Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Proksimale kultur metode å studere Paracrine signalering mellom celler

doi: 10.3791/58144 Published: August 28, 2018

Summary

Paracrine og juxtacrine mobilnettet interaksjoner spiller en viktig rolle i mange biologiske prosesser, herunder svulst progresjon, immunreaksjoner, angiogenese og utvikling. Her brukes en proksimale kultur metoden å studere paracrine signalering der de lokaliserte konsentrasjonene av secreted faktorene vedlikeholdes mens forebygge direkte mobilnettet kontakt.

Abstract

Intercellulære interaksjoner spiller en viktig rolle i mange biologiske prosesser, herunder svulst progresjon, immunreaksjoner, angiogenese og utvikling. Paracrine eller juxtacrine signalering formidler slik interaksjon. Bruk av en betinget medium og coculture studier er de vanligste metodene for å skille mellom disse to typer interaksjoner. Men effekten av lokaliserte høye konsentrasjoner av utskilles faktorer i microenvironment under paracrine interaksjoner er ikke nøyaktig recapitulated av betinget medium, og dermed kan føre til upresis konklusjoner. Du løser dette problemet, har vi utviklet en proksimale kultur metode for å studere paracrine signalering. De to celletyper dyrkes på enten overflaten av en 10 µm tykke polykarbonat membran med 0,4 µm porene. Porene tillate utveksling av utskilles faktorer og samtidig, hemmer juxtacrine signalering. Cellene kan samles og lysed ved endepunktet å bestemme effekten av paracrine signalene. I tillegg til at for lokaliserte konsentrasjon graderinger utskilles faktorer, er denne metoden mottakelig for forsøk med lengre kultur, samt bruk av hemmere. Mens vi bruker denne metoden til å studere samspillet mellom eggstokkreft celler og mesothelial cellene de møter på stedet av metastasering, kan det tilpasses alle to tilhenger celletyper for forskere å studere paracrine signalering i ulike felt, inkludert svulst microenvironment, immunologi og utvikling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Rollen produktiv gjensidige interaksjoner mellom kreftceller og svulst microenvironment i svulst progresjon er godt etablert og har blitt et hovedfokus for forskning på kreft biologi1. Lignende tilfeller toveis signalnettverk er avgjørende under sårheling, immunreaksjoner, angiogenese, Stamcelle nisjer, og under utvikling,2,,3,,4,,5,,6 , 7 , 8. et felles tema i alle disse biologiske prosesser er at cellene reagerer på ulike måter for ekstracellulære signaler fra deres microenvironment som bestemmer celle skjebne, vev fysiologi og sykdomsprogresjon. Derfor har fokus stadig vendt mot utvikle en bedre forståelse for mekanismene som er involvert i slike celle-celle-kommunikasjon. Et flertall av slike samhandlinger innebære paracrine eller juxtacrine signalering mellom celler. Paracrine signalering omfatter utskillelsen av spesifikke signalnettverk faktorer av én celle som oppfattes av tilsvarende reseptorer på en annen celle i nærheten, utløser et svar i den9,10, mens juxtacrine signalisering krever direkte kontakt mellom cellulære komponenter av to celler involvert11,12.

Så signalering er en viktig komponent i vev homeostase og svulst microenvironment. Kreftceller nytte paracrine og juxtacrine faktorer fra celler i det svulst stroma, inkludert kreft-assosiert fibroblaster (CAFs), immunceller og adipocytter13,14,15,16. Paracrine signalene kan være formidlet av vekstfaktorer, cytokiner, chemokines, etc., mens juxtacrine signalene innebærer juxtaposed ligander og reseptorer som hakk signalering eller interaksjoner mellom integrins og de respektive ekstracellulær matrix proteiner. Vi har vist betydningen av gjensidige interaksjoner mellom eggstokkreft celler og CAFs i svulst progresjon og metastasering14. Tilsvarende regulere samhandling metastasizing eggstokkreft celler med mesothelial cellene dekker området av metastasering nøkkel microRNAs og transkripsjonsfaktorer i kreftcellene som fremmer metastatisk kolonisering17, 18.

