Summary
Paracrine og juxtacrine cellulær interaktioner spiller en vigtig rolle i mange biologiske processer, herunder tumor progression, immunrespons, angiogenese og udvikling. Her, er en proksimal kultur metode brugt til at studere paracrine signalering hvor de lokaliserede koncentrationer af de faktorer, der udskilles vedligeholdes samtidig forhindre direkte cellulære kontakt.
Abstract
Intercellulære interaktioner spiller en vigtig rolle i mange biologiske processer, herunder tumor progression, immunrespons, angiogenese og udvikling. Paracrine eller juxtacrine signalering medierer sådanne interaktioner. Brug af en konditioneret medium og coculture undersøgelser er de mest almindelige metoder til at skelne mellem disse to typer af interaktioner. Men effekten af lokaliserede høje koncentrationer af udskilles faktorer i mikromiljø under paracrine interaktioner er ikke præcist sammenfattet af konditioneret medium, og således kan føre til upræcise konklusioner. For at løse dette problem, har vi udtænkt en proksimal kultur metode for at studere paracrine signalering. To celletyper er vokset på enten overfladen af en 10 µm tykt polycarbonat membran med 0,4 µm porer. Porerne giver mulighed for udveksling af udskilles faktorer og på samme tid, hæmme juxtacrine signalering. Cellerne kan indsamles og mængden på slutpunkt til at bestemme virkningen af paracrine signalering. Ud over mulighed for lokaliserede koncentration forløb af udskilles faktorer, er denne metode åbne over for eksperimenter, der involverer længere perioder af kultur, samt brug af hæmmere. Mens vi bruger denne metode til at studere samspillet mellem kræft i æggestokkene celler og de mesothelial celler, de støder på i stedet for metastase, kan det tilpasses til enhver to vedhængende celletyper for forskere til at studere paracrine signalering i forskellige felter, herunder tumor mikromiljø, immunologi og udvikling.
Introduction
Rollen som produktive gensidige interaktioner mellem kræftceller og tumor mikromiljø i tumor progression har været veletablerede og er blevet en større fokus på forskning i kræft biologi1. Lignende forekomster af tovejs signalering er af afgørende betydning under sårheling, immunrespons, angiogenese, stamcelle nicher, og under udvikling2,3,4,5,6 , 7 , 8. et gennemgående tema i alle disse biologiske processer er at celler reagerer på forskellige måder at ekstracellulære stikord fra deres mikromiljø som bestemme celle skæbne, væv fysiologi og sygdomsprogression. Fokus har derfor i stigende grad vendt mod at udvikle en bedre forståelse af de mekanismer, der er involveret i sådan celle-celle kommunikation. Et flertal af sådanne interaktioner indebærer paracrine eller juxtacrine signaler mellem cellerne. Paracrine signalering omfatter sekretion af specifikke signaling faktorer af én celle, som opfattes af tilsvarende receptorer på en anden celle i nærheden, udløser en reaktion i det9,10, mens juxtacrine signalering kræver direkte kontakt mellem cellulære komponenter af to celler involveret11,12.
Sådanne signaler er en afgørende komponent i væv homøostase, samt i tumor mikromiljø. Kræftcellerne drage fordel af paracrine og juxtacrine faktorer fra celler i tumor stroma, herunder kræft-associerede fibroblaster (cafïr), immunceller og adipocytter13,14,15,16. Paracrine signalering kan være medieret af vækstfaktorer, cytokiner, kemokiner, osv., mens juxtacrine signalering omfatter sidestillede ligander og receptorer som Notch signalering, eller interaktioner mellem integriner og deres respektive ekstracellulær matrix proteiner. Vi har demonstreret vigtigheden af gensidige samspil mellem æggestokkene kræftceller og cafïr i tumor progression og metastase14. Ligeledes regulere interaktioner af metastasizing kræft i æggestokkene celler med mesothelial celler som dækker stedet for metastaser centrale MicroRNA og transkriptionsfaktorer i kræftceller, der fremmer metastatisk kolonisering17, 18.
