज के लिए इसका इस्तेमाल करके आयोजित किए जाते हैं. इस विधि अपनी अंतर्निहित सादगी में एक फायदा है । हालांकि, यह सही सेलुलर microenvironment या उत्पादन और शामिल कारकों की कमी के कैनेटीक्स में स्रावित कारकों की स्थानीयकृत सांद्रता दोहराऊंगा नहीं है । जबकि पूर्व कुछ हद तक संबोधित किया जा सकता है, हालांकि सही नहीं है, वातानुकूलित माध्यम को ध्यान से, यह बहुत मुश्किल है कैनेटीक्स बहलाना । transwell आवेषण का उपयोग करने के लिए डालने में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए और अच्छी तरह से कर सकते हैं के तल में, कुछ हद तक, उत्पादन और कमी के कैनेटीक्स के प्रभाव को पुनः कब्जा । हालांकि, कोशिकाओं के बीच की दूरी से अलग कर रहे हैं सम्मिलित करें और अच्छी तरह से नीचे और, इस प्रकार, paracrine कारकों की स्थानीयकृत सांद्रता विश्राम नहीं कर सकता । हम एक सरल समीपस्थ संस्कृति विधि के विकास के लिए पारस्परिक paracrine संकेतन, जो स्रावित कारकों के स्थानीयकृत उच्च सांद्रता, साथ ही उत्पादन और कारकों की कमी की दर की गतिशीलता को बनाए रखा अध्ययन की सूचना दी ।

एक सबूत के सिद्धांत का अध्ययन, हम डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं और HPMCs के बीच बातचीत की रिपोर्ट प्रभाव reproducing में समीपस्थ संस्कृति विधि की प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, हम भी HeyA8 कोशिकाओं और HPMCs में उपकला मार्कर ई-cadherin की अभिव्यक्ति पर पारस्परिक paracrine बातचीत के विपरीत प्रभाव दिखाई दिया. जबकि हमारे प्रयोग में शामिल 3 दिनों की अवधि में कोशिकाओं संवर्धन, यह कम या लंबे समय अंक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या को समायोजित करके वरीयता प्राप्त । यह शोधकर्ताओं अल्पकालिक अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है के रूप में अच्छी तरह से paracrine संकेतन के दीर्घकालिक प्रभाव या समय पाठ्यक्रम अध्ययन करने के लिए. इस सरल विधि संभावित ट्यूमर microenvironment पर अध्ययन के अलावा, इम्यूनोलॉजी, angiogenesis, सेल विकास, और घाव भरने सहित दो अनुयाई सेल प्रकार, के बीच संकेत paracrine पर किसी भी शोध के लिए लागू किया जा सकता है ।

इस विधि में महत्वपूर्ण चरणों झिल्ली की निचली सतह पर कोशिकाओं बोने और समापन बिंदु पर दोनों सतहों से कोशिकाओं संचयन कर रहे हैं । हम पहले डालने की शुरआत की और फिर मध्यम की एक बड़ी बूंद के रूप में कोशिकाओं बोने से निचली सतह पर एक बोने की दर हासिल की । दो की अधिक अनुयाई कोशिका का अध्ययन नीचे की सतह पर वरीयता प्राप्त होना चाहिए । ध्यान डालने के लिए परेशान करने के लिए नहीं लिया है, जबकि यह मशीन के लिए बाधित से मध्यम की इस बूँद से बचने के लिए । सिलिकॉन जेल डालने के किनारों को लागू किया जा सकता है पर्दाफाश और तरल के बुलबुले के फैल से बचने के लिए । समीपस्थ संस्कृति प्रयोग के अंत में, झिल्ली के दोनों किनारों पर कोशिकाओं को क्रमिक रूप से लीजड ड के बजाय सीधे trypsinized हैं, क्योंकि उंहें झिल्ली जोखिम पर lysing के माध्यम से lysates के संक्रमण pores । उन्हें अपने व्यक्तिगत डिब्बों में trypsinizing करके और यह ख्याल रखना कि मध्यम और trypsin मात्रा में कभी भी प्रोटोकॉल की निर्धारित मात्रा से अधिक न निकले, कोई पार-संदूषण बचा हो. प्रत्येक कोशिका प्रकार एक अलग ट्यूब, केंद्रापसारक में एकत्र की है, और सेल गोली तो लीजड ड है ।