De fleste studier paracrine signalering innebærer bruk av en betinget medium samlet inn fra en celle type å behandle andre celle type med. Mens denne tilnærmingen er blitt vidt anvendt, replikerer det effektivt ikke lokaliserte høy-konsentrasjon nivåene av secreted faktor i microenvironment for mottak cellen. Også mislykkes å reprodusere kinetics kontinuerlig flyt av secreted faktor blir produsert av en celle og mottatt av nærliggende cellen. Paracrine signalnettverk er effektiv over korte avstander som secreted faktorene er på de nødvendige konsentrasjonene bare i kildecellen og diffuse og fortynne ut som avstanden øker. Denne lokaliserte høy konsentrasjon av secreted faktor er viktig å utløse en reaksjon i reseptor-cellen. Videre er svaret i mottakerens cellene også avhengig av saldoen nylig utskilles faktorer og utarming deres kontinuerlig gjennom fornedrelse, binding og internalisering i mottakerens celler og diffusion fra kildecellen. Betinget mediet kan være konsentrert kontoen for de høyere lokaliserte konsentrasjonene tilstede i microenvironment, men som ikke nøyaktig gjenskape de eksakte konsentrasjonene. Videre kan det etterligner den naturlige kinetics produksjon og uttømming av faktor involvert. Mer nøyaktig gjenskape paracrine signalering og skiller den fra juxtacrine signalering mekanismer, har vi utviklet en roman proksimale kultur metoden, som innebærer voksende de to celletyper på enten overflaten av en porøs membran. Porene er små nok til å hindre juxtacrine vekselsvirkningene og likevel tillate utveksling av utskilles faktorer på lokaliserte høye konsentrasjoner. På denne måten beholder systemet the kinetics av produksjon og uttømming av paracrine faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen følger retningslinjene i den institusjonelle Regulatory styret av Indiana University.

1. celle forberedelse

  1. Isolasjon og kultur for menneskelig primære mesothelial cellene
    1. Isolere menneskelige primære mesothelial cellene (HPMCs) fra menneskelig omentum beskrevet tidligere17,18 og vokse dem i fullføre oppblomstringen medium [Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% vitaminer] på 37 ° C og 5% CO2.
      Merk: HPMCs er vanligvis dyrket til 100% samløpet (figur 1A).
  2. Vekst betingelser for eggstokkreft celler
    1. Vokse HeyA8 ovarian kreftceller i fullstendig vekst medium på 37 ° C og 5% CO2.
      Merk: Bruk HeyA8 celler dyrket til rundt 80% samløpet (figur 1B).

