Summary
Denne artikel beskriver i detaljer en metode baseret på sølv nanopartikler til mildne biliær atresi syndrom i en eksperimentel biliær atresi musemodel. En solid forståelse af reagens forberedelsesprocessen og neonatal mus injektionsteknik hjælper stifte forskere med metoden anvendt i neonatal musen model undersøgelser.
Abstract
Biliær atresi (BA) er en svær form af cholangitis med høj dødelighed hos børn af som ætiologi er stadig ikke fuldt forstået. Virale infektioner kan være en mulig årsag. Den typiske dyremodel bruges til at studere BA er etableret ved at vaccinere en neonatal mus med et rhesus rotavirus. Sølv nanopartikler har vist sig at udøve antibakteriel og antiviral virkninger; deres funktion i BA musen model er vurderet i denne undersøgelse. I øjeblikket, i BA dyreforsøg er metoder til at forbedre symptomerne på BA mus generelt symptomatisk behandlinger givet via fødevarer eller andre stoffer. Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere en ny metode til mildne BA syndrom i mus af intraperitoneal injektion af sølv nanopartikler og give detaljerede metoder for at forberede sølv nanopartikler gel formulering. Denne metode er simpel og bredt anvendelig og kan bruges til forskning mekanisme af BA, såvel som i kliniske behandlinger. Baseret på musemodel BA når musene udstille gulsot, sprøjtes rede sølv nanopartikler gel intraperitoneal til overfladen af lavere leveren. Overlevelse status er observeret, og biokemiske indikatorer og leveren histopatologi undersøges. Denne metode giver mulighed for en mere intuitiv forståelse af både etablering af BA model og roman BA behandlinger.
Introduction
BA er en form for kolestase karakteriseret ved vedvarende gulsot og har høj dødelighed i mangel af levertransplantation. Virusinfektioner er tæt knyttet til patogenesen af BA. Cytomegalovirus, reovirus og rotavirus er alle blevet foreslået som patogener i BA1,2,3. I det neonatale periode, den umodne immunsystem reaktion på en virusinfektion resulterer i immun dysregulering mod ekstra- og intrahepatisk galdegangene, fører til biliær epitelcelle apoptose, inflammatoriske celle infiltration i portalen område, intrahepatisk og ekstrahepatisk galdegang obstruktion, og endelig leverfibrose4,5,6.
De almindeligt anvendte dyremodel for BA undersøgelser omfatter podning af en neonatal mus med rhesus rotavirus (RRV). Musen typisk udvikler gulsot efter 5-6 dage, viser en lav kropsvægt og acholic afføring. Immunrespons i sygdomsprocessen rolle er afgørende, især for natural killer (NK) celler; nedbrydningen af disse celler med anti-NKG2D antistof reducerer BA-induceret skade7. Derudover andre celler, herunder CD4+ T-celler, CD8+ T celler, dendritiske celler og regulerende T-celler, har alle vist sig at spille en rolle i sygdom8,9,10,11. Alle data tyder den uundværlige karakter af immunsystemet i løbet af BA.
Sølv nanopartikler (AgNPs) har vist sig for at have gavnlige virkninger mod visse smitsomme sygdomme, herunder bakterielle infektioner12 og virusinfektioner13,14,15. Men bortset fra Dermatologisk brug, få undersøgelser har brugt AgNPs i en klinisk behandling, mest på grund af deres potentielle toksicitet. I dyreforsøg, har forskere generelt undersøgt effekten af AgNPs administreres via mundtlige16 eller intravenøs metoder17. Men ingen andre forskere har undersøgt effekten af AgNPs administreres via en intraperitoneal (i.p.) indsprøjtning i neonatal mus eksperimenter, som er en enkel og hurtig metode fører til en mere direkte effekt på leveren og galdeveje mens at reducere toksiciteten for andre systemer, såsom immunsystemet. AgNPs har vist sig at påvirke NK celle aktivitet18; Derfor, vi testede de terapeutiske virkninger af AgNPs administreres via i.p. injektion i BA musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimentelle protokoller er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Sun Yat-Sen Universitet Laboratory Animal Center (#IACUC-DB-16-0602).