De fleste undersøgelser på paracrine signalering indebærer brug af et konditioneret medium indsamlet fra én celletype til at behandle den anden celletype med. Mens denne tilgang har været meget anvendt, det ikke effektivt replikerer de lokaliserede høj koncentration niveauer af det udskilles faktor i mikromiljø af den modtagende celle. Det også undlader at reproducere kinetik af kontinuerlig strømmen af den udskilles faktor bliver produceret af en celle og modtaget af den nærliggende celle. Paracrine signalering er effektive over korte afstande, som de udskilles faktorer er på de krævede koncentrationer kun omkring kildecellen og tilbøjelige til at diffuse og fortyndes ud som afstanden øges. Denne lokaliserede høje koncentration af de udskilles faktor er afgørende for at udløse en reaktion i receptoren cellen. Svar i de modtagende celler er desuden også afhængig af saldoen for nyligt udskilles faktorer og deres kontinuerlig udtynding gennem nedbrydning, bindende og internalisering i modtagerens celler og diffusion væk fra kildecellen. Konditioneret medium kan koncentreres til konto for højere lokaliserede koncentrationerne i mikromiljø, men der kan ikke præcist replikerer den nøjagtige koncentration. Derudover kan det efterligner den naturlige kinetik af produktion og nedbrydning af den faktor, der er involveret. Mere præcist replikere paracrine signalering og adskille det fra juxtacrine signalering mekanismer, vi har udtænkt en roman proksimale kultur metode, som indebærer vokser to celletyper på enten overfladen af en porøse membran. Porerne er lille nok til at forhindre juxtacrine interaktioner og endnu tillade udveksling af udskilles faktorer på lokaliserede høje koncentrationer. På måde bevarer denne ordning kinetik af produktion og nedbrydning af paracrine faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne i den institutionelle regulering bestyrelsen Indiana University.
1. celle forberedelse
-
Isolation og kultur af human primære mesothelial celler
- Isoleres menneskelige primære mesothelial celler (HPMCs) fra menneskelige omentum, som tidligere beskrevet17,18 og dyrke dem i komplet vækstmediet [Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% vitaminer] ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: HPMCs er typisk vokset til 100% sammenløbet (figur 1A).
- Isoleres menneskelige primære mesothelial celler (HPMCs) fra menneskelige omentum, som tidligere beskrevet17,18 og dyrke dem i komplet vækstmediet [Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% vitaminer] ved 37 ° C og 5% CO2.
-
Vækstbetingelser celler, kræft i æggestokkene
- Vokse HeyA8 æggestokke kræftceller i komplet vækstmediet ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Brug HeyA8 celler vokset til omkring 80% sammenløbet (figur 1B).
- Vokse HeyA8 æggestokke kræftceller i komplet vækstmediet ved 37 ° C og 5% CO2.
2. celle kultur
-
Proksimale kultur set-up
- Brug Transwell skær til 6-godt plader med en 10 μm tykt væv-kultur-behandlede polycarbonat membran med 0,4 μm porer (108 porer/cm2) og en 4,67 cm2 vækstområde. Hvis det er nødvendigt, optimere for forskellige Indsæt størrelser ved at skalere antallet celler seedede ifølge vækst areal. Varm komplet vækstmediet, trypsin og fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til 37 ° C før brug.
-
Forberede indsætter
- For at frø HeyA8 celler på den nedre overflade af membranen af indsatsen, fjerne indsætte fra emballagen ved hjælp af steril pincet og placere det omvendt i en steril 15 cm kultur parabol.
- Brug en 15 cm parabol, som det har dybde til at rumme den inverterede Indsæt, eller erstatte det med en passende steril beholder. Afhængigt af eksperimentet, anbringes det nødvendige antal skær i 15 cm parabol.
- Mærke de tre kontrolelementer og tre forsøgsbetingelser i overensstemmelse hermed med en markør på kanten af skærene.
-
Forberede kræftceller
- Til trypsinize HeyA8 celler dyrkes på 80% confluence i en 25 cm2 kolbe (~ 2 x 106 celler), der tilsættes 1 mL af trypsin (0,25%) for 40 – 60 s og neutralisere trypsin med 6 mL af komplet vækstmediet.
- Centrifugeres celler på 500 x g ved stuetemperatur (RT) for 3 min, supernatanten fjernes, og resuspenderes celle i 5 mL af komplet vækstmediet. Tælle de levende celler ved hjælp af metoden trypan blå farvestof udstødelse.