2. celle kultur

  1. Proksimale kultur oppsett
    1. Bruk Transwell setter inn for 6-vel plater med en 10 μm-tykk vev kultur-behandlet polykarbonat membran med 0,4 μm porene (108 porene/cm2) og en 4,67 cm2 vekstområde. Hvis nødvendig, optimalisere for forskjellige sett inn størrelser ved skalering antall celler seeded ifølge vekst areal. Varm komplett oppblomstringen medium, trypsin og fosfat-bufret saltvann (PBS) til 37 ° C før bruk.
  2. Forbereder skivene
    1. For å frø HeyA8 cellene på lavere overflaten av membranen av sette, fjerne sette fra emballasjen ved hjelp av sterile pinsett og sett den invertert i sterilt 15 cm kultur parabol.
    2. Bruk en 15 cm rett, som det har dybden å imøtekomme invertert innsatsen eller erstatte den med alle aktuelle sterile containeren. Avhengig av eksperimentet, sett antall innsettinger i 15 cm parabolen.
    3. Merke de tre kontrollene og tre eksperimentelle forhold tilsvarende med en markør på kanten av skivene.
  3. Forbereder kreftceller
    1. Trypsinize HeyA8 cellene dyrkes på 80% samløpet i en 25 cm2 kolbe (~ 2 x 106 celler), legge til 1 mL av trypsin (0,25%) for 40-60 s og nøytralisere trypsin med 6 mL av komplett vekst medium.
    2. Sentrifuge cellene på 500 x g ved romtemperatur (RT) for 3 min, forkaste nedbryting og resuspend celle pellet i 5 mL av komplett vekst medium. Telle levende celler med metoden trypan blå fargestoff eksklusjon.
  4. Såing kreftceller
    1. Suspendere 100.000 celler/mL av live HeyA8 celler i fullstendig vekst medium. Nøye frø 80.000 HeyA8 celler suspendert i 800 μL komplett vekstmediet på bunnen av sette (som nå vender opp, siden det er omvendt).
    2. Frø cellene danner en kuppel figur slik cellene forbli på innsatsen (figur 1 c). Starter fra midten av membranen og flytte utover i konsentriske sirkler mens sakte pipettering. Unngå å gå mer enn 3 mm fra kanten å forhindre en søl av mediet.
      Merk: Antall celler seeded vil avhenge veksten av celler og varigheten av eksperimentet. Antall HeyA8 celler seeded proksimale nøkkelord var optimalisert og cellene blir 80-90% confluent på slutten av den tredje dagen.
  5. Kreft cellen vedlegg
    1. Dekke 15 cm fatet og Flytt forsiktig parabolen som inneholder skivene til CO2 inkubator. Det er viktig ikke å forstyrre dråpe medium og celler på Sett inn på dette trinnet. La cellene på 37 ° C 4 h at kreftcellene knytte til innsatsen.
  6. Forbereder mesothelial cellene
    1. Etter rundt 4 h, trypsinize HPMCs dyrket ved 100% samløpet i en 75 cm2 kolbe (~ 4 x 106 celler) med 2 mL trypsin (0,25%) i 1-2 min og nøytralisere trypsin med 12 mL komplett oppblomstringen medium.
    2. Sentrifuge cellene på 500 x g ved RT for 3 min resuspend celle pellet i 10 mL av komplett oppblomstringen medium og telle levende celler med metoden trypan blå fargestoff eksklusjon.
  7. Såing mesothelial cellene
    1. Avbryte 300.000 celler/mL live HPMCs komplett oppblomstringen medium. Legge til 2,5 mL av fersk komplett vekst medier hver brønn av en 6-vel plate. Forsiktig ta 15 cm parabolen som inneholder skivene ut til biosikkerhet panseret. Bruker sterilt tang, Vend innsatsen og plasserer den i av 6-vel platen slik at det er oppreist, med HeyA8 celler knyttet til lavere overflaten midt i fullstendig vekstmediet (figur 1 c).
    2. Frø 450.000 HPMCs suspendert i 1,5 mL vekstmediet i innsiden av skivene med HeyA8 celler på overflaten mot bunnen av brønnen (figur 1 c), eller setter inn uten HeyA8 celler av HPMC kontrollene. Legge til 1,5 mL vekst medium uten celler HeyA8 kontrollene.
  8. Økende proksimale kultur
    1. La den proksimale kulturen vokse i CO2 inkubator på 37 ° C og 5% CO2 72 h. Om nødvendig kan mediet fylles som følger.
      1. På innsiden av sette, fjerner 750 µL og legge 750 µL av fersk komplett vekst medium.
      2. For utsiden av sette (6-vel plate), fjerne 1 mL og legger 1 mL av fersk komplett oppblomstringen medium. 1 mL ble valgt for bekvemmeligheten av endring mediet i ett trinn. Eventuelt kan 1,25 mL fjernes og erstattes i stedet.
  9. Samle cellene
    1. Samle cellene etter 72 h proksimale kultur. Ta spesielt vare på dette trinnet å forhindre kryss-kontaminering av HeyA8 celler og HPMCs. Trypsinize cellene, sentrifuge dem og lyse pellet i stedet for lysing cellene i membranen å forhindre kryss-kontaminering.
  10. Trypsinizing celler
    1. Skyll begge sider av innsatsen med 1 x PBS.
    2. Overføre som setter inn en ny brønn og legge trypsin. Legg 0,5 mL av trypsin på innsiden av sette og Legg 2 mL av trypsin til 6-vel platen til å trypsinize kreftceller knyttet til lavere overflaten av sette. Inkuber plate i 2 minutter på 37 ° C.
  11. Nøytralisere trypsin
    1. Legg 1 mL av komplett vekstmediet på innsiden av sette å nøytralisere trypsin, Pipetter opp og ned, og deretter ta cellene og overføre dem til en merket samling rør. Legge til en ekstra 2 mL komplett oppblomstringen medium for en komplett nøytralisering. Forsiktighet bør utvises ikke å pierce membranen mens pipettering for å hindre en krysskontaminering av cellene.
    2. Å samle cellene på bunnen av sette, Pipetter 2 mL trypsin som ble lagt i trinn 12.2 på bunnen 2-3 x slik at cellene falle i bunnen av 6-vel platen. Nøytralisere trypsin på bunnen av platen med 6 mL av oppblomstringen medium og overføre innholdet i platen slik merket samling.
  12. Innsamling og lysing cellene
    1. Sentrifuge cellene på 500 x g for 3 min og Sug opp media. Resuspend og lyse celle pellets med 0,7 mL fenol og guanidine-thiocyanate-baserte lysis reagens for RNA utvinning. Isolere RNA bruker noen egnede kit.