1. etablering af biliær atresi musen Model
- Vedligeholde gravid BALB/c mus i et specifikt patogenfrie miljø under et 12t mørk/lys cyklus på 25 ° C, med adgang til autoklaveres chow ad libitum.
- For at forberede RRV stamme MMU 18006, forstærke virus i MA104 celler og måle de virale titers af en mindeplade assay19.
Bemærk: MA104 celler er kulturperler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) i en inkubator med en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2. Forstærkning trin er kort beskrevet nedenfor.- Inficere MA104 celler (1.5 x 107) i et 150 cm2 kultur kolbe med trypsin-aktiveret RRV [1.5 x 106 plaquedannelse enheder (PFU)] i 30 mL i serumfrit medium. Inkuber de inficerede celler i 3 dage i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Lyse inficerede celler i kultur kolbe af tre fryse-tø cykler, med 20 min i et-80 ° C fryser for hver fryse fase, og derefter, optøning cellerne tilbage til stuetemperatur; celle-associerede virus partikel vil frigive i supernatanten. Derefter indsamle og overføre celle lysate og kultur supernatanten ind i en 15 mL konisk rør.
- Fjerne store cellular vragdele fra den lysate ved lav hastighed centrifugering (300 x g ved 4 ° C i 3 min). Derefter, overføre supernatanten indeholdende virus (ca. 6 mL) til en ny 15 mL konisk slange for dyreforsøg.
Bemærk: RRV er derefter klar til at være titered, aliquoted, og opbevares eller anvendes til yderligere runder af forstærkning. Langvarig eksponering for stuetemperatur vil reducere virusinfektion kapacitet; virussen bør placeres på is og opbevares ved-80 ° C eller i flydende nitrogen.
- Belastning RRV ind i et lille volumen (1 mL) insulin sprøjten med en 29 G nål injektionsvæske neonatal mus.
Bemærk: De tykke nåle af volumetriske sprøjter let føre til narkotika lækage. - Inden for 24 timer af fødsel, administrere til hver nyfødte 20 µL af 1,2 x 105 PFU/mL RRV via i.p. rute; Brug den samme mængde af saltvand som kontrol.
Bemærk: Sprøjten bruges i dette eksperiment er en 1 mL insulin sprøjte. Inficerede mus, der ikke blev fodret af deres mødre døde indenfor de første 2 dage på grund af andre årsager blev ikke medtaget i analysen. - Overhold alle neonatal mus nøje og vejer dem dagligt. Typisk, den sjette dag efter RRV podning, gulsot vises på ørerne og nøgne hud, afføringen bliver ler farvet, og pels bliver fedtet, foreslår oprettelsen af BA model; kontrollere, om disse symptomer.
Bemærk: BA kan bekræftes af en levervæv afsnit eksamen med H & E og immunhistokemiske angivelse. BA mus er derefter klar til AgNP behandling.
Forsigtig: Protokollen præsenteret er til brug med moderne dyrs og menneskers RV stammer, som skal håndteres biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) betingelser.
2. sølv nanopartikler syntese
- Forberede og karakteriserer AgNPs som tidligere beskrevet12,20.
Bemærk: Detaljer til at forberede og kendetegner AgNPs har været beskrevet i publikationer af C. M. Che's team på Department of Chemistry, University of Hong Kong12,20. Den endelige koncentration af løsningen var 1 mM. Den gennemsnitlige diameter af AgNPs var 10 nm (lige 5 til 15 nm) og bekræftet ved elektronmikroskopi.
3. forberedelse af sølv nanopartikler kollagen blanding
Bemærk: AgNP kollagen blanding er forberedt og karakteriseret som tidligere beskrevet21 og opbevares ved 4 ° C. Alle procedurer udføres på is.
- Først, for kollagen forberedelse, tilføje 490 µL af type I kollagen (4 mg/mL) til en 1,5 mL tube og placere den på is.
- Tilsæt 100 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS, 10 x) til kollagen og bland det med en pipette.
- For at forberede 1 L 10 x PBS buffer, kombinere 80 g NaCl, 2 g af KCl og 35,8 g Na2HPO4. 12H2O til 2,4 g KH2PO4 og butik buffer ved stuetemperatur.
- Derefter tilføje 10 µL af NaOH (0,2 M) til ovenstående løsning.
- For at forberede 0,2 M NaOH, skal du tilføje 8 g NaOH pulver til 1 L med destilleret vand.
- Endelig, tilføje 400 µL af AgNPs (1 mM) til kollagen og bland dem med en pipette.
Bemærk: Tilføje AgNPs sidst for en selv blande. AgNP kollagen blandingen skal opbevares ved 4 ° C; ellers, det nemt størkner ved stuetemperatur.
4. mus injektion metode
- Administrere inficerede neonatal musene i behandlet RRV gruppen med en i.p. indsprøjtning af 50 µL af AgNP kollagen blandingen efter udseendet af gulsot; udføre en anden injektion 3 d senere.
Bemærk: Musene i kontrolgruppen RRV (inficerede kontrol) får den samme mængde af saltvand, og mus i den normale kontrolgruppen får ikke nogen behandling. - I begyndelsen af injektion, tryk på musens ben med ringfingeren skråt over det højre lår, og indføre nål langsomt på en vinkel på 15° (figur 1). Ved ankomsten til overfladen af lever (figur 2), omkring 0,5 cm i nederste kant, injicere AgNP kollagen blanding; derefter, trække nålen langsomt.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at indføre nogen luft ind i sprøjten som, så neonatal musen kan blive dræbt. I neonatal mus, mave og milt er i venstre del af maven, og maven er fuld af mælk. Hvis injektion administreres fra denne side, kunne nålen sagtens indtaste enten maven, forårsager mælk til at flyde ind i bughulen, eller milten, forårsager blødning.
Forsigtig: Opmærksomme på nål til at forhindre enhver finger skader, og sørg for at erstatte nål cap, fjerne nålen, og Placer den i en skarpe container. - Efter alle injektionerne, holde mus ud af deres bure for 10 min at tillade AgNP kollagen blandingen gel og forhindre, at moderen slikke injektionsstedet. Derefter returnere mus til deres bure.
- Observere og registrere de fysiske optrædener af alle mus dagligt, herunder gulsot og kropsvægt samt overlevelsesraten.
5. blod prøve indsamling
Bemærk: Blodprøver af ca 120 µL er indsamlet ved at indsætte nålen ind i hjertet. Efter centrifugering er serum indsamlet (ca. 70 µL) for leverfunktionen test. Metoden blod samling er som følger.
- Bedøver mus på den niende og 12 dagen efter RRV podning, (der er 3 dage efter AgNP behandling) ved hjælp af 0,5-2,5% Sevofluran.
- Immobilisere lemmer af musen og sterilisere den øvre og nedre del af maven med 75% alkohol.
- Udsætte mellemgulvet ved at skære musen hud-, muskel- og bughinde langs midterlinjen til formet som et sværd med saks; bruge en steril vatpind for at fjerne mavetarmkanalen for at fuldt udsætte mellemgulvet muskel.
- Indsætte nålen (med en 1 mL losset insulin sprøjte) ind i venstre hjertekammer af hjertet og langsomt trække sig tilbage i sprøjten stemplet for at opnå den maksimale blodvolumen. Derefter, overføre blod til en 1,5 mL tube.
- Give røret til at stå i 30 min. ved stuetemperatur og centrifugeres i 5 min på 400 x g. Derefter, ved hjælp af en overførsel pipette, indsamle og gemme serum til yderligere brug.
Bemærk: Undgå at beskadige mellemgulvet, som membran defekter let føre til pneumothorax, død og blodkoagulation, derved forhindre blod prøve samling.
6. biokemisk Parameter påvisning
- Brug serum indsamlede i trin 5.5 til en biokemisk parameter påvisning.
- Bruge en automatiseret biokemiske analyzer til at registrere følgende biokemiske parametre: alanin aminotransferase (ALT), aspartat aminotransferase (AST), alkalisk fosfatase (ALP), samlede proteinindhold (TP), albumin (ALB), globulin (GLO), total bilirubin (TBIL), direkte bilirubin (DBIL), indirekte bilirubin (IBIL) og total galdesyrer (TBA).
7. ekstrahepatisk Cholangiography at observere ekstrahepatisk galdegang passage
Bemærk: Udføre hele processen under et mikroskop for dissektion.
- Fuldt udsætte leveren, galdeblæren og ekstrahepatisk galdeveje med en vatpind.
- Observere og fotografere udseendet af lever og galdeveje under et mikroskop for dissektion.
- Bruge oftalmologiske tang til at forsigtigt holde bunden af galdeblæren.
- Indlæse en 1 mL sprøjte med methylenblåt (0,05 wt.% i H2O). Langsomt indsætte sprøjte nål i galdeblæren hulrum; derefter, forstå nålen med den oftalmologiske pincet, og langsomt indgyde 10 – 20 µL af methylenblåt.
- Observere under et mikroskop om den blå farve passerer gennem ekstrahepatisk galdeveje til jejunum og tage et fotografi.
8. opkrævning af frisk lever prøver for hæmatoxylin og Eosin pletter
- Lave den friske mus leveren væv natten over i 10% formalin.
- Derefter integrere de faste leveren væv i paraffin og afsnit dem.
- Afvoksning afsnittene, rehydrere dem med en ethanol serie (som 100%, 95%, 80% og 70% ethanol i destilleret vand, hver i 5 min), pletten væv sektioner med hæmatoxylin, underkaste dem en 1% saltsyre alkohol differentiering og endelig bejdse den sektioner med eosin.
- Endelig, observere histopatologi af lever under en 40 X mikroskop.
9. immunhistokemisk farvning af hæmatoxylin og Eosin-farvede væv sektioner
- Efter dewaxing og rehydrating afsnittene, udføre en antigen hentning af nedsænkning sektioner i Tris-EDTA buffer (10 mM Tris base, 1 mM EDTA-oploesning, pH 9,0) og varme dem i en mikrobølgeovn i 10 min. ved 95 ° C.
- Fjerne endogene peroxidase ved at udsætte afsnittene væv i 10 min til en 3% opløsning af hydrogenperoxid.
- Behandle sektioner med 5% ged serum, at blokere uspecifik bindende.
- Tilføj primære antistoffer kanin-mus NKG2D (1: 100) til afsnittene, og Inkuber dem natten over ved 4 ° C.
- Inkuber sektioner med de relevante sekundære antistoffer (HRP-mærket polymer anti-kanin system) for 30 min. ved stuetemperatur.
- Visualisere immunhistokemisk farvning bruge 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) som kromogen.
- Observere sektioner i en 40 X mikroskop, erhverve billeder, og gå videre til at analysere dem som ønsket.
10. flow Cytometric analyse
- Forsigtigt hakkekød levervævet, passerer en 70 µm celle si, og der centrifugeres det 2 x 270 x g ved 4 ° C i 4 min.
- Resuspenderes celle i RPMI 1640 medium og analysere det ved to-farve immunfluorescens ved hjælp af monoklonale antistoffer.
- Udføre cellulære fænotyper ved hjælp af specifikke celle-overflade markører, herunder fluorescein isothiocyanat - og phycoerythrin-konjugerede anti-NKp46 (NK lymfocytter; 1:1, 000) og anti-CD4 (T-celle subtype, 1:1, 000), med en flow forskellige og analysere data med flow flowcytometri data analyse software.
