Summary
Denne protokol beskriver en effektiv metode til udvinding og kvantificering af koffein i celle suspensioner af C. arabica L. og en eksperimenterende proces for at vurdere den enzymatiske aktivitet af koffein syntase med udtryk niveau af det gen, der koder dette enzym.
Abstract
Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) er en purin alkaloid i populære drikkevarer som kaffe og te. Denne sekundære metabolit betragtes som en kemisk forsvar, fordi det har antimikrobiel aktivitet og betragtes som en naturlig insektgift. Koffein kan også producere negative allelopathic effekter, der forhindrer vækst af omgivende planter. Derudover indtager mennesker verden koffein for sin smertestillende og stimulerende effekter. På grund af interesse i de teknologiske anvendelser af koffein, er forskning i de biosyntetiske pathway af dette stof vokset. Disse undersøgelser har primært fokuseret på at forstå de biokemiske og molekylære mekanismer, der regulerer biosyntesen af koffein. In vitro vævskultur er blevet et nyttigt system til at studere denne biosyntetiske pathway. Denne artikel vil beskrive en trinvis protokol for kvantificering af koffein og til måling af udskrift niveauer af genet (CCS1) kodning koffein syntase (CS) i celle suspensioner af C. arabica L. samt dets aktivitet.
Introduction
Koffein er en sekundær metabolit, der er biosynthesized af planter af slægten Coffea1. Denne alkaloid tilhører familien Methylxanthin og betragtes som en kemisk fabrik forsvar, fordi det kan handle mod de skadelige virkninger af patogener og planteædere2,3. Derudover er denne metabolit ansvarlig for de stimulerende egenskaber af kaffe-drikke, som er almindeligt indtaget verden over4,5. På grund af dets egenskaber, er flere forskningsgrupper interesseret i at studere de biosyntetiske pathway og katabolisme af koffein6,7. I øjeblikket, tjene plante i vitro celle/vævskulturer som et alternativ til evaluering af koffein akkumulering under forskellige biotiske og abiotiske strategier8,9.
Koffein biosyntesen indebærer hydrolytisk udgivelsen af 7-Methylxanthin fra den tilsvarende ribose nucleoside efterfulgt af bestilte N-methylations på holdninger, 3 og 1. En specifik S- adenosylmetionin methionin (SAM)-afhængige N-methyltransferase (NMT) katalyserer methylering på position 7, hvorimod theobromin syntase (TS) og CS er involveret i 3 - og 1-methylations, henholdsvis producerer theobromin og koffein. Studiet af gener kodning særskilte NMTs har gjort det muligt at forstå den mekanisme, der regulerer koffein produktion10,11. CS, der har N -methyltransferase aktivitet, katalyserer de sidste to trin i de biosyntetiske pathway af koffein11. I kaffe træ kimplanter, har det vist sig at lys-stråling kan øge CS aktivitet, hvilket resulterer i en forhøjelse af koffein biosyntesen. For nylig, viste vi, at opretholdelsen af celle suspensioner af C. arabica L. under lys bestråling er den optimale betingelse for vurdering af de virkninger, der producerer abiotisk stressfaktorer påvirker de biosyntetiske pathway af koffein8. Oplysningerne i disse undersøgelser kan have programmer i metaboliske engineering og systemer biologi til at maksimere studiet af koffein biosyntetiske pathway i sådanne in vitro- systemer.
Da fordelene ved at opnå en passende model for studiet af koffein biosyntesen, optimeret vi udvinding betingelserne for koffein på celle suspensioner af C. arabica L. Det var også muligt at udvikle en nyttig protokol for at studere den enzymatiske aktivitet samt metodiske fremgangsmåde for at vurdere niveauet af genet udskrifter af Coffea koffein syntase 1 (CCS1) kodning dette enzym. Heri, rapporterer vi en protokol til at udtrække og kvantificere koffein i C. arabica celle suspensioner ved tyndtlagskromatografi og densitometri (TLC-densitometri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koffein udvinding i celle suspensioner af C. arabica L.
- Bruge C. arabica celle suspensioner9. Vedligeholde suspensioner af hver anden uge subkulturer i Murashige og Skoog medium på pH 4.3 med konstant 100 rpm ryster ved 25 ° C under kontinuerlig lys (8.3 W/m2).
- Høste celler under vakuum filtrering ved hjælp af 11 µm pore filtrerpapir og en Buchner tragt.