-
Såning kræftceller
- Suspendere 100.000 celler/mL af levende HeyA8 celler i komplet vækstmediet. Omhyggeligt seed 80.000 HeyA8 celler suspenderet i 800 μL af komplet vækstmediet på bunden af skæret (som nu vender opad, da det er omvendt).
- Seed celler til at danne en dome-lignende form, så cellerne forbliver på Indsæt (figur 1 c). Starte fra midten af membranen og bevæger sig udad i koncentriske cirkler mens langsomt pipettering. Undgå at gå mere end 3 mm fra kanten for at undgå ethvert spild af medium.
Bemærk: Antallet af celler seedede vil afhænge vækst af celler og varigheden af forsøget. Antallet af HeyA8 celler seedede for denne proksimale kultur blev optimeret og cellerne bliver 80-90% sammenflydende ved udgangen af den tredje dag.
-
Kræft celle vedhæftet fil
- Dække 15 cm parabol og omhyggeligt flytte fadet indeholdende skær til CO2 inkubator. Det er afgørende ikke at forstyrre dråbe af medium og celler på Indsæt på dette trin. Forlade celler ved 37 ° C i 4 h at tillade kræftceller til at vedhæfte til skæret.
-
Forberede de mesothelial celler
- Efter omkring 4 h, trypsinize HPMCs vokset på 100% confluence i en 75 cm2 kolbe (~ 4 x 106 celler) med 2 mL trypsin (0,25%) i 1-2 min. og neutralisere trypsin med 12 mL af komplet vækstmediet.
- Centrifugeres celler på 500 x g på RT for 3 min, celle resuspenderes i 10 mL af komplet vækstmediet, og tælle de levende celler ved hjælp af metoden trypan blå farvestof udstødelse.
-
Såning i mesothelial celler
- Suspendere 300.000 celler/mL af levende HPMCs i komplette vækstmediet. Tilføje 2,5 mL frisk komplet vækst medier til hver brønd med en 6-godt plade. Omhyggeligt bringe 15 cm parabol indeholdende skær ud til biosikkerhed hætte. Brug steril pincet, bladre Indsæt og placere det i godt 6-godt plade, så det er oprejst, med de HeyA8 celler knyttet til den nederste overflade nedsænket i komplet vækstmediet (figur 1 c).
- Frø 450,000 HPMCs suspenderet i 1,5 mL af vækstmediet i indersiden af skærene med HeyA8 celler knyttet til overfladen står i bunden af brønden (figur 1 c) eller skær uden nogen HeyA8 celler for HPMC kontrol. Tilsættes 1,5 mL vækstmediet uden celler til HeyA8 kontrol.
-
Vokser den proksimale kultur
- Lad den proksimale kultur vokser i CO2 inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 72 timer. Hvis det er påkrævet, kan mediet genopfyldes som følger.
- Til indersiden af indsatsen, fjerne 750 µL og tilføje 750 µL af frisk komplet vækstmediet.
- Til ydersiden af Indsæt (6-godt pladen), fjerne 1 mL og tilsættes 1 mL frisk komplet vækstmediet. 1 mL blev valgt for bekvemmeligheden af skiftende medium i ét trin. Hvis det ønskes, kan 1,25 mL fjernes og erstattes i stedet.
- Lad den proksimale kultur vokser i CO2 inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 72 timer. Hvis det er påkrævet, kan mediet genopfyldes som følger.
-
Indsamle cellerne
- Indsamle cellerne efter 72 h af proksimale kultur. Vær særlig forsigtig ved dette skridt til at undgå krydskontaminering af HeyA8 celler og HPMCs. Trypsinize af celler og centrifugeres dem lyse pellet i stedet for lysing celler på membran til at forhindre en krydskontaminering.
-
Trypsinizing celler
- Skyl begge sider for skæret med 1 x PBS.
- Overføre skærene til en ny brønd og tilføje trypsin. Tilsæt 0,5 mL trypsin på indersiden af indsatsen og tilsættes 2 mL trypsin til 6-godt plade til trypsinize kræftceller knyttet til den nedre overflade af indsatsen. Inkuber plade i 2 minutter ved 37 ° C.