हालांकि इस तकनीक paracrine बातचीत के प्रभावी अध्ययन की अनुमति देता है, जबकि प्रकट प्रत्यक्ष बातचीत से परहेज, हम बाहर सुरंग nanotubules (TNTs) के माध्यम से बातचीत शासन नहीं कर सकते । इन TNTs के कुछ काफी संकीर्ण करने के लिए ०.४ µm pores के माध्यम से पारित किया जा सकता है और काफी लंबे समय तक झिल्ली की 10 µm मोटाई अवधि । जबकि हमारे प्रयास में उनकी उपस्थिति सत्यापित करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा pores अनिर्णायक थे (नहीं दिखाया गया डेटा), इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संभवतः उनकी उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । इसलिए, इस विधि बाहर संभावित सेल-सेल संचार TNTs के माध्यम से नियम नहीं है यदि उंमीदवार कोशिकाओं उंहें बनाने और उनके माध्यम से बातचीत करने में सक्षम हैं । इसी तरह, हम बाहर की क्षमता अवरुद्ध का एक परिणाम के रूप में संकेत autocrine वृद्धि नहीं शासन कर सकते है झिल्ली के दोनों किनारों पर कोशिकाओं द्वारा pores, पार प्रसार को रोकने ।

०.४ µm pores के साथ एक झिल्ली की या तो सतह पर बढ़ती कोशिकाओं को भी exosomes के संभावित विनिमय की अनुमति देता है । Exosomes परंपरागत रूप से कोशिकाओं के कचरा बैग के रूप में माना जाता है, लेकिन हाल ही में अनुसंधान संकेत दिया है कि प्रोटीन, microRNAs, और यहां तक कि mRNAs और डीएनए के अपने माल के साथ इन बुलबुले paracrine सेलुलर संचार के महत्वपूर्ण मध्यस्थों के रूप में सेवा22 , 23 , 24. इसलिए, समीपस्थ संस्कृति विधि exosomes के माध्यम से सेलुलर संचार का अध्ययन करने के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि का संकेत या स्रावित ligand या इसी रिसेप्टर के खिलाफ एंटीबॉडी को बेअसर के विशिष्ट अवरोधकों के साथ इलाज के लिए उत्तरदायी है. संक्षेप में, हम एक सरल और बहुमुखी समीपस्थ संस्कृति विधि है, जो सही paracrine संकेतन दोहराने जबकि कोशिकाओं के बीच सीधे बातचीत को रोकने के विकास कर सकते है की सूचना दी । इस विधि की सादगी कैंसर जीव विज्ञान, विकास, और इम्यूनोलॉजी जैसे विविध क्षेत्रों में अपने व्यापक आवेदन सक्षम बनाता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इन प्रयोगों के लिए टिशू कलेक्शन में उनकी भागीदारी के लिए हम मरीजों के ऋणी हैं । एक DoD OCRP डिम्बग्रंथि कैंसर अकादमी पुरस्कार (W81XWH-15-0253) और Colleen के ड्रीम फाउंडेशन से एक पायलट पुरस्कार के लिए अनिरबन कश्मीर मित्रा ने इस शोध का समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert Corning (Costar) 3412 • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane
• Treated for optimal cell attachment
• Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case
• Membrane must be stained for cell visibility
• Sterilized by gamma radiation
6 well plate Corning (Falcon) 353046 Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish Corning (Falcon) 353025 Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM Corning (Cellgro) 10-013-CV
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI
MEM Nonessential amino acids Corning (Cellgro) 25-025-CI
MEM Vitamins Corning (Cellgro) 25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Pipets Any make is fine
CO2 Incubator Any make is fine
Biosafety level II cabinet Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit Qiagen 217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher Scientific 43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody R&D Systems MAB1835-100

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References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
  3. Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
  4. Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
  5. Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
  6. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  7. Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
  8. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  9. Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
  10. Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
  11. Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
  12. Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
  13. Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
  14. Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
  15. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  16. Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
  17. Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
  18. Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
  19. Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
  20. Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
  21. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
  22. Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
  23. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  24. Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).

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जीव विज्ञान अंक १३८ Paracrine संकेतन स्रावित कारक वातानुकूलित मध्यम रिसेप्टर ligand exosomes microenvironment
कोशिकाओं के बीच Paracrine सिगनल का अध्ययन करने के लिए एक समीपस्थ संस्कृति पद्धति
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Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., … More

Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. J. Vis. Exp. (138), e58144, doi:10.3791/58144 (2018).

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