3. kvantitativ sanntid polymerasekjedereaksjons

Merk: Følgende fremgangsmåte beskriver en kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjons (qPCR) for å studere genet uttrykk endringer som følge av den proksimale kulturen.

  1. Forberede cDNA fra RNA prøvene for qPCR. Bruke noen passende revers transkriptase med en tilsvarende buffer og tilfeldig primere for å sikre omvendt transkripsjon av alle mRNA (se Tabell for materiale).
  2. Vurdere endringer i mRNA uttrykk nivåene av fibronectin (FN1) og E-cadherin (CDH1) og transformere vekstfaktor beta 1 (TGFβ1) av qPCR med glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) som en intern kontroll. Det er mulig å bruke standardisert kommersielt tilgjengelig gene expression analyser (se Tabell for materiale) eller utforme primere.
  3. Sammenligne HeyA8 celler dyrket i proksimale kultur med HPMCs med HeyA8 kontroller og HPMCs vokst proksimale kultur med HPMC kontrollene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metastasizing eggstokkreft celler møte mesothelial cellene på stedet av metastasering i bukhulen19. Produktive paracrine og juxtacrine vekselsvirkningene med mesothelial cellene hjelp i inducing adaptive svar i eggstokkreft celler som aktiverer vellykket metastasering17,18,20,21 . For å teste effektiviteten av metoden proksimale kultur, testet vi paracrine samspillet mellom HeyA8 eggstokkreft celler og HPMCs. Det har tidligere vært rapportert at en coculture av HeyA8 celler med HPMCs fører til økt uttrykk for fibronectin i HPMCs21. Denne induksjon av fibronectin uttrykk er formidlet av en økt utskillelse av TGFβ av HeyA8 celler21. Derfor testet vi effekten av en proksimale kultur av HeyA8 celler og HPMCs på mRNA nivåene av fibronectin og TGFβ i begge disse cellene. Som forventet, førte proksimale kultur med HeyA8 celler det økt uttrykket for fibronectin i HPMCs sammenlignet med kontroller som ble sådd på innsettinger uten HeyA8 celler knyttet til lavere overflaten (figur 2A). Tilsvarende proksimale kulturen i HPMCs med HeyA8 celler resulterte i en økt uttrykk for TGFβ i tidligere (figur 2B). Uttrykk for både fibronectin og TGFβ også betydelig økt i HeyA8 celler på proksimale kultur med HPMCs i forhold til kontroller hvor HPMCs ikke var frø i den øvre overflaten av skivene (figur 2C og 2D).

For å sammenligne effekten av den klassiske betinget middels tilnærmingen, utført vi et eksperiment behandling av HeyA8 celler med en HPMC-conditioned medium. Det var en nedgang i fibronectin uttrykk og en betydelig endring i TGFβ i HeyA8-cellene behandlet med HPMC-conditioned medium. (Figur 3A og 3B). Vi testet potensialet i blokkering av secreted TGFβ med en nøytraliserende antistoff proksimale kulturen. Behandling med TGFβ nøytraliserende antistoffer resulterte i en betydelig reduksjon i induksjon av TGFβ i HeyA8 celler i proksimale kultur med HPMCs (Figur 3 c). Men økt TGFβ nøytraliserende antistoffer litt TGFβ uttrykket i kontrollen HeyA8 cellene, trolig som kompenserende svar (Figur 3 c).

I tillegg testet vi effekten av proksimale kultur på uttrykk nivåene av epitelial merket E-cadherin. Mens proksimale kultur med HeyA8 celler litt økt E-cadherin uttrykket i HPMCs (figur 2E), ble en markant nedgang i E-cadherin observert i HeyA8 celler dyrket i nærheten av HPMCs i forhold til kontroller (figur 2F). Til sammen disse resultatene viser effektiviteten av det proksimale kultur-systemet i å studere paracrine signalering mellom ovarian kreftceller og normale celler på stedet av metastasering som påvirker genuttrykk i begge celletyper under den prosessen med metastatisk kolonisering.