-
Neutralisere trypsin
- Der tilsættes 1 mL af komplet vækstmediet på indersiden af Indsæt til at neutralisere trypsin, pipetteres op og ned og derefter tage cellerne og overføre dem til en navngivet samling tube. Tilføje en yderligere 2 mL af komplet vækstmedium for en fuldstændig neutralisering. Pleje bør tages ikke til at gennembore membranen mens pipettering for at undgå krydskontaminering af celler.
- For at indsamle cellerne på bunden af skæret, afpipetteres 2 mL trypsin, der blev tilføjet i trin 12.2 bunden overfladen 2 – 3 x så at cellerne falder i bunden af 6-godt plade. Neutralisere trypsin i bunden af pladen med 6 mL af vækstmediet og overføre indholdet af pladen til en navngivet samling tube.
-
Indsamling og lysing af celler
- Centrifugeres celler ved 500 x g i 3 min og Opsug mediet. Resuspend og lyse celle pellets med 0,7 mL af phenol guanidin kaliumthiocyanat-baseret og lysis reagens til RNA udvinding. Isolere RNA ved hjælp af enhver egnet kit.
3. kvantitative Real-time Polymerase Chain Reaction
Bemærk: De følgende trin beskriver en kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qPCR) for at studere gen udtryk ændringer som følge af den proksimale kultur.
- Forberede qPCR cDNA fra RNA prøver. Brug enhver egnet reverse transkriptase med en tilsvarende buffer og tilfældige primere til at sikre reverse transkription af alle mRNA (Se Tabel af materialer).
- Vurdere ændringer i mRNA udtryk niveauer af fibronektin (FN1) og E-cadherin (CDH1) og omdanne vækst faktor beta 1 (TGFβ1) af qPCR med glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som en intern kontrol. Det er muligt at bruge standardiserede kommercielt tilgængelige gen expression assays (Se Tabel af materialer) eller design primere.
- Sammenligne de HeyA8 celler dyrkes i proksimale kultur med HPMCs med HeyA8 kontrollen og HPMCs vokset i proksimale kultur med knapperne på HPMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metastasizing ovarie cancerceller støder mesothelial celler i stedet for metastaser i bughulen19. Produktive paracrine og juxtacrine interaktion med mesothelial celler hjælp i inducerende adaptive responser i de celler, kræft i æggestokkene, som aktiverer vellykket metastase17,18,20,21 . For at teste effektiviteten af metoden proksimale kultur, vi har testet paracrine interaktioner mellem HeyA8 kræft i æggestokkene celler og HPMCs. Det er tidligere blevet rapporteret, at en coculture af HeyA8 celler med HPMCs resulterer i en øget udtryk for fibronektin i HPMCs21. Denne induktion af fibronektin udtryk er medieret af en øget udskillelse af TGFβ af HeyA8 celler21. Derfor, vi har testet effekten af en proksimal kultur af HeyA8 celler og HPMCs på mRNA niveau af fibronektin og TGFβ i begge disse celler. Som forventet, resulterede proksimale kultur med HeyA8 celler i et øget udtryk for fibronektin i HPMCs i forhold til kontrolelementer, der var seedet på skær uden HeyA8 celler knyttet til den nederste overflade (figur 2A). Ligeledes, den proksimale kultur af HPMCs med HeyA8 celler resulterede i et øget udtryk for TGFβ i tidligere (figur 2B). Udtryk for både fibronektin og TGFβ steg også betydeligt i HeyA8 celler ved proksimale kultur med HPMCs i forhold til kontrol, hvor HPMCs ikke var seedede i den øvre overflade af skær (figur 2 c og 2D).
For at sammenligne effekten af den klassiske konditioneret medium tilgang, udført vi et eksperiment, behandling af HeyA8 celler med en HPMC-aircondition medium. Der var et fald i fibronektin udtryk og en betydelig ændring i TGFβ i HeyA8 celler behandles med mellemlang og HPMC-aircondition. (Figur 3A og 3B). Vi testede også potentiale til at blokere den udskilles TGFβ med en neutraliserende antistof i den proksimale kultur. Behandling med TGFβ neutraliserende antistof resulterede i en betydelig nedgang i induktion af TGFβ i HeyA8 celler i proksimale kultur med HPMCs (figur 3 c). Dog steget TGFβ neutraliserende antistof en smule TGFβ udtrykket i kontrol HeyA8 cellerne, nok som en kompenserende svar (figur 3 c).