- Registrere den friske vægt indsamlet celler ved hjælp af en skala, pak dem ind i aluminiumsfolie, fryse dem i flydende nitrogen og holde dem ved-80 ° C indtil analyse.
- Lyophilize den frosne cellulære materiale i 72 timer.
- Registrere vægten af de frysetørrede celler for at anslå tørvægt udbytte.
- Gemme den pulveriserede materiale i genanvendelige polyethylen poser (9 cm x 7,5 cm). Udblødte materiale til et fint pulver og opbevares i en ekssikkator indtil brug.
- Måle 0,5 g cellular tørstof på den analytiske skala og føje den til et glas kolbe (25 mL).
- Der tilsættes 10 mL af acetone til de frysetørrede celler og blandes i en vortex mixer til 30 s til homogenisering. Derefter forsegle kolben med aluminiumsfolie.
- Bland ved 100 omdrejninger i minuttet ved hjælp af en rotator ved stuetemperatur (25 ° C) for 5 h.
- Overføre alle materiale til en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min. overførsel flydende fase til en ny tube og reducere den tørhed ved stuetemperatur i stinkskab.
- Resuspend prøve med 25 µL af acetone.
2. betingelserne for vurdering af koffein af tynde lag kromatografi (TLC)-densitometri
- Anvende 1 µL af den tidligere resuspenderet koffein ekstrakt til den stationære fase.
Bemærk: silicagel plader (F254) bruges som den stationære fase. Før du anvender prøverne, pladerne blev udviklet med 10 mL chloroform-methanol [9:1 v/v] i en kromatografi kammer (14 cm x 12 cm x 9,5 cm), og pladerne blev tørret ved stuetemperatur. Karakteristik af kromatografiske pladen hvor prøverne anvendes er vist i figur 1. Salen var mættet for 30 min med opløsningsmiddel før udvikle pladen. TLC plader skal håndtere bruge handsker for at undgå kontaminering. - Udvikle TLC i kromatografi mødesalen med 10 mL af den mobile fase cyklohexan-acetone [40:50 v/v].
Bemærk: Denne blanding giver adskillelse af koffein på en fastholdelse faktor (Rf) på 0,34.- Fjern TLC-pladen fra salen og lad det tørre helt ved stuetemperatur.
- Visualisere koffein bands i kort bølgelængde ultraviolet lys (UV, 254 nm). Bruge en kompakt UV-lampe. Derudover for dette trin, brug beskyttelsesbriller med UV-beskyttelse.
- Kvantificere koffein niveauer af densitometri på 273 nm. Instrumentet er kontrolleret med kromatografi software.
3. ribonukleinsyre (RNA) Isolation
- Tage celle suspensioner fra trin 1.1, og vacuum filtratet med filtrerpapir (11 µm porestørrelse).
- Indsamle de cellulære materiale fra filtrerpapir, afvejes 0,5 g cellular materiale på en Analysevægt og Pak den i alufolie. Fryse prøve med flydende N2.
- Udblødte celle prøven i en porcelæn mørtel med flydende kvælstof og tilsættes 1 mL af RNA isolering reagens indtil homogeniseret.
Bemærk: Sterilisere porcelæn morterer i en muffelovn ved 300 ° C for 6 h. RNA isolering reagens indeholder phenol, guanidin isothiocyanat og andre komponenter.- Overføre 500 µL af prøven til et sterilt microcentrifuge tube (1,5 mL). Tilsæt 300 µL chloroform-isoamyl alkohol (24:1) og 300 μL af afbalancerede phenol (pH 8.0).
- Proeven blandes med en vortex-mixer og derefter centrifugeres det ved 20.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Overføre 300 μL af den øverste fase til et microcentrifuge rør. Tilføje 200 μl af isopropanol. Inkuber røret i 1 time ved-20 ° C.
- Centrifugeres tube på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C, og derefter dekanteres den flydende fase.
- Der tilsættes 1 mL ethanol (70%) til at danne en pellet i røret. På 12.000 x g i 10 min. der centrifugeres og dekanteres. Gentag dette trin to gange.
- Tør prøve i 1,5 timer ved stuetemperatur (25 ° C). Resuspend RNA-ekstrakt med 25 μL af diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand.
Bemærk: Til RNA udvinding, bruge vand behandlet med 0,1% DEPC v/v.
4. inkubation af RNA udskrift med Deoxyribonuclease (DNase)
- Ind i en steril microcentrifuge rør, tilføje 2 µg af total RNA uddrag. Tilføj 1 μl af 10 x reaktion buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Tilsæt 1 μL af 1 U/µL DNase.