Figure 1
Figur 1: montering av proksimale kultur. (A) dette panelet viser menneskelige primære mesothelial cellene (HPMCs). (B) dette panelet viser HeyA8 eggstokkreft celler. Skalere barer = 200 µm (AB). (C) HeyA8 celler var frø på lavere overflaten av en transwell inn med 0,4 µm porene. Når cellene var festet, ble innsatsen plassert i et godt av en 6-vel plate inneholder oppblomstringen medium. Mesothelial cellene var så frø i sette inn slik at de knyttet til den øvre overflaten og ble skilt fra de HeyA8 cellene av membran. 0,4 µm porene i membranen tillatt utveksling av utskilles faktorer men hemmet direkte kontakt mellom cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: effekten av den proksimale kulturen på mRNA uttrykk. De første to paneler viser qPCR for (A) fibronectin og (B) TGFβ1 uttrykk i menneskets primære mesothelial cellene (HPMCs) kultivert proximally HeyA8 celler, i forhold til kontrollen HPMCs. Neste to paneler showet qPCR (C) fibronectin og (D) TGFβ1 uttrykk i HeyA8 celler kultivert proximally til HPMCs, sammenlignet med kontrollen Heya8 celler. To panelene viser qPCR for E-cadherin uttrykket i (E) HPMCs kultivert proximally å HeyA8 cellene og (F) HeyA8 kultivert proximally til HPMCs N = 3, * p < 0,01. Feilfeltene representerer standardavviket for tre gjentakelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: effekten av human primære mesothelial celle (HPMC)-betinget middels behandling på mRNA uttrykket HeyA8 celler. Toppen to panelene viser qPCR for (A) fibronectin og (B) TGFβ1 uttrykk i HeyA8 celler. (C) denne siste panel viser effekten av hemme utskilles TGFβ1 med en nøytraliserende antistoff (TGFβ1 Ab) på HeyA8 TGFβ1 uttrykk på en proksimale kultur med HPMCs N = 3, * p < 0,01. p < 0,05. Feilfeltene representerer standardavviket for tre gjentakelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forstå mekanismen av paracrine og juxtacrine signalene mellom celler er avgjørende for å utvikle en bedre kjennskap til normalt vev homeostase og sykdom betingelser7,8. De fleste paracrine signalering studier er utført ved å samle betinget medium fra en celle type og bruke den til å behandle andre celle type. Denne metoden har en fordel i sin iboende enkelhet. Men det ikke nøyaktig er recapitulate lokaliserte konsentrasjonen av secreted faktorene i cellular microenvironment eller the kinetics av produksjon og uttømming av faktorene som er involvert. Mens tidligere kan rettes til en viss grad, men ikke nøyaktig, ved å konsentrere betinget mediet, er det svært vanskelig å gjenskape kinetics. Bruk av transwell setter å vokse celler i innsatsen og i bunnen av brønnen kan til dels gjenerobre effekten av the kinetics av produksjon og forbruk. Men cellene er atskilt med avstanden mellom innsettings- og bunnen av brønnen, og dermed ikke kan gjenopprette de lokaliserte konsentrasjonene paracrine faktorer. Vi rapporterte utviklingen av en enkel proksimale kultur metode å studere gjensidige paracrine signalnettverk, som beholdt de lokaliserte høye konsentrasjonene av secreted faktorer og dynamikken i frekvensen av produksjon og uttømming av faktorene.

I en bevis-av-prinsippet studie viste vi effektiviteten av metoden proksimale kultur i gjengivelse rapporterte effekten av samspillet mellom eggstokkreft celler og HPMCs. I tillegg viste vi også motsatte effekten av gjensidige paracrine interaksjoner med uttrykk for epithelial markøren E-cadherin i HeyA8 celler og HPMCs. Mens eksperimentet vårt involvert dyrking cellene over en periode på 3 dager, det kan tilpasses til kortere eller lengre tid poeng ved å justere det opprinnelige antallet celler seeded. Dette gjør at forskere studere kortsiktige samt langsiktige virkningene av paracrine signalene eller utføre gang-retters studier. Denne enkle metoden kan potensielt brukes noen forskning på paracrine signalering mellom to tilhenger celletyper, inkludert immunologi, angiogenese, celle utvikling og sår helbredelse, i tillegg til studier av svulst microenvironment.

Kritisk trinnene i denne metoden er seeding cellene på lavere overflaten av membranen og høste celler fra begge flater på sluttpunktet. Vi oppnådde en seeding på lavere overflaten av første bla innsatsen og deretter seeding cellene som en stor dråpe medium. Mer tilhenger cellen av de to studerte bør være seeded på bunnen. Forsiktighet må tas ikke å forstyrre innsatsen mens rugende den for å unngå dette blob av middels avbryter. Silikongel kan brukes på kantene av sette å unngå det byste og søl av boble av væske. På slutten av proksimale kultur eksperimentet, er cellene på begge sider av membranen sekvensielt trypsinized i stedet for lysed direkte, fordi lysing dem på membran risiko kryss-forurensning av lysates gjennom porene. Trypsinizing dem i sine enkelte avdelinger og omsorg at medium og trypsin volumet aldri overstiger fastsatte mengden protokollen, unngås noen kryssforurensning. Hver celle type samles i en egen tube, sentrifugeres, og cellen pellets er så lysed.