Derudover har vi også testet effekten af proksimale kultur på udtryk niveauer af epitel markør E-cadherin. Mens proksimale kultur med HeyA8 celler steget en smule E-cadherin udtrykket i HPMCs (figur 2E), blev et markant fald i E-cadherin observeret i HeyA8 celler dyrkes i nærheden af HPMCs i forhold til kontrol (figur 2F). Taget sammen, disse resultater viser effektiviteten af proksimale kultur-systemet i at studere paracrine signalering mellem æggestokkene kræftceller og normale celler i stedet for metastaser, der påvirker genekspression i begge celletyper under den processen med metastatisk kolonisering.
Figur 1: montage af proksimale kultur system. (A) dette panel viser menneskelige primære mesothelial celler (HPMCs). (B) dette panel viser HeyA8 kræft i æggestokkene celler. Skalere barer = 200 µm (A-B). (C) HeyA8 celler var seedet på den nedre overflade af et transwell sæt med 0,4 µm porer. Når cellerne er knyttet, blev Indsæt placeret i et godt af en 6-godt plade der indeholder vækstmediet. Mesothelial celler blev derefter seedede i indsatsen for at være knyttet til den øverste overflade og var adskilt fra HeyA8 cellerne af membranen. 0,4 µm porerne i membranen tilladt udveksling af udskilles faktorer men hæmmede enhver direkte kontakt mellem cellerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: effekten af den proksimale kultur på mRNA udtryk. De første to paneler viser qPCR for (A) fibronektin og (B) TGFβ1 udtryk i menneskers primære mesothelial celler (HPMCs) kulturperler proksimalt til HeyA8 celler, i forhold til at styre HPMCs. Den næste to paneler viser qPCR for (C) fibronektin og (D) TGFβ1 udtryk i HeyA8 celler kulturperler proksimalt til HPMCs i forhold til kontrol Heya8 celler. De sidste to paneler viser qPCR for E-cadherin udtryk i (E) HPMCs kulturperler proksimalt til HeyA8 celler og (F) HeyA8 celler kulturperler proksimalt til HPMCs. N = 3, * p < 0,01. Fejllinjer udgør standardafvigelsen af de tre gentagelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: effekt af menneskelige primære mesothelial celler (HPMC)-aircondition medium behandling om mRNA ekspression i HeyA8 celler. De øverste to paneler viser qPCR for (A) fibronektin og (B) TGFβ1 udtryk i HeyA8 celler. (C) dette sidste panel viser effekten af hæmme udskilles TGFβ1 med en neutraliserende antistof (TGFβ1 Ab) på HeyA8 TGFβ1 udtryk efter en proksimal kultur med HPMCs. N = 3, * p < 0,01. p < 0,05. Fejllinjer udgør standardafvigelsen af de tre gentagelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forstå mekanisme af paracrine og juxtacrine signaler mellem celler er afgørende for udviklingen af et bedre kendskab til normale væv homøostase og sygdom betingelser7,8. De fleste paracrine signalering undersøgelser er udført ved at indsamle aircondition medium fra én celletype og bruger det til at behandle anden celletype. Denne metode har en fordel i dens iboende enkelhed. Dog det ikke præcist sammenfatte de lokaliserede koncentrationer af de udskilles faktorer i den cellulære mikromiljø eller kinetik af produktion og nedbrydning af de involverede faktorer. Mens førstnævnte kan løses til en vis grad, selv ikke nøjagtigt ved at koncentrere den konditioneret medium, det er meget vanskeligt at genskabe kinetik. Brugen af transwell skær at dyrke celler i indsatsen og i bunden af brønden kan, til en vis grad generobre virkningerne af kinetik af produktion og udtynding. Dog cellerne separeres af afstanden mellem indsatsen og i bunden af brønden, og således ikke kan genoprette de lokaliserede koncentrationer af paracrine faktorer. Vi rapporterede udvikling af simple proksimale kultur metode til at studere gensidige paracrine signalering, som beholdt de lokaliserede høje koncentrationer af de udskilles faktorer samt dynamikken i den produktion og nedbrydning af faktorer.