- Bringe reaktion på en endelige mængden af 10 μL med DEPC-behandlet vand. Bland prøven og centrifugeres kortvarigt på 2.000 x g i 1 min.
- Inkuber prøve ved 37 ° C i 30 min.
- Stop reaktion med tilsætning af 1 μL af 50 mM dinatrium ethylendiamintetraacetat dihydrat (Na2EDTA) og inkuberes prøve ved 65 ° C i 10 min.
- Analysere integriteten af RNA ved agarosegelelektroforese gelelektroforese.
- Forberede en standard 1%-agarosegel og bejdse det med 1 µL af 3 x intercalating nukleinsyre pletten løsning.
- Anvende 500 ng af RNA til Agarosen gel og Kør gelen.
- Visualisere integriteten af RNA ved hjælp af en gel foto dokumentationssystem.
- Brug RNA som skabelon til cDNA syntese af reverse transkriptase.
5. supplerende deoxyribonukleinsyre (cDNA) syntese
- Tilføje 2,5 μg af total RNA til et microcentrifuge rør. Tilsæt 1 μL af oligo-deoxythymine (dT) primer og fylde røret til en 13 μl endelige mængden med nukleasen-gratis vand. Proeven blandes og derefter centrifugeres en 2.000 x g i 1 minut.
- Inkuber stikprøven på 65 ° C i 5 min og derefter ved 4 ° C i 2 min.
- Tilsæt 4 μL af 5 x reaktion buffer anvendes til reverse transkriptase, 2 μl af deoxynucleotide triphosphates (dNTP'er) mix (10 mM for hver dNTP) og 1 μL af reverse transkriptase (200 U/µL). Bland forsigtigt og centrifugeres ved 2.000 x g i 1 min.
- Inkuber stikprøven ved 45 ° C i 50 min og derefter ved 70 ° C i 10 min.
- Kvantificere cDNA koncentrationen ved hjælp af Spektrofotometer UV.
- Brug cDNA som skabelon for Polymerasekædereaktionen (PCR).
Bemærk: Reaktion buffer blev brugt som 10 x (trin 4.1.1) og 5 x gange koncentreret (trin 5.3), henholdsvis.
6. real-Time kvantitativ PCR (qPCR) til at forstærke gen CCS1
- Tilføje 7,5 μL Taq DNA polymerase 2 x (0,1 U/mL) og 0,1 μm i 5-carboxy-X-rodamin (ROX) til en PCR microcentrifuge tube.
Bemærk: Hot start Taq DNA polymerase 2 x blev brugt som en løsning 2 x koncentreret.- Tilsættes 5 μl nukleasen-gratis vand.
- Tilføje 0,75 μl af 10 μM frem og bak primer til at forstærke genet CCS1 (AB086414) (frem: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' og omvendt: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Bruger primere for tubulin som hus-holder gen i en separat reaktion (frem: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' og omvendt: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- Tilføje 600 ng af cDNA skabelon.
- Udføre forstærkning reaktion ved 50 ° C for 2 min og 95 ° C i 5 min. Ruger reaktionen i real-time PCR-systemet for 40 cyklusser af 95 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s.
- Inkuber sample ved 50 ° C til 30 s og 20 ° C til 10 s.
- Analysere data med PCR-software.
- Beregne den relative udtryk af 2-ΔΔCT metode beskrevet af Livak og Schmittgen (2001)12.
Bemærk: Analysere en kontrol reaktion, der indeholder alle komponenter undtagen skabelonen DNA (ingen skabelon kontrol, NTC) at kassere forurenet reagenser eller forstærkning primer-dimerer.
7. total Protein ekstrakt af celle suspensioner af C. arabica L.
- Filter celle suspensioner under vakuum med en medium-pore filtrerpapir.
- Der afvejes 1 g af cellulære materiale og Pak den i alufolie.
- Fryse prøve med flydende kvælstof. Udblødte prøven i en steriliseret porcelæn mørtel til at få et fint pulver.
- Overføre prøven til et hætteglas og tilsættes 2,5 mL ekstraktionsbuffer (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochlorid (Tris-HCl), ved pH 8.0, som indeholder 10 mM β-mercaptoethanol, 5 mM Na2EDTA og 0,5% (w/v) natrium Ascorbat.
- Bland prøven i en vortex mixer i 2 min.
Bemærk: Det er vigtigt, at prøven opbevares på is at forhindre protein denaturering.
- Bland prøven i en vortex mixer i 2 min.