- Vælg cellepopulationer ifølge frem/side scatter, gate ifølge isotype kontrolelementer til konto til enhver baggrund fluorescens, og data på en sekundær analyse baseret på fluorescens signalerne fra individuelle antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseret på den etablerede BA musemodel, de inficerede neonatal mus blev administreret en i.p. indsprøjtning af den forberedte AgNP kollagen blanding 2 x efter udstiller gulsot. Mus overlevelse blev kontrolleret for dagligt, og leverfunktion test, leveren patologi og flowcytometri blev udført. Sammenlignet med ubehandlet kontrol BA mus, AgNP-behandlede mus viste reduceret gulsot og opretholdt deres normale kropsvægt (figur 3). Niveauer af bilirubin metabolisme og hepatiske transaminase faldet til normal kontrolværdier, hvilket tyder på, at AgNPs væsentligt forbedret leverfunktion (tabel 1). Ekstrahepatisk cholangiography (figur 4) med methylenblåt farvning bekræftet galdegang passage efter AgNP behandling. H & E farvning (figur 5) viste en signifikant nedsat inflammatoriske celle infiltration i området for hepatisk portal i mus behandlet med AgNPs, sammenlignet med kontrol mus. Flow flowcytometri resultater viste betydeligt mindre NK celler i lever efter AgNP behandlinger (både på dage 9 og 12) end i RRV mus (figur 6). Immunhistokemisk farvning afslørede et betydeligt reduceret udtryk af NK celler markør NKG2D (figur 7) i portalen Triaden af de AgNP-behandlede mus, i forhold til RRV mus.
Figur 1: indledende sprøjte penetration holdning. Den røde stiplede linje angiver linje parallel med maven af P6 neonatal mus; den gule pil angiver nål punkt; den røde pil angiver kanylen vinkel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: nålen nå overfladen af den nederste kant af leveren. Den gule stiplede linje angiver den nederste kant af en mus lever; den røde pil angiver positionen kanyle under injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: effekt af AgNPs på BA syndrom i en eksperimentel BA musemodel. (A) dette panel viser udseendet af neonatal mus på dage 9 og 12 efter en indsprøjtning med RRV alene og 3 dage og 6 dage efter en indsprøjtning med AgNPs (RRV + AgNPs). (B) dette panel viser vægten af musene i hver gruppe på forskellige tidspunkter; x-aksen angiver antallet af dage efter mus var født og y-aksen angiver fold-ændringer i kropsvægt. P < 0,01 med Student's t-test sammenligning RRV + AgNp en gruppe til gruppen RRV kontrol; n = 16 i kontrolgruppen, n = 18 i RRV gruppe og n = 17 i RRV + AgNP gruppe. (C) dette panel viser overlevelsesraten for musene i hver gruppe. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ekstrahepatisk cholangiography. En kontraststof blev brugt til at registrere passage af ekstrahepatisk galdeveje og tage billeder. Den blå stiplede linje angiver retningen af ekstrahepatisk galdegang; den røde pil angiver en indsnævring af fælles galdegang; den sorte pil angiver BA. Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: H & E farvning. Leveren væv af mus i hver gruppe på dage 9 og 12 blev indsamlet, fast, snit, og plettet med H & E. forkortelser: PV = portal vene, BD = galdegang. Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: procentdel af NK celler i levervævet. (A) lever af mus blev forarbejdet til celle suspensioner på dage 9 og 12, og andelen af NK celler blev påvist ved flowcytometri. (B) dette panel viser procentdelen af NK celler (NKp46+CD4+) i hver gruppe på forskellige tidspunkter efter AgNP injektion. Y-aksen angiver fold-ændring i den procentvise andel af NK celler, som blev beregnet i forhold til procentsatserne for kontrolgruppen på dag 9 og dag 12.* *P < 0,01 og *P < 0,05, med Student's t-test sammenligning af den RRV + AgNp gruppe til gruppen RRV kontrol, n = 10 i hver gruppe. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: immunhistokemisk farvning for NK celle markør NKG2D i mus i hver behandling gruppe portalområde. Udtryk for NK celle markør NKG2D i portalområde af mus i hver behandling gruppe blev opdaget af immunhistokemisk farvning. Lang pilene angiver galdegangene; de korte pilene angiver NK-celler. Forkortelser: PV: portal vene, BD: galdegang. Sscale bar = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: klinisk laboratorieundersøgelse af lever funktionen-relateret molekyle serumniveauer. Perifert blod blev brugt til at måle leverfunktionen i mus i hver gruppe. ALT: alanin aminotransferase, AST: aspartat aminotransferase, ALP: alkalisk fosfatase, TP: total protein, ALB: albumin, GLO: globulin, TBIL: total bilirubin, DBIL: direkte bilirubin, IBIL: indirekte bilirubin og TBA = samlede galdesyrer. P < 0,05 og **P < 0,01, med Student's t-test for hver studerende i forhold til RRV alene gruppe, n = 10 i hver gruppe. Alle biokemiske indikator data vises som den gennemsnit ± SD. Alle mus i de tre grupper var 12 dage gamle. Denne tabel er ændret fra Zhang et al. 18. venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AgNPs udstiller potent bredspektret antibakterielle egenskaber og en stærk permeabilitet22; Derudover er de brugt til at producere en række antibakterielle lægemidler23. AgNPs kan dog tage lang tid at rydde når de ophobes i organer, og denne stædighed kan føre til toksiske virkninger24,25. En tidligere undersøgelse undersøgte akut toksicitet og genotoksicitet af AgNPs efter en enkelt i.v. injektion i en rotte eksperiment, og resultaterne viste, at AgNPs kan forårsage akut leveren og nyreskader. AgNPs akkumuleret i de vigtigste immunsystem organer, herunder thymus og milt17. I denne mus BA model forbedret behandling med AgNPs BA syndrom, som vores data tyder på, er delvist medieret af NK celler hæmning. De langsigtede virkninger af AgNPs kræver dog en yderligere undersøgelser, at vurdere den potentielle toksicitet for musen udvikling og immun forordning.
Hvad angår metoden, nogle yderligere noter for en vellykket kirurgi er som følger: (i) processen med at udarbejde AgNP kollagen blandingen skal foretages på is fordi ved stuetemperatur, AgNP kollagen blanding vil hurtigt blevet en halvfast gel, som kan ikke bruges til injektioner. Efter tilberedning, skal AgNP kollagen blandingen opbevares ved 4 ° C. (ii) kun 1 mL insulin sprøjter bør anvendes på grund af den lille diameter, hvilket reducerer lækage af det injicerede stof. (iii) tidligere undersøgelser har generelt undersøgt effekten af AgNPs administreres oralt16 eller via intravenøs injektion17. I vores dyreforsøg er de eksperimenterende fag neonatal mus; således intravenøs injektion er næsten umulig, og vi brugte en i.p. indsprøjtning. Injektion af AgNPs forbedret symptomer på BA i mus. (iv) i begyndelsen af injektion, er underekstremiteterne af musen fast i hånden til at forhindre, at musen flytte. Denne metode sikrer, at den rigtige mængde af stoffet indsprøjtes i bughulen uden nogen lækage og yderligere garantier effekten af eksperimentet. (v) i neonatal mus, mave og milt er i venstre del af maven, og maven er fuld af mælk. For at tilføre AgNP blandingen til overfladen af den nederste kant af leveren, indsættes nål fra oven til højre lår af musen. Hvis nålen er indsat fra venstre side, kunne det nemt punktere enten maven, forårsager mælk til at flyde ind i bughulen, eller milten, forårsager blødning. (vi) fordi den abdominale væg i neonatal mus er tynde, kan drug lækage forebygges ved diagonalt fremrykkende nål med en 15° vinkel tæt på bugvæggen at nå frem til den nederste kant af leveren.
Vi har observeret den opmuntrende effekt af AgNPs i denne RRV-induceret mus BA model. Sammen med tidligere undersøgelser, der anvendte AgNPs i behandlinger af varierende virusinfektioner og sygdomme, antyder disse AgNP data muligheden af en in vivo application i anti-virus infektioner. Begrænsning af disse eksperimenter er at farmakokinetik af AgNPs ikke er helt klar på grund af manglende målemetoder for AgNPs, hvilket vanskeliggør kontrol med AgNP doser. Yderligere undersøgelse er også nødvendig for den intracellulære mål af AgNPs, som vil hjælpe os med at forstå mekanismen og reducere bivirkninger i fremtidige sygdom behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
AgNPs bruges her var en gave fra C. M. Che i Department of Chemistry, University of Hong Kong. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (nr. 81600399), videnskab og teknologi projekt i Guangzhou (No.201707010014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