I en proof-of-principle undersøgelse viste vi effektiviteten af metoden proksimale kultur i at gengive de rapporterede effekter af interaktioner mellem kræft i æggestokkene celler og HPMCs. Derudover viste vi også de modsatte virkninger af gensidige paracrine interaktioner på udtryk for epitelial markør E-cadherin i HeyA8 celler og HPMCs. Mens vores eksperiment involveret dyrkning af celler i en periode af 3 dage, det kan tilpasses til kortere eller længere tid point ved at justere den første række celler seedet. Dette gør det muligt for forskere at studere kortsigtede såvel som langsigtede virkninger af paracrine signalering eller udføre tidsforløb undersøgelser. Denne enkle metode kan potentielt anvendes til enhver forskning på paracrine signalering mellem to vedhængende celletyper, herunder immunologi, angiogenese, celle udvikling, og sårheling, ud over undersøgelser på tumor mikromiljø.
De kritiske trin i denne metode såning celler på den nedre overflade af membranen og høst celler fra begge overflader på slutpunktet. Vi opnåede en såning på den nedre overflade af første flipping Indsæt og derefter såning cellerne som en stor dråbe af medium. Cellen mere tilhænger af de to studerede bør være seedet på bunden overfladen. Pleje har ikke skal forstyrre indsatsen mens inkubere det for at undgå denne klat af medium fra forstyrre. Silikonegel kan anvendes til kanterne af insert for at undgå at sprænge og løbe af boblen af væske. For enden af den proksimale kultur eksperiment er celler på begge sider af membranen fortløbende trypsinized i stedet for mængden direkte, fordi lysing dem på risici membran krydskontaminering af lysates gennem porerne. Ved at trypsinizing dem i deres enkelte rum og pasning, medium og trypsin aldrig overstiger det fastsatte beløb i protokollen, undgås enhver krydskontaminering. Hver celletype opsamles i en separat tube, centrifugeres, og den celle pellet er derefter mængden.
Selv om denne teknik giver mulighed for en effektiv undersøgelse af paracrine interaktioner samtidig undgå åbenlys direkte interaktioner, kan ikke vi udelukke interaktioner gennem tunneling nanotubules (TNTs). Nogle af disse TNTs kan være smalle nok til at passere gennem 0,4 µm porerne og lang nok til at spænde 10 µm tykkelsen af membranen. Mens vores forsøg på at bekræfte deres tilstedeværelse i porerne ved konfokalmikroskopi var usikkert (data ikke vist), kunne elektronmikroskopi potentielt anvendes til at bekræfte deres tilstedeværelse. Derfor, denne metode ikke udelukker de potentielle celle-celle kommunikation gennem TNTs hvis kandidat celler er i stand til at danne dem og interagere via dem. På samme måde, vi kan ikke udelukke øget autocrine signalering som følge af den potentielle blokering af porer af celler på begge sider af membranen, forhindrer cross-diffusion.
Voksende celler i enten overfladen af en membran med 0,4 µm porer giver også den potentielle udveksling af exosomes. Exosomes var traditionelt betragtes som trash tasker af celler, men nyere forskning har vist, at disse vesikler med deres last af proteiner, MicroRNA, og endda mRNAs og DNA fungerer som vigtige mediatorer af paracrine celleopbygget22 , 23 , 24. derfor, metoden proksimale kultur effektivt kan bruges til at studere cellulær kommunikation gennem exosomes. Desuden, er denne metode indstillet til behandlingen med specifikke hæmmere af signaling eller neutraliserende antistoffer mod udskilles ligand eller tilsvarende receptor. I Resumé rapporterede vi udviklingen af en simpel og alsidig proksimale kultur metode, som præcist kan replikere paracrine signalerer samtidig forhindre direkte interaktioner mellem cellerne. Enkelheden i denne metode giver mulighed for udbredt anvendelse i forskellige områder som kræft biologi, udvikling og Immunologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi står i gæld til patienter for deres deltagelse i samlingen væv for disse eksperimenter. En DoD OCRP æggestokke kræft Academy Award (W81XWH-15-0253) og en pilot award fra Colleen's Dream Foundation til Anirban K. Mitra støttet denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
