Summary
Paracrine en juxtacrine cellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Hier, wordt een proximale cultuur-methode gebruikt om te studeren paracrine signalering waar de gelokaliseerde concentraties van de secreted factoren terwijl het voorkomen van rechtstreekse cellulaire contacten worden onderhouden.
Abstract
Intercellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Paracrine of juxtacrine signalering bemiddelt dergelijke interacties. Het gebruik van een geconditioneerde medium en coculture studies zijn de meest voorkomende methoden te discrimineren tussen deze twee soorten interacties. Echter het effect van gelokaliseerde hoge concentraties van secreted factoren in de communicatie tijdens de paracrine interactie is niet nauwkeurig gerecapituleerd door geconditioneerde medium en, dus, kan leiden tot onnauwkeurige conclusies. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een proximale cultuur methode om te studeren paracrine signalering bedacht. De twee celtypes worden gekweekt op een oppervlak van een 10 µm dik polycarbonaat membraan met 0.4 µm poriën. De poriën kunnen de uitwisseling van secreted factoren en, tegelijkertijd, remmen juxtacrine signalering. De cellen kunnen worden verzameld en aan het eindpunt om de effecten van de paracrine signalering lysed. Deze methode is naast voor gelokaliseerde concentratie gradiënten van secreted factoren, vatbaar voor experimenten met langere periodes van cultuur, alsmede het gebruik van remmers. Terwijl wij deze methode gebruiken om te studeren van de interacties tussen ovariale kankercellen en de mesothelial cellen die ze op de site van metastase tegenkomen, kan het worden aangepast aan elke twee aanhangend celtypes voor onderzoekers te bestuderen paracrine signalering in verschillende gebieden, inclusief tumor communicatie, immunologie en ontwikkeling.
Introduction
De rol van productieve wederzijdse interactie tussen kankercellen en de communicatie van de tumor in de tumor progressie is goed opgezet en is uitgegroeid tot een belangrijk aandachtspunt voor onderzoek naar kanker biologie1. Soortgelijke gevallen van bidirectionele signalering zijn van cruciaal belang tijdens wond genezing, immuunresponsen, angiogenese, stamcel niches, en tijdens ontwikkeling2,3,4,5,6 , 7 , 8. een gemeenschappelijk thema in al deze biologische processen is dat de cellen reageren op verschillende manieren te extracellulaire signalen van hun communicatie die bepalen het lot van de cel, weefsel fysiologie en progressie van de ziekte. Daarom heeft de focus steeds gedraaid naar het ontwikkelen van een beter inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij dergelijke cel-cel communicatie. Een meerderheid van dergelijke interacties betrekken paracrine of juxtacrine signalen tussen cellen. Paracrine signalering impliceert de secretie van specifieke signalering factoren met één cel die worden waargenomen door de bijbehorende receptoren op een andere cel in de nabijheid, triggering van een reactie in het9,10, overwegende dat juxtacrine signalering vereist rechtstreeks contact tussen cellulaire componenten van de twee cellen betrokken11,12.
Dergelijke signalering is een essentieel onderdeel in de weefsel homeostase, evenals in de communicatie van de tumor. De kankercellen profiteren van paracrine en juxtacrine factoren van cellen in het stroma tumor, met inbegrip van kanker-geassocieerde fibroblasten (IGFA), immune cellen en adipocytes13,14,15,16. De paracrine signalering kan worden bemiddeld door groeifactoren cytokines, chemokines, enz., terwijl de juxtacrine signalering omvat naast elkaar geplaatste liganden en receptoren zoals in Notch signalering, of interacties tussen integrins en hun respectieve extracellulaire matrix eiwitten. We hebben aangetoond dat het belang van wederzijdse interactie tussen ovariale kankercellen en IGFA in tumor progressie en metastase14. Ook reguleren de interacties van metastaserende ovariale kankercellen met de mesothelial cellen die betrekking hebben op de site van metastase belangrijke microRNAs en transcriptiefactoren in de kankercellen die bevordering van metastatische kolonisatie17, 18.