Selv om denne teknikken tillater effektiv studiet av paracrine interaksjoner og unngå utilslørt direkte vekselsvirkningene, kan ikke vi utelukke interaksjoner gjennom tunnelering nanotubules (TNTs). Noen av disse TNTs kan være smal nok til å passere gjennom 0,4 µm porene og lenge nok til å omfatte 10 µm tykkelsen av membranen. Mens våre forsøk på å kontrollere sin tilstedeværelse i porene av AC confocal mikroskopi var usikker (data ikke vist), kan potensielt elektronmikroskop brukes til å bekrefte deres tilstedeværelse. Derfor utelukker denne metoden ikke potensielle celle-celle kommunikasjon gjennom TNTs hvis kandidat cellene danner dem og samspill med dem. På samme måte kan ikke vi styre ut økt autocrine signalering som følge av potensielle blokkering av porene av celler på begge sider av membranen, hindre kryss-diffusjon.

Økende celler i enten overflaten av en membran med 0,4 µm porene tillater også potensielle utveksling av exosomes. Exosomes ble tradisjonelt ansett som søppel poser av celler, men nyere forskning har vist at disse vesikler med sin Last av proteiner, microRNAs, og selv mRNAs og DNA tjene som viktig meglere paracrine cellular kommunikasjon22 , 23 , 24. derfor metoden proksimale kultur kan brukes effektivt til å studere cellular kommunikasjon gjennom exosomes. Dessuten, er denne metoden mottakelig for behandling med bestemt hemmere av signalnettverk eller nøytraliserende antistoffer mot utskilles ligand eller tilsvarende reseptor. I sammendraget rapporterte vi utviklingen av en enkel og allsidig proksimale kultur-metoden, som replikeres nøyaktig paracrine signalering mens forebygge direkte interaksjoner mellom celler. Enkelheten av denne metoden kan anvendelsen utbredt i ulike felt som kreft biologi, utvikling og immunologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er gjeld til pasienter for deltakelsen av vev samlingen disse eksperimentene. En DoD OCRP Ovarian Cancer Oscar (W81XWH-15-0253) og en pilot prisen fra Colleen's Dream Foundation til Anirban K. Mitra støtter denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert Corning (Costar) 3412 • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane
• Treated for optimal cell attachment
• Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case
• Membrane must be stained for cell visibility
• Sterilized by gamma radiation
6 well plate Corning (Falcon) 353046 Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish Corning (Falcon) 353025 Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM Corning (Cellgro) 10-013-CV
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI
MEM Nonessential amino acids Corning (Cellgro) 25-025-CI
MEM Vitamins Corning (Cellgro) 25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Pipets Any make is fine
CO2 Incubator Any make is fine
Biosafety level II cabinet Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay ThermoFisher Scientific Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit Qiagen 217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher Scientific 43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody R&D Systems MAB1835-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, (3), 309-322 (2012).
  2. Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174, (1), 21-25 (2005).
  3. Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199, (5), 1543-1552 (2017).
  4. Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. 123-146 (2016).
  5. Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15, (6), 531-542 (2010).
  6. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55, (4-5), 447-453 (2011).
  7. Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13, (7), 497-512 (2014).
  8. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16, (3), 225-238 (2015).
  9. Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264, (1), 169-184 (2001).
  10. Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30, (2), 107-116 (2012).
  11. Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4, (10), (2012).
  12. Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282, (45), 32890-32901 (2007).
  13. Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72, (10), 2473-2480 (2012).
  14. Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2, (12), 1100-1108 (2012).
  15. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17, (11), 1498-1503 (2011).
  16. Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75, (2), 456-471 (2015).
  17. Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34, (48), 5923-5932 (2015).
  18. Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
  19. Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
  20. Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, (2), 144-157 (2011).
  21. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124, (10), 4614-4628 (2014).
  22. Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159, (3), 499-513 (2014).
  23. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126, (4), 1208-1215 (2016).
  24. Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34, (48), 5857-5868 (2015).
Proksimale kultur metode å studere Paracrine signalering mellom celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. J. Vis. Exp. (138), e58144, doi:10.3791/58144 (2018).More

Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. J. Vis. Exp. (138), e58144, doi:10.3791/58144 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter