Summary
इस लेख में विस्तार से एक प्रयोगात्मक पित्त अविवरता माउस मॉडल में पित्त अविवरता सिंड्रोम उंनति के लिए चांदी नैनोकणों पर आधारित विधि का वर्णन । एजेंट तैयारी की प्रक्रिया की एक ठोस समझ और नवजात माउस इंजेक्शन तकनीक में मदद मिलेगी नवजात माउस मॉडल अध्ययन में इस्तेमाल किया विधि के साथ शोधकर्ताओं परिचित ।
Abstract
पित्त अविवरता (BA) पित्तवाहिनीशोथ के बच्चों में उच्च मृत्यु दर के साथ एक गंभीर प्रकार है, जो एटियलजि अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं है । वायरल संक्रमण एक संभावित कारण हो सकता है । ठेठ पशु मॉडल बीए की पढ़ाई के लिए इस्तेमाल किया inoculating द्वारा एक रीसस रोटावायरस के साथ एक नवजात चूहे की स्थापना की है । चांदी नैनोकणों जीवाणुरोधी और एंटीवायरल प्रभाव डालती दिखाया गया है; इस अध्ययन में बीए माउस मॉडल में उनके समारोह का मूल्यांकन किया जाता है । वर्तमान में, बीए पशु प्रयोगों में, बीए चूहों के लक्षणों में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों आम तौर पर रोगसूचक भोजन या अन्य दवाओं के माध्यम से दिया उपचार कर रहे हैं. इस अध्ययन का उद्देश्य सिल्वर नैनोकणों के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों में बीए सिंड्रोम की उन्नति के लिए एक नई विधि का प्रदर्शन करना और सिल्वर nanoparticle जेल तैयार करने की तैयारी के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करना है । इस विधि सरल और व्यापक रूप से लागू है और बीए के तंत्र अनुसंधान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही नैदानिक उपचार में. बीए माउस मॉडल के आधार पर, जब चूहों पीलिया प्रदर्शन, तैयार सिल्वर nanoparticle जेल निचले जिगर की सतह के लिए intraperitoneally इंजेक्शन है । अस्तित्व की स्थिति को मनाया जाता है, और जैव रासायनिक संकेतकों और यकृत histopathology की जांच कर रहे हैं । इस विधि को बीए मॉडल और उपंयास बा उपचार की स्थापना दोनों की एक अधिक सहज समझ की अनुमति देता है ।
Introduction
बीए लगातार पीलिया की विशेषता cholestasis का एक रूप है और यकृत प्रत्यारोपण के अभाव में उच्च मृत्यु दर है । वायरल संक्रमण बीए के रोगजनन के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं । cytomegalovirus, reovirus, और रोटावायरस सभी को बीए1,2,3में रोगजनकों के रूप में सुझाए गए हैं । नवजात अवधि के दौरान, अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया प्रतिरक्षा dysregulation में एक वायरल संक्रमण के परिणाम के लिए अतिरिक्त और intrahepatic पित्त नलिकाओं, पित्त उपकला कोशिका apoptosis के लिए अग्रणी, पोर्टल में भड़काऊ सेल घुसपैठ क्षेत्र, intrahepatic और extrahepatic पित्त नली रुकावट, और अंत में, जिगर फाइब्रोसिस4,5,6।
बीए अध्ययन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जानवर मॉडल रीसस रोटावायरस (RRV) के साथ एक नवजात चूहे की टीका शामिल है । माउस आमतौर पर 5-6 दिनों के बाद पीलिया विकसित, एक कम शरीर के वजन और acholic मल दिखा । रोग की प्रक्रिया में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की भूमिका महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं के लिए; विरोधी NKG2D एंटीबॉडी के साथ इन कोशिकाओं की कमी बहुत बीए प्रेरित नुकसान7कम कर देता है । इसके अलावा, CD4+ टी कोशिकाओं, सीडी 8+ टी कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं, और विनियामक टी कोशिकाओं सहित अन्य कोशिकाओं, सभी रोग में भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है8,9,10,11. सभी डेटा बीए के पाठ्यक्रम में प्रतिरक्षा प्रणाली की अपरिहार्य प्रकृति का सुझाव देते हैं ।
चांदी नैनोकणों (AgNPs) के जीवाणु संक्रमण12 और वायरल संक्रमण13,14,15सहित कुछ संक्रामक रोगों के खिलाफ लाभकारी प्रभाव है करने के लिए प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, dermatological उपयोग के अलावा, कुछ अध्ययनों AgNPs एक नैदानिक उपचार में इस्तेमाल किया है, क्योंकि उनके संभावित विषाक्तता के ज्यादातर । पशु प्रयोगों में, शोधकर्ताओं ने आम तौर पर मौखिक16 या नसों17तरीकों के माध्यम से प्रशासित AgNPs की प्रभावकारिता का अध्ययन किया है । हालांकि, कोई अंय शोधकर्ताओं ने नवजात माउस प्रयोगों में एक intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित AgNPs की प्रभावकारिता का अध्ययन किया है, जो एक सरल और तेजी से जिगर और पित्त नलिकाओं पर एक और अधिक सीधा प्रभाव के लिए अग्रणी विधि है, जबकि इस तरह के प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में अन्य प्रणालियों के लिए विषाक्तता को कम करने. AgNPs NK सेल गतिविधि को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है18; इसलिए, हम AgNPs के उपचारात्मक प्रभाव का परीक्षण किया बीए माउस मॉडल में आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित ।
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Protocol
सभी पशु प्रायोगिक प्रोटोकॉल सूर्य यत्-सेन विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु केंद्र (#IACUC-DB-16-0602) के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. पित्त अविवरता माउस मॉडल की स्थापना
- autoclaved चाउ विज्ञापन libitumके लिए उपयोग के साथ, 25 डिग्री सेल्सियस पर एक 12 ज अंधेरे/प्रकाश चक्र के तहत एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त वातावरण में गर्भवती बालब/
- RRV तनाव MMU १८००६ तैयार करने के लिए, MA104 कोशिकाओं में वायरस बढ़ाना और एक पट्टिका परख19द्वारा वायरल titers उपाय ।
नोट: MA104 कोशिकाओं है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ एक मशीन में एक humidified 5% सह2युक्त वातावरण के साथ में संस्कृति रहे हैं । प्रवर्धन चरणों संक्षेप में नीचे उल्लिखित हैं ।- संक्रमित MA104 कोशिकाओं (१.५ x 107) एक १५० सेमी2 संस्कृति कुप्पी में trypsin-सक्रिय RRV के साथ [१.५ x 106 पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU)] सीरम मुक्त माध्यम के 30 मिलीलीटर में । 5% CO2के साथ ३७ ° c में एक humidified मशीन में 3 दिनों के लिए संक्रमित कोशिकाओं की मशीन ।
- लाइसे तीन फ्रीज और गल चक्र द्वारा संस्कृति कुप्पी में संक्रमित कोशिकाओं को एक-८० ° c प्रत्येक फ्रीज चरण के लिए फ्रीजर में और, फिर, कोशिकाओं के कमरे के तापमान को वापस गल; सेल से जुड़े वायरस कण supernatant में जारी करेंगे । फिर, इकट्ठा और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल lysate और संस्कृति supernatant हस्तांतरण ।
- lysate से कम गति से बड़े सेलुलर मलबे को निकालें (4 ° c पर ३०० x g 3 मिनट के लिए) । फिर, supernatant वायरस युक्त हस्तांतरण (लगभग 6 मिलीलीटर) एक नया 15 मिलीलीटर में पशु प्रयोगों के लिए शंकु ट्यूब ।
नोट: RRV तो titered, aliquoted, और संग्रहीत या प्रवर्धन के अतिरिक्त दौर के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है । कमरे के तापमान के लिए दीर्घकालिक जोखिम वायरल संक्रमण की क्षमता कम हो जाएगा; वायरस बर्फ पर रखा जाना चाहिए और-८० डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन में संग्रहित ।
- एक छोटी मात्रा में RRV लोड (1 मिलीलीटर) नवजात माउस इंजेक्शन के लिए एक 29 जी सुई के साथ इंसुलिन सिरिंज.
नोट: volumetric सीरिंज की मोटी सुई आसानी से ड्रग रिसाव का कारण बन जाती है । - जंम के 24 ज के भीतर, आईएफसआई मार्ग के माध्यम से १.२ x 105 PFU/एमएल RRV के प्रत्येक neonate 20 µ एल के लिए प्रशासन; नियंत्रण के रूप में खारा की एक ही मात्रा का उपयोग करें ।
नोट: इस प्रयोग में इस्तेमाल सिरिंज एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज है. संक्रमित चूहों कि उनकी माताओं द्वारा खिलाया नहीं गया पहले 2 अंय कारणों की वजह से दिन के भीतर मर गया विश्लेषण में शामिल नहीं थे । - सभी नवजात चूहों बारीकी से निरीक्षण और उन्हें दैनिक वजन । सामान्यतया, छठे दिन RRV टीका के बाद, कान और नंगे त्वचा पर पीलिया दिखाई देता है, मल मिट्टी के रंग का हो जाता है, और फर तेल बन जाता है, बीए मॉडल की स्थापना का सुझाव; इन लक्षणों के लिए जांच करें ।
नोट: बीए एच एंड ई और immunohistochemical कहा के साथ एक जिगर ऊतक अनुभाग परीक्षा द्वारा पुष्टि की जा सकती है । बा चूहे तो AgNP इलाज के लिए तैयार हैं.
चेतावनी: प्रस्तुत प्रोटोकॉल समकालीन पशु और मानव RV उपभेदों, जो कि 2 (बीएसएल-2) शर्तों के तहत संचालित किया जाना चाहिए के साथ प्रयोग के लिए है ।
2. सिल्वर Nanoparticle संश्लेषण
- पहले वर्णित12,20के रूप में AgNPs को तैयार और चिह्नित करें ।
नोट: तैयार करने और निस्र्पक के विवरण AgNPs के रसायन विज्ञान विभाग में सी. एम. चे की टीम द्वारा प्रकाशनों में वर्णित किया गया है, हांगकांग विश्वविद्यालय के12,20। समाधान के अंतिम एकाग्रता 1 मिमी थी । AgNPs का मतलब व्यास 10 एनएम था (5 से 15 एनएम को लेकर) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की पुष्टि की ।
3. सिल्वर Nanoparticle कोलेजन मिश्रण की तैयारी
नोट: AgNP कोलेजन मिश्रण तैयार है और विशेषता के रूप में पहले वर्णित21 और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । सभी प्रक्रियाओं बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
- कोलेजन तैयार करने के लिए सबसे पहले, प्रकार के ४९० µ एल जोड़ें मैं कोलेजन (4 मिलीग्राम/एमएल) एक १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए और यह बर्फ पर जगह है ।
- फॉस्फेट के १०० µ एल जोड़ें-खारा के लिए (पंजाबियों, 10x) बफर और यह एक पिपेट के साथ मिश्रण ।
- 10x पंजाबियों बफर के 1 एल तैयार करने के लिए, NaCl के ८० जी, KCl के 2 जी, और ना2HPO4के ३५.८ जी गठबंधन। 12घं2O से २.४ ग्राम के KH2पो4 और कमरे के तापमान पर बफर स्टोर ।
- उसके बाद, उपरोक्त समाधान करने के लिए NaOH (०.२ M) के 10 µ l जोड़ें ।
- ०.२ मीटर NaOH तैयार करने के लिए, आसुत जल के 8 ग्राम NaOH पाउडर 1 L के लिए जोड़ें ।
- अंत में, AgNPs के ४०० µ एल जोड़ें (1 मिमी) कोलेजन के लिए और उंहें एक पिपेट के साथ मिश्रण ।
नोट: एक भी मिश्रण के लिए पिछले AgNPs जोड़ें । AgNP कोलेजन मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए; अंयथा, यह आसानी से कमरे के तापमान पर जम जाता है ।
4. माउस इंजेक्शन विधि
- प्रशासन RRV समूह में संक्रमित नवजात चूहों पीलिया की उपस्थिति के बाद AgNP कोलेजन मिश्रण के ५० µ एल का एक आईएफसआई इंजेक्शन के साथ; एक दूसरा इंजेक्शन 3 डी बाद में निष्पादित करें ।
नोट: कंट्रोल RRV (संक्रमित नियंत्रण) समूह में चूहों को खारा का ही आयतन दिया जाता है, और सामान्य नियंत्रण समूह में चूहों को कोई उपचार नहीं दिया जाता. - इंजेक्शन की शुरुआत में, अंगूठी उंगली के साथ सही जांघ पर परोक्ष रूप से माउस के पैर प्रेस, और एक 15 ° कोण (चित्रा 1) में सुई धीरे से परिचय । जिगर के निचले किनारे की सतह तक पहुँचने पर (चित्रा 2), के बारे में ०.५ सेमी में, AgNP कोलेजन मिश्रण इंजेक्षन; फिर, सुई धीरे से वापस ले ।
नोट: के रूप में सिरिंज में किसी भी हवा का परिचय नहीं सावधान रहना, तो, नवजात माउस को मार डाला जा सकता है. नवजात चूहों में पेट और तिल्ली के बाएं पेट में होता है, और पेट में दूध भरा होता है । इंजेक्शन इस तरफ से प्रशासित किया जाता है, तो सुई आसानी से या तो पेट में प्रवेश कर सकता है, दूध उदर गुहा, या तिल्ली में प्रवाह करने के लिए, जिससे खून बह रहा है ।
चेतावनी: किसी भी उंगली चोटों को रोकने के लिए सुई पर ध्यान देना, और सुई टोपी की जगह सुनिश्चित हो, सुई को हटाने, और यह एक sharps कंटेनर में जगह है । - सभी इंजेक्शन के बाद, चूहों को 10 मिनट के लिए अपने पिंजरों से बाहर रखने के लिए AgNP कोलेजन मिश्रण जेल के लिए अनुमति देने के लिए और इंजेक्शन साइट चाट से मां को रोकने के लिए । फिर, चूहों उनके पिंजरों को वापस ।
- निरीक्षण और सभी चूहों दैनिक, पीलिया और शरीर के वजन सहित, साथ ही जीवित रहने की दर के भौतिक छपने रिकॉर्ड ।
5. रक्त नमूना संग्रह
नोट: हृदय में सुई डालने से लगभग १२० µ एल के रक्त के नमूने एकत्र किए जाते हैं । केंद्रापसारक के बाद, सीरम (लगभग ७० µ एल) जिगर समारोह परीक्षण के लिए एकत्र की है । रक्त संग्रह विधि इस प्रकार है ।
- Anesthetize पर चूहों को नौवें और 12वें दिन के बाद RRV टीका (जो कि AgNP उपचार के 3 दिन बाद) 0.5-2.5% sevoflurane का प्रयोग करते हैं ।
- माउस के अंगों को स्थिर और ७५% अल्कोहल के साथ ऊपरी और निचले पेट निष्फल ।
- midline के साथ असिरूप को कैंची के साथ माउस त्वचा, मांसपेशी, और आँख काटने से डायाफ्राम बेनकाब; पूरी तरह से डायाफ्राम मांसपेशी बेनकाब करने के लिए जठरांत्र संबंधी मार्ग को हटाने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें ।
- (एक 1 मिलीलीटर उतारा इंसुलिन सिरिंज के साथ) सुई डालें दिल की बाईं निलय में और धीरे से अधिकतम रक्त मात्रा प्राप्त करने के लिए सिरिंज गोताख़ोर वापस खींच. फिर, रक्त एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
- अनुमति ट्यूब कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए खड़े करने के लिए और 5 मिनट के लिए यह ४०० x gपर केंद्रापसारक फिर, एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर, इकट्ठा करने और आगे उपयोग के लिए सीरम बचाने के लिए ।
नोट: डायाफ्राम हानिकारक के रूप में डायाफ्राम दोष आसानी से वातिलवक्ष, मौत, और रक्त जमावट, जिससे रक्त का नमूना संग्रह को रोकने के लिए नेतृत्व करने से बचें ।
6. जैव रासायनिक पैरामीटर का पता लगाने
- एक जैव रासायनिक पैरामीटर का पता लगाने के लिए चरण ५.५ में एकत्रित सीरम का उपयोग करें ।
- निम्नलिखित जैव रासायनिक मापदंडों का पता लगाने के लिए एक स्वचालित जैव रासायनिक विश्लेषक का उपयोग करें: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), क्षारीय फॉस्फेट (ALP), कुल प्रोटीन (टी. पी.), एल्ब्युमिन (ALB), globulin (GLO), कुल बिलीरुबिन (टिबिल), प्रत्यक्ष बिलीरुबिन (DBIL), अप्रत्यक्ष बिलीरुबिन (IBIL), और कुल पित्त अम्ल (टीबीए).
7. Extrahepatic Cholangiography Extrahepatic पित्त वाहिनी प्रत्यक्षता का निरीक्षण करने के लिए
नोट: एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पूरी प्रक्रिया करते हैं ।
- पूरी तरह से जिगर, पित्ताशय की थैली, और एक कपास झाड़ू के साथ extrahepatic पित्त नलिकाएं बेनकाब ।
- निरीक्षण और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जिगर और पित्त नलिकाओं की उपस्थिति तस्वीर ।
- पित्ताशय की थैली के नीचे धीरे से पकड़ करने के लिए नेत्र संदंश का प्रयोग करें ।
- methylene ब्लू समाधान के साथ एक 1 एमएल सिरिंज लोड (०.०५ wt.% में एच2ओ). पित्ताशय की थैली गुहा में धीरे से सिरिंज सुई डालें; फिर, नेत्र संदंश के साथ सुई समझ, और धीरे से 10-20 µ एल methylene नीले रंग की ।
- एक खुर्दबीन के नीचे निरीक्षण करें कि नीले रंग jejunum को extrahepatic पित्त नलिकाओं के माध्यम से गुजरता है और एक तस्वीर ले लो ।
8. Hematoxylin और Eosin धुंधला के लिए ताजा जिगर के नमूनों का संग्रह
- 10% formalin में रातोंरात ताजा माउस जिगर के ऊतकों को ठीक करें ।
- फिर, तेल में फिक्स्ड जिगर के ऊतकों को एंबेड और उंहें अनुभाग ।
- Dewax वर्गों, उंहें एक इथेनॉल श्रृंखला के साथ rehydrat (जैसे १००%, ९५%, ८०%, और आसुत जल में ७०% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए प्रत्येक), hematoxylin के साथ ऊतक वर्गों दाग, उंहें एक 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड शराब भेदभाव के अधीन है, और अंत में, दाग eosin के साथ वर्गों ।
- अंत में, एक 40X माइक्रोस्कोप के तहत जिगर की histopathology का निरीक्षण ।
9. Hematoxylin और Eosin-सना हुआ ऊतक वर्गों के Immunohistochemical धुंधला
- Tris-EDTA बफ़र (10 mm Tris बेस, 1 mm EDTA समाधान; pH ९.०) में अनुभागों को मर्ज करके और उंहें एक माइक्रोवेव में ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए हीटिंग द्वारा एक antigen पुनर्प्राप्ति करने के बाद, वर्गों को निर्जलीकरण और rehydratिंग ।
- एक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के लिए 10 मिनट के लिए ऊतक वर्गों को उजागर करके अंतर्जात peroxidase निकालें ।
- 5% बकरी सीरम के साथ वर्गों का इलाज, विशिष्ट बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए.
- प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश-माउस NKG2D (1:100) वर्गों के लिए जोड़ें, और उन्हें रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी (एचआरपी-लेबल बहुलक विरोधी खरगोश प्रणाली) के साथ वर्गों की मशीन ।
- immunohistochemical धुंधला 3 का उपयोग कर, 3 '-diaminobenzidine (chromogen के रूप में ढाब) कल्पना ।
- एक 40X माइक्रोस्कोप के तहत वर्गों का निरीक्षण, छवियों को प्राप्त, और उन्हें वांछित के रूप में विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ना.
10. फ्लो Cytometric एनालिसिस
- धीरे जिगर ऊतक कीमा, यह एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से गुजारें, और 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २७० x g पर यह 2x केंद्रापसारक ।
- RPMI १६४० मध्यम में सेल गोली resuspend और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर दो रंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा यह विश्लेषण ।
- fluorescein isothiocyanate-और phycoerythrin-संयुग्मित एंटी-NKp46 (NK लिम्फोसाइटों; 1:1000) और एंटी-CD4 (टी-सेल उपप्रकार; 1:1000), प्रवाह cytometer के साथ और डेटा का विश्लेषण सहित विशिष्ट कक्ष-सरफ़ेस मार्कर का उपयोग करके सेल्युलर phenotyping निष्पादित करें प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ ।
- चुनें सेल आबादी आगे/साइड स्कैटर के अनुसार, गेट किसी भी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खाते में isotype नियंत्रण के अनुसार, और व्यक्तिगत एंटीबॉडी से प्रतिदीप्ति संकेतों के आधार पर एक माध्यमिक विश्लेषण करने के लिए डेटा विषय.
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Representative Results
स्थापित बीए माउस मॉडल के आधार पर, संक्रमित नवजात चूहों पीलिया प्रदर्शन के बाद तैयार AgNP कोलेजन मिश्रण 2x के एक आईएफसआई इंजेक्शन प्रशासित रहे थे । माउस अस्तित्व के लिए दैनिक जांच की थी, और जिगर समारोह परीक्षण, जिगर पैथोलॉजी, और प्रवाह cytometry प्रदर्शन किया गया । अनुपचारित नियंत्रण बीए चूहों की तुलना में, AgNP इलाज चूहों कम पीलिया दिखाया और उनके सामान्य शरीर के वजन बनाए रखा (चित्रा 3). बिलीरुबिन चयापचय और यकृत transaminase के स्तर सामांय नियंत्रण मूल्यों को गिरा दिया, सुझाव है कि AgNPs बहुत जिगर समारोह में सुधार (तालिका 1) । methylene नीले दाग के साथ Extrahepatic cholangiography (चित्रा 4) AgNP उपचार के बाद पित्त नली प्रत्यक्षता की पुष्टि की । एच एंड ई धुंधला (चित्रा 5) AgNPs के साथ इलाज चूहों के यकृत पोर्टल क्षेत्र में काफी कम भड़काऊ सेल घुसपैठ दिखाया, नियंत्रण चूहों की तुलना में. प्रवाह cytometry परिणाम RRV चूहों (चित्रा 6) की तुलना में AgNP उपचार (दोनों दिनों 9 और 12 पर) के बाद जिगर में काफी कम NK कोशिकाओं को दिखाया । Immunohistochemical धुंधला NK सेल मार्कर NKG2D के एक काफी कम अभिव्यक्ति का पता चला (चित्रा 7) पोर्टल में AgNP-इलाज चूहों के त्रय, RRV चूहों की तुलना में.
चित्रा 1: प्रारंभिक सिरिंज प्रवेश की स्थिति. लाल बिंदीदार रेखा P6 नवजात चूहे के पेट के समानांतर लाइन को इंगित करता है; पीला तीर सुई बिंदु इंगित करता है; लाल तीर सुई कोण इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: सुई जिगर के निचले किनारे की सतह तक पहुँचने. पीली डॉटेड रेखा किसी माउस जिगर के निचले किनारे को इंगित करती है; लाल तीर इंजेक्शन के दौरान सुई की स्थिति को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: बीए सिंड्रोम पर AgNPs का एक प्रयोगात्मक बीए माउस मॉडल में प्रभाव । (क) यह पैनल RRV के साथ एक इंजेक्शन के बाद 9 और 12 दिनों पर नवजात चूहों की उपस्थिति अकेले और 3 दिन और 6 दिनों के बाद AgNPs (RRV + AgNPs) के साथ एक इंजेक्शन से पता चलता है. (ख) यह पैनल विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक समूह में चूहों का वजन दिखाता है; x-अक्ष माउस के पैदा होने के बाद के दिनों की संख्या को इंगित करता है और y-अक्ष शरीर के वजन में गुना-परिवर्तन को इंगित करता है । * *P < ०.०१ विद्यार्थी के t-परीक्षण के साथ RRV नियंत्रण समूह के लिए RRV + AgNp समूह की तुलना; n = 16 में नियंत्रण समूह, n = 18 RRV समूह में, और n = 17 RRV + AgNP समूह में है । (ग) यह पैनल प्रत्येक समूह में चूहों के जीवित रहने की दर को दिखाता है. इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 18. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा ४: Extrahepatic cholangiography. एक विपरीत एजेंट extrahepatic पित्त नलिकाओं के प्रत्यक्षता का पता लगाने के लिए और छवियों को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ब्लू बिंदीदार रेखा extrahepatic पित्त नलिका की दिशा को इंगित करता है; लाल तीर आम पित्त नलिका का संकुचन इंगित करता है; काला तीर बताता है बा. स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: एच और ई धुंधला । 9 और 12 दिनों पर प्रत्येक समूह में चूहों के जिगर ऊतक एकत्र किए गए, तय, खोदी, और एच एंड ई. संक्षिप्त के साथ दाग: PV = पोर्टल नस, BD = पित्त नलिका । स्केल बार = ५० µm । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 18. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: जिगर ऊतक में NK कोशिकाओं का प्रतिशत. (क) चूहों के यकृत को ९ और १२ दिनों पर कोशिका निलंबन में संसाधित किया गया था और NK कोशिकाओं के अनुपात को फ्लो cytometry द्वारा पाया गया था. (ख) यह पैनल AgNP इंजेक्शन के बाद भिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक समूह में NK कोशिकाओं (NKp46+CD4+) का प्रतिशत दिखाता है. y-अक्ष, NK कक्षों के प्रतिशत में फ़ोल्ड-परिवर्तन को इंगित करता है, जिसे दिन 9 और दिन 12 पर नियंत्रण समूह के प्रतिशत के सापेक्ष परिकलित किया गया था. * *p < ०.०१ और *p < ०.०५, जिसकी तुलना विद्यार्थी के t-परीक्षण के साथ RRV + AgNp समूह RRV नियंत्रण समूह के लिए, n = 10 प्रत्येक समूह में । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 18. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: प्रत्येक उपचार समूह में चूहों के पोर्टल क्षेत्र में NK सेल मार्कर NKG2D के लिए Immunohistochemical दाग. प्रत्येक उपचार समूह में चूहों के पोर्टल क्षेत्र में NK सेल मार्कर NKG2D की अभिव्यक्ति immunohistochemical धुंधलान द्वारा पाई गई. लंबे तीर पित्त नलिकाओं से संकेत मिलता है; छोटे तीर NK कक्षों को इंगित करते हैं । संक्षिप्त: PV: पोर्टल नस, BD: पित्त नलिका । Sscale बार = ५० µm. इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 18. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 1: जिगर समारोह से संबंधित अणु सीरम के स्तर के नैदानिक प्रयोगशाला परीक्षा । परिधीय रक्त प्रत्येक समूह में चूहों में जिगर समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ALT: alanine aminotransferase, AST: aspartate aminotransferase, ALP: क्षारीय फॉस्फेट, टी. पी.: कुल प्रोटीन, ALB: एल्ब्युमिन, GLO: globulin, टिबिल: कुल बिलीरुबिन, DBIL: प्रत्यक्ष बिलीरुबिन, IBIL: अप्रत्यक्ष बिलीरुबिन, और टीबीए = कुल पित्त अम्ल. *p < ०.०५ और * *p < ०.०१, प्रत्येक समूह में RRV अलोन समूह की तुलना में प्रत्येक पलटन के लिए विद्यार्थी के t-परीक्षण के साथ, n = 10. सभी जैव रासायनिक संकेतक डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं । तीनों समूहों में सभी चूहे 12 दिन पुराने थे । इस तालिका को झांग एट अल से संशोधित किया गया है. 18. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
AgNPs शक्तिशाली व्यापक स्पेक्ट्रम जीवाणुरोधी गुण और एक मजबूत पारगम्यता22प्रदर्शन; इसके अतिरिक्त, वे जीवाणुरोधी चिकित्सा उत्पादों की एक श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है23. हालांकि, AgNPs एक बार वे अंगों में संचित स्पष्ट करने के लिए एक लंबा समय लग सकता है, और इस हठ विषाक्त प्रभाव24,25के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक पिछले अध्ययन एक चूहे प्रयोग में एक i.v. इंजेक्शन के बाद तीव्र विषाक्तता और AgNPs के genotoxicity की जांच की, और परिणाम से पता चला कि AgNPs तीव्र जिगर और गुर्दे की क्षति का कारण बन सकता है । AgNPs मुख्य प्रतिरक्षा प्रणाली अंगों में संचित, थाइमस और तिल्ली17सहित. इस माउस बीए मॉडल में, AgNPs उन्नत बीए सिंड्रोम, जो हमारे डेटा का सुझाव आंशिक रूप से NK सेल निषेध द्वारा मध्यस्थता है के साथ इलाज. हालांकि, AgNPs के दीर्घकालिक प्रभाव एक और जांच की आवश्यकता होती है, के लिए माउस विकास और प्रतिरक्षा विनियमन के लिए संभावित विषाक्तता का आकलन ।
विधि के संदर्भ में, एक सफल शल्य चिकित्सा के लिए कुछ अतिरिक्त नोट निंनानुसार हैं: (i) AgNP कोलेजन मिश्रण तैयार करने की प्रक्रिया बर्फ पर किया जाना चाहिए, क्योंकि कमरे के तापमान पर, AgNP कोलेजन मिश्रण जल्दी से एक अर्द्ध ठोस जेल बन जाएगा, जो इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । तैयारी के बाद, AgNP कोलेजन मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । (२) छोटे व्यास की वजह से केवल १ मिलीलीटर इंसुलिन सीरिंज का प्रयोग करना चाहिए, जिससे इंजेक्शन की दवा का रिसाव कम हो जाता है. (iii) पिछले अध्ययनों से आम तौर पर मौखिक रूप से16 प्रशासित AgNPs के प्रभाव की जांच की है या नसों में इंजेक्शन17के माध्यम से । हमारे पशु प्रयोगों में, प्रयोगात्मक विषयों नवजात चूहों हैं; इस प्रकार, नसों में इंजेक्शन लगभग असंभव है, और हम एक आईएफसआई इंजेक्शन का इस्तेमाल किया । AgNPs के इंजेक्शन ने चूहों में बीए के लक्षणों में सुधार किया । (iv) इंजेक्शन की शुरुआत में, माउस के निचले अंग हाथ से तय होते हैं जिससे माउस को हिलने से रोका जा सके । इस विधि यह सुनिश्चित करता है कि दवा की सही मात्रा में किसी भी रिसाव के बिना उदर गुहा में इंजेक्ट किया जाता है और आगे प्रयोग की प्रभावकारिता की गारंटी देता है । (v) नवजात चूहों में पेट और तिल्ली के बाएं पेट में, और पेट में दूध भरा होता है । AgNP मिश्रण को लिवर के निचले किनारे की सतह पर इंजेक्ट करने के लिए, सुई को माउस की दाहिनी जांघ के ऊपर से डाला जाता है । यदि सुई बाईं ओर से डाला जाता है, यह आसानी से या तो पेट पंचर हो सकता है, दूध के कारण उदर गुहा, या तिल्ली में प्रवाह करने के लिए, रक्तस्राव के कारण. (vi) क्योंकि नवजात चूहों में उदर की दीवार पतली है, नशीली दवाओं के रिसाव से रोका जा सकता है तिरछे पेट की दीवार के पास एक 15 ° कोण पर सुई को आगे बढ़ाने के लिए जिगर के निचले किनारे तक पहुंचने ।
हम इस RRV-प्रेरित माउस बीए मॉडल में AgNPs के उत्साहजनक प्रभाव मनाया है । वायरस के संक्रमण और रोगों के उपचार में AgNPs इस्तेमाल किया है कि पिछले अध्ययनों के साथ साथ, इन AgNP डेटा एंटी वायरस संक्रमण में vivo आवेदन में एक की संभावना का सुझाव. इन प्रयोगों की सीमा यह है कि AgNPs के लिए माप विधियों की कमी के कारण AgNPs का फार्माकोकाइनेटिक्स पूर्णतः स्पष्ट नहीं हो पाता है, जिससे AgNP खुराकों का नियंत्रण कठिन हो जाता है. आगे का अध्ययन AgNPs के intracellular लक्ष्य के लिए भी जरूरी है, जो हमें तंत्र को समझने और भविष्य में रोग उपचार में दुष्प्रभावों को कम करने में मदद करेगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यहां AgNPs का इस्तेमाल हांगकांग विश्वविद्यालय के रसायन विज्ञान विभाग में सी. एम. आई. से उपहार में किया गया । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया चीन (no. ८१६००३९९) और गुआंगज़ौ के विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (no. 201707010014) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
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| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
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