De meeste studies over paracrine signalering betrekking hebben op het gebruik van een geconditioneerde medium verzameld uit één celtype voor de behandeling van de tweede celtype met. Terwijl deze aanpak wijd verbeid gebruikt is, het niet efficiënt gerepliceerd de gelokaliseerde high-concentratieniveaus van de secreted factor in de communicatie van de ontvangende cel. Ook er niet in slaagt te reproduceren de kinetiek van de continue stroom van de secreted factor wordt geproduceerd door één cel en ontvangen door de naburige cel. Paracrine signalering is effectief over korte afstanden, zoals de secreted factoren bij de vereiste concentraties alleen in de nabijheid van de broncel zijn en zijn meestal diffuus en Verdun uit als de afstand toeneemt. Deze gelokaliseerde hoge concentratie van de secreted factor is essentieel om te leiden tot een reactie in de cel receptor. Bovendien is de reactie in de ontvangende cellen ook afhankelijk van de balans tussen nieuw secreted factoren en hun continue uitputting door afbraak, binding en toerekening in de ontvangende cellen en de verspreiding van de broncel. Geconditioneerde medium kan worden geconcentreerd op de hogere gelokaliseerde concentraties aanwezig in de communicatie voor hun rekening, maar die niet nauwkeurig de exacte concentratie te repliceren. Bovendien, het kan niet bootsen de natuurlijke kinetiek van productie en uitputting van de factor betrokken. Om nauwkeuriger repliceren paracrine signalering en scheiden van juxtacrine signalering mechanismen, hebben we een nieuwe proximale cultuur-methode, waarbij de twee celtypes op beide oppervlak van een poreuze membraan groeiende bedacht. De poriën zijn klein genoeg om te voorkomen dat juxtacrine interacties en toch toe de uitwisseling van secreted factoren bij gelokaliseerde hoge concentraties. Op die manier behoudt dit systeem de kinetiek van de productie en de uitputting van de paracrine factoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele regelgevende bestuur van Indiana University.
1. cel voorbereiding
-
Isolatie en cultuur van menselijke primaire mesothelial cellen
- Isoleren menselijke primaire mesothelial cellen (HPMCs) van menselijke majus zoals eerder beschreven17,18 en groeien ze in voltooien groeimedium [Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met de foetale runderserum 10%, 1% penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, en 1% vitamines] bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: De HPMCs worden meestal gekweekt tot 100% samenkomst (figuur 1A).
- Isoleren menselijke primaire mesothelial cellen (HPMCs) van menselijke majus zoals eerder beschreven17,18 en groeien ze in voltooien groeimedium [Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met de foetale runderserum 10%, 1% penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren, en 1% vitamines] bij 37 ° C en 5% CO2.
-
Groei omstandigheden van ovariële kankercellen
- Groeien HeyA8 ovariale kankercellen in volledige groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Gebruik HeyA8 cellen gegroeid tot ongeveer 80% samenvloeiing (figuur 1B).
- Groeien HeyA8 ovariale kankercellen in volledige groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2.
2. de celkweek
-
Proximale cultuur set-up
- Gebruik Transwell wordt ingevoegd voor 6-Wells-platen met een 10 μm dik weefsel-cultuur-testgroep polycarbonaat membraan met 0.4 μm poriën (108 poriën/cm2) en een 4,67 cm2 groei-gebied. Indien nodig, optimaliseren voor verschillende invoegen maten door schalen van het aantal cellen ontpit volgens de oppervlakte groei. Warme volledige groeimedium, trypsine en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 ° C vóór gebruik.
-
Voorbereiding van de inserts
- Om het zaad van de cellen van de HeyA8 op het onderste oppervlak van het membraan van het invoegen, verwijderen de invoegen uit de verpakking met steriel pincet en plaats deze omgekeerd in een steriele 15 cm cultuur schotel.
- Gebruik een 15 cm schotel, zoals zij de diepte heeft tot aan de omgekeerde invoegen, of het vervangen van een willekeurige passend steriele container. Afhankelijk van het experiment, plaatst u het vereiste aantal inzetstukken in de 15 cm schotel.
- De drie besturingselementen en drie proefomstandigheden dienovereenkomstig label met een marker op de rand van de inserts.
-
Voorbereiding van de kankercellen
- Trypsinize van de cellen van de HeyA8 geteeld op 80% samenvloeiing in een maatkolf van 25 cm2 (~ 2 x 106 cellen), voeg 1 mL trypsine (0,25%) voor 40-60-s en neutraliseren van de trypsine met 6 mL volledige groeimedium.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL volledige groeimedium. Tellen de levende cellen met behulp van de trypan methode voor de uitsluiting van de blauwe kleurstof.
-
Zaaien van de kankercellen
- Schorten 100.000 cellen/mL van levende cellen van de HeyA8 in volledige groeimedium. Zorgvuldig zaad 80.000 HeyA8 cellen gesuspendeerd in 800 μL van volledige groeimedium op de bodem van de insert (waarmee nu wordt geconfronteerd, omdat het is omgekeerd).
- Het zaad van de cellen een koepelvormige vorm, zodat de cellen op de insert (Figuur 1 c blijven). Start vanaf het midden van het membraan en naar buiten gaan in concentrische cirkels terwijl langzaam pipetteren. Vermijd gaande van meer dan 3 mm van de rand om te voorkomen dat eventuele morsen van het medium.
Opmerking: Het aantal cellen ontpit zal afhangen van de groei van de cellen en de duur van het experiment. Het aantal HeyA8 cellen zaadjes voor deze proximale cultuur werden geoptimaliseerd en de cellen zullen 80 – 90% heuvels aan het einde van de derde dag.
-
Kanker cel bijlage
- Dekking van de 15 cm schotel en de schotel met de inserts voor de CO2 incubator zorgvuldig te verplaatsen. Het is van cruciaal belang niet te verstoren de druppel medium en cellen op de insert bij deze stap. Laat de cellen bij 37 ° C gedurende 4 uur om de kankercellen te hechten aan de invoegen.
-
Voorbereiding van de mesothelial cellen
- Na ongeveer 4 uur, trypsinize de HPMCs geteeld op 100% samenvloeiing in een 75 cm2 kolf (~ 4 x 106 cellen) met 2 mL trypsine (0,25%) voor 1-2 min en neutraliseren van de trypsine met 12 mL volledige groeimedium.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij RT gedurende 3 minuten, resuspendeer de pellet cel in 10 mL volledige groeimedium, en tellen van de levende cellen met behulp van de trypan methode voor de uitsluiting van de blauwe kleurstof.
-
De mesothelial cellen zaaien
- Schorten 300.000 cellen/mL van levende HPMCs in volledige groeimedium. 2,5 mL verse volledige groei media toevoegen aan elk putje van de plaat van een 6-well. Breng zorgvuldig de 15 cm schotel met de inserts uit aan de kap van de bioveiligheid. Met behulp van steriele pincet, spiegelen het invoegen en plaats deze in de put van de 6-well plaat zodat het rechtop, met de cellen van de HeyA8 gekoppeld aan de lagere oppervlakte ondergedompeld in het volledige groeimedium (Figuur 1 c).
- Zaad 450.000 HPMCs geschorst in 1,5 mL groeimedium in de binnenkant van de inzetstukken met de cellen van de HeyA8 aan het oppervlak geconfronteerd met de bodem van de put (Figuur 1 c) of aan inzetstukken zonder alle cellen van de HeyA8 voor de besturingselementen HPMC gekoppeld. Voeg 1,5 mL groeimedium zonder cellen aan de controles van de HeyA8.
-
Groeien de proximale cultuur
- Laat de proximale cultuur groeien in de incubator van de CO-2 bij 37 ° C en 5% CO2 voor 72 uur. Indien nodig, kan het medium kan als volgt worden bijgevuld.
- Voor de binnenkant van het invoegen, verwijderen van 750 µL en voeg 750 µL van verse volledige groeimedium.
- Voor de buitenkant van de insert (de 6-well-plate), verwijderen van 1 mL en voeg 1 mL verse volledige groeimedium. De 1 mL werd gekozen voor het gemak van het wijzigen van het medium in één stap. Indien gewenst, kan 1,25 mL worden verwijderd en in plaats daarvan vervangen.
- Laat de proximale cultuur groeien in de incubator van de CO-2 bij 37 ° C en 5% CO2 voor 72 uur. Indien nodig, kan het medium kan als volgt worden bijgevuld.
-
Het verzamelen van de cellen
- De cellen verzamelen na 72 uur van proximale cultuur. Wees extra voorzichtig bij deze stap ter voorkoming van kruisbesmetting van de HeyA8 cellen en HPMCs. Trypsinize de cellen, centrifugeer ze en lyse van de pellet in plaats van het lysing van cellen op het membraan om een cross-besmetting te voorkomen.
-
Trypsinizing van de cellen
- Spoel van beide zijden van de insert met 1 x PBS.
- De inserts overbrengen in een nieuwe put en trypsine toe te voegen. Voeg 0,5 mL trypsine aan de binnenkant van het donormateriaal en voeg 2 mL trypsine aan de 6-well plaat aan de trypsinize van de kankercellen die is gekoppeld aan het onderste oppervlak van het donormateriaal. Incubeer de plaat gedurende 2 minuten bij 37 ° C.
-
Neutralisering van de trypsine
- Voeg 1 mL volledige groeimedium aan de binnenkant van de insert te neutraliseren de trypsine, Pipetteer op en neer, en vervolgens nemen de cellen en deze overbrengen naar een gelabelde collectie buis. Voeg een extra 2 mL volledige groeimedium voor een volledige neutralisatie. Niet te doorboren het membraan terwijl pipetteren om te voorkomen dat een kruisbesmetting van de cellen moet worden gezorgd.
- Pipetteer verzamelen de cellen op de bodem van de insert, de 2 mL trypsine die is toegevoegd in stap 12.2 op de onderkant 2 – 3 x zodat de cellen in de bodem van de 6-well-plaat vallen. Neutraliseren van de trypsine op de onderkant van de plaat met 6 mL groeimedium en overbrengen van de inhoud van de plaat naar een gelabelde collectie buis.
-
Verzamelen en lysing van cellen
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 3 minuten en de media gecombineerd. Resuspendeer en lyse van de cel pellets met 0,7 mL van fenol en guanidine kaliumthiocyanaat-gebaseerde lysis reagens voor de extractie van RNA. Isoleren met behulp van een geschikte kit RNA.
3. kwantitatieve Real-time polymerasekettingreactie
Opmerking: De volgende stappen beschrijven een kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) om te studeren de gene expressies veranderingen als gevolg van de proximale cultuur.
- CDNA van de RNA-monsters voorbereiden op qPCR. Gebruik geschikte reverse-transcriptase met een overeenkomstige buffer en willekeurige inleidingen om de omgekeerde transcriptie van alle mRNA (Zie Tabel van materialen).
- Beoordeelt de wijzigingen in de mRNA niveaus van de expressie van fibronectine (FN1) en E-cadherine (CDH1) en transformeren groeifactor bèta 1 (TGFβ1) door qPCR met glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) als een interne controle. Het is mogelijk om het gebruik van gestandaardiseerde verkrijgbare gen expressie testen (Zie Tabel van materialen) of te ontwerpen van inleidingen.
- Vergelijk de HeyA8 cellen gekweekt in proximale cultuur met HPMCs met de controles van de HeyA8 en de HPMCs geteeld in proximale cultuur met de HPMC controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metastaserende ovariale kankercellen tegenkomen mesothelial cellen op de site van metastase binnen de peritoneale holte19. Productieve paracrine en juxtacrine interacties met de hulp van de mesothelial cellen in inducerende adaptieve reacties in de ovariale kankercellen, die het mogelijk succesvol metastase17,18,20,21 maken . Om te testen de doeltreffendheid van de methode van de proximale cultuur, testten we de paracrine interactie tussen HeyA8 ovariale kankercellen en HPMCs. Het is eerder gemeld dat een coculture van HeyA8 cellen met HPMCs in een verhoogde expressie van fibronectine in de HPMCs21 resulteert. Deze inductie van fibronectine expressie wordt gemedieerd door een verhoogde afscheiding van TGFβ door de HeyA8 cellen21. Dus we getest het effect van een proximale cultuur van HeyA8 cellen en HPMCs op de mRNA niveaus van fibronectin en TGFβ in beide deze cellen. Zoals verwacht, resulteerde proximale cultuur met HeyA8 cellen in een grotere expressie van fibronectine in de HPMCs in vergelijking met besturingselementen die werden zaadjes op inzetstukken zonder HeyA8 cellen gekoppeld aan het onderste oppervlak (figuur 2A). Ook de proximale cultuur van HPMCs met HeyA8 cellen in een grotere expressie van TGFβ in de voormalige (figuur 2B resulteerde). De uitdrukking van zowel fibronectin en TGFβ ook aanzienlijk verhoogd in cellen van de HeyA8 op de proximale cultuur met HPMCs ten opzichte van de besturingselementen waar HPMCs werden niet uitgezaaid in de hogere oppervlakte van de tussenvoegsels (figuur 2C en 2D).
Om te vergelijken met het effect van de klassieke geconditioneerde middellange aanpak, we een experiment behandeling van HeyA8 cellen met een medium HPMC-geconditioneerd uitgevoerd. Er was een afname van de fibronectine expressie en een significante verandering in TGFβ in HeyA8 cellen behandeld met het medium HPMC-geconditioneerd. (Figuur 3A en 3B). We zijn ook getest met het potentieel van het blokkeren van de secreted TGFβ met een neutraliserende antilichamen in de proximale cultuur. Behandeling met de neutraliserende antilichamen van de TGFβ resulteerde in een aanzienlijke daling van de inductie van TGFβ in HeyA8 cellen in de proximale cultuur met HPMCs (Figuur 3 c). Echter verhoogd de neutraliserende antilichamen van de TGFβ iets de TGFβ expressie in het besturingselement HeyA8 cellen, waarschijnlijk als een compenserende reactie (Figuur 3 c).
Bovendien, we ook het effect van proximale cultuur op de niveaus van de expressie van de epitheliale markering E-cadherine getest. Terwijl de proximale cultuur met HeyA8 cellen steeg lichtjes de expressie van E-cadherine in het HPMCs (figuur 2E), werd een duidelijke afname in E-cadherine waargenomen in de HeyA8 cellen gekweekt in nabijheid van HPMCs ten opzichte van de besturingselementen (figuur 2F). Samen genomen, deze resultaten tonen de effectiviteit van het systeem van de proximale cultuur bij het bestuderen van de paracrine signalering tussen ovariale kankercellen en de normale cellen op de site van metastase die invloed hebben op de genexpressie in beide celtypen tijdens de proces van metastatische kolonisatie.
Figuur 1: vergadering van het systeem van de proximale cultuur. (A) dit paneel toont mens primaire mesothelial cellen (HPMCs). (B) dit paneel toont HeyA8 ovariale kankercellen. Schaal bars = 200 µm (A-B). (C) HeyA8 cellen werden zaadjes op het onderste oppervlak van een transwell invoegen met behulp van 0.4 µm poriën. Zodra de cellen werden gekoppeld, werd het invoegen in een put van een 6-well plaat met groeimedium geplaatst. Mesothelial cellen werden vervolgens zaadjes in de insert zodat ze op de hogere oppervlakte aangesloten en van de HeyA8 cellen werden gescheiden door het membraan. De 0.4 µm poriën in het membraan van de uitwisseling van toegestaan uitgescheiden factoren maar geremd producten ieder rechtstreeks contact tussen de cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Effect van de proximale cultuur op mRNA uitdrukking. De eerste twee borden tonen de qPCR voor de fibronectine (A) en (B) TGFβ1 expressie in menselijke primaire mesothelial cellen (HPMCs) proximally naar HeyA8 cellen gekweekte, in vergelijking met controle HPMCs. De volgende twee panelen show de qPCR voor de fibronectine (C) en (D) TGFβ1 expressie in HeyA8 cellen gekweekt proximally aan HPMCs, vergeleken met controle Heya8 cellen. De laatste twee panelen vertonen de qPCR voor de expressie van E-cadherine (E) HPMCs proximally gekweekt tot HeyA8 cellen en (F) HeyA8 cellen gekweekt proximally te HPMCs. N = 3, * p < 0,01. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de drie herhalingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van menselijke primaire mesothelial cellen (HPMC)-middellange behandeling op de uitdrukking van mRNA van HeyA8 cellen geconditioneerd. De bovenste twee borden tonen de qPCR voor de fibronectine (A) en (B) TGFβ1 expressie in HeyA8 cellen. (C) dit laatste paneel toont het effect van remming van secreted TGFβ1 met een neutraliserende antilichamen (TGFβ1 Ab) op de expressie van de HeyA8 TGFβ1 op een proximale cultuur met HPMCs. N = 3, * p < 0,01. p < 0.05. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de drie herhalingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inzicht van het mechanisme van paracrine en juxtacrine signalen tussen cellen is essentieel voor de ontwikkeling van een betere kennis van de normale weefsel homeostase en ziekte voorwaarden7,8. De meeste paracrine signalering onderzoeken worden uitgevoerd door het verzamelen van geconditioneerd medium uit één celtype en het gebruik ervan voor de behandeling van het andere celtype. Deze methode heeft een voordeel in zijn inherente eenvoud. Echter, het is niet nauwkeurig recapituleren de gelokaliseerde concentraties van de secreted factoren in de cellulaire communicatie of de kinetiek van de productie en de uitputting van de betrokken factoren. Terwijl de eerstgenoemde kan worden aangepakt tot op zekere hoogte, hoewel niet nauwkeurig, door zich te concentreren het geconditioneerde medium, het is heel moeilijk om de kinetiek opnieuw. Het gebruik van transwell tussenvoegsels groeien van cellen in het invoegen en in de bodem van de put kan, tot op zekere hoogte, de gevolgen van de kinetiek van productie en uitputting heroveren. Echter, de cellen worden gescheiden door de afstand tussen het invoegen en de bodem van de put, en dus kunnen niet opnieuw de gelokaliseerde concentraties van de paracrine factoren. Berichtten we de ontwikkeling van een eenvoudige proximale cultuur methode om te studeren wederzijdse paracrine signalering, die de gelokaliseerde hoge concentraties van de secreted factoren, evenals de dynamiek van de snelheid van productie en uitputting van de factoren behouden.
We toonden in een bewijs-van-principe studie, de doeltreffendheid van de methode van de proximale cultuur in het reproduceren van de gemelde effecten van interacties tussen ovariale kankercellen en HPMCs. Daarnaast, toonden we ook het tegenovergestelde effect van wederzijdse paracrine interacties op de expressie van de epitheliale markering E-cadherine in HeyA8 cellen en HPMCs. Terwijl ons experiment kweken de cellen gedurende een periode van 3 dagen betrokken, het kan worden aangepast aan kortere of langere tijd punten door het aanvankelijke aantal cellen aan te passen zaadjes. Dit kan onderzoekers zowel korte als lange termijn effecten van de paracrine signalering te bestuderen of tijdsverloop studies te verrichten. Deze eenvoudige methode kan mogelijk worden toegepast op elk onderzoek op paracrine signalen tussen twee aanhangend celtypen, met inbegrip van de immunologie, angiogenese, cel ontwikkeling en wondgenezing, naast studies over de communicatie van de tumor.
De kritische stappen in deze methode worden de cellen op het onderste oppervlak van het membraan zaaien en oogsten van de cellen van beide oppervlakken op het eindpunt. Het is gelukt een zaaien op de lagere oppervlak door eerste flipping de invoegen en vervolgens de cellen zaaien als een grote daling van medium. De meer aanhangend cel van de twee bestudeerd moet worden ontpit op de onderkant. Zorg moet worden genomen niet te verstoren de invoegen tijdens het broeden om te voorkomen dat deze klodder medium uit verstoren. Siliconen-gel kan worden toegepast op de randen van de insert te vermijden de buste en morsen van de zeepbel van vloeistof. Aan het einde van het experiment van de proximale cultuur, zijn de cellen aan beide zijden van de membraan opeenvolgend trypsinized in plaats van lysed direct, omdat ze op het membraan risico's kruisbesmetting van de lysates via de poriën lysing. Door trypsinizing hen in hun afzonderlijke compartimenten en zorg dat het volume medium en trypsine nooit groter is dan het vastgestelde bedrag van het protocol, wordt kruisbesmetting voorkomen. Elk celtype worden verzameld in een aparte buis, gecentrifugeerd, en de cel pellet is vervolgens lysed.
Hoewel deze techniek maakt het mogelijk de effectieve studie van interacties die paracrine terwijl het vermijden van openlijke directe interacties, kunnen niet we uitsluiten interacties via tunneling nanotubules (TNTs). Sommige van deze TNTs kunnen smal genoeg om door te geven via de poriën µm 0.4 en lang genoeg om het beslaan van de 10 µm dikte van het membraan. Terwijl onze pogingen om te controleren hun aanwezigheid in de poriën door confocale microscopie waren onduidelijk (gegevens niet worden weergegeven), kon elektronenmicroscopie mogelijk worden ingezet om te bevestigen hun aanwezigheid. Dus uitsluit deze methode niet de potentiële cel-cel communicatie via TNTs als de kandidaat-cellen kan vormen hen en interactie via hen. Ook, we kunnen niet uitsluiten verhoogde autocrine signalering als gevolg van de mogelijke blokkering van de poriën door cellen aan beide zijden van de membraan, kruis-verspreiding te voorkomen.
Groeiende cellen op een oppervlak van een membraan met 0.4 µm poriën maakt het ook mogelijk de potentiële uitwisseling van exosomes. Exosomes werden traditioneel beschouwd als Prullenbak zakken van cellen, maar recent onderzoek heeft aangegeven dat deze blaasjes met hun lading van DNA, eiwitten, microRNAs, en zelfs mRNAs als belangrijk bemiddelaars/mediators van paracrine cellulaire communicatie22 dienen , 23 , 24. daarom de proximale cultuur-methode effectief kan worden gebruikt om te studeren van cellulaire communicatie via exosomes. Bovendien, is deze methode vatbaar voor behandeling met specifieke remmers van de signalering of neutraliserende antilichamen tegen het secreted ligand of overeenkomstige receptor. Kortom meldden wij de ontwikkeling van een eenvoudig en veelzijdig proximale cultuur-methode, die nauwkeurig paracrine signalering terwijl het voorkomen van directe interacties tussen cellen kunt repliceren. De eenvoud van deze methode kan de wijdverbreide toepassing op uiteenlopende gebieden zoals Kankerbiologie, ontwikkeling en immunologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dank verschuldigd aan de patiënten voor hun deelname aan de collectie van het weefsel voor deze experimenten. Dit onderzoek wordt ondersteund door een DoD OCRP ovariële kanker Academy Award (W81XWH-15-0253) en een pilot van Colleen de Dream Foundation naar Anirban K. Mitra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