- Centrifugeres prøve på 20.000 x g i 20 min. ved 4 ° C og overføre 500 µL delprøver til kryogene hætteglas (2 mL). Gemme prøver på-72 ° C indtil brug.
- Måle proteinkoncentration i eksemplet på 562 nm i et spektrofotometer ved hjælp bicinchoninic syre assay med bovint serumalbumin som standard.
8. enzymatisk Assay for koffein syntase
- Forberede en reaktionsblanding i et microcentrifuge rør indeholdende 200 µM SAM, 4,07 kBq af methyl [3H]-SAM, 200 µM theobromin, 200 µM MgCl2og 5 µM koffein. Øge lydstyrken til 200 µL med 100 mM Tris-HCl pH 8.0.
- Holde microcentrifuge røret på isen og tilføje et bind af den vandopløselige fraktion indeholdende 7-9 mg protein. Derefter blandes ved vortex og Inkuber i 30 min. ved 30 ° C i en termostatisk badekar/cirkulationspumpe. For en batch af flere prøver, Ruger hver prøve i to eksemplarer i 1 min perioder at give tilstrækkelig tid til at stoppe Reaktionerne for alle prøver i en aftalt tidsperiode på 30 min.
- Der tilsættes 1 mL chloroform til reaktionen standses og derefter ryste prøven med en vortex-mixer. Ryst prøven ved hjælp af en vortex mixer til 3 min til at fjerne det radioaktive koffein i opløsningsmidlet.
- Centrifugeres prøver på 11.000 x g i 5 min og omhyggeligt genoprette et volumen på 900 µL. Derefter, overføre prøverne at scintillationshætteglas.
- Fordampe chloroform for at fuldføre tørhed i hood ved stuetemperatur ved 25 ° C. Der tilsættes 5 mL af scintillation væske til hætteglasset og bland prøven.
- Analysere radioaktivitet indarbejdet i koffein i en scintillation counter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koffein ekstrakter fremstillet via processen præsenteres her blev analyseret af TLC-densitometri ved at underkaste prøver at plade kromatografi ifølge den ordning, der er vist i figur 1. At kvantificere niveauerne af koffein i celle ekstrakter, en kurve med forskellige koncentrationer af kommercielle standard for dette stof blev brugt (figur 2A). Mønster af absorbansen for koffein blev analyseret i det synlige lysspektrum (UV-VIS) ved hjælp af en maksimal absorption peak på 273 nm (figur 2B) og peak adskillelse af koffein på TLC-pladen viste en Rf mellem 0,34 og 0,39 (figur 2 c).
Aktiviteten af koffein syntase evalueres ved hjælp af denne protokol er angivet en bestemt aktivitet for dette enzym af 1,2 pkat (tabel 1). Dette enzym aktivitet var den samme som rapporteret af andre forfattere, der anvendte oprenset protein.
Det første skridt før evaluering CCS1 genekspression var isolering af høj kvalitet RNA. Kvaliteten af udskriften af den samlede RNA stammer fra celle suspensioner blev evalueret, og adskillelsen af 28S, 18S og 5S rRNA underenheder blev demonstreret, der angiver, at den RNA ekstraheret fra prøver var af høj kvalitet (figur 3A). Disse RNA ekstrakter måtte imidlertid behandles med DNase enzym til at fjerne genomisk DNA forurening (figur 3B), der interfererer med fremstilling af cDNA. Efterfølgende, blev qPCR udført ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor, og resultatet af smelte kurven viste en enkelt forstærkning produkt for koffein syntase gen (figur 4).
Figur 1. Anvendte ordning for anvendelsen af koffein uddrag prøver på en TLC plade. Ordningen viser en silica plade dimension (6 x 10 cm), der bruges til at anvende op til otte prøver herunder koffein ekstrakter eller standarder. Overveje en afstand af 1 cm i TLC-pladen til at opnå bedre opløsning af koffein band adskillelse mellem prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Påvisning af koffein af TLC-densitometri i celle ekstrakter af C. arabica L. A adskillelse af forskellige koffein standard koncentrationer (lane 1, 0,4; 2, 0,6; 3, 0,8; 4, 1, 5, 1,2; og 6, 1.4 µg) og adskillelse af deres toppe i billedet til højre. B absorbans mønstre af koffein standard (lilla linje) og koffein ekstrakt (grøn linje) på forskellige bølgelængder ved hjælp af Absorptionsspektra (ultraviolet og synligt). (C) peak adskillelse af koffein i cellen uddrag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Ekstraktion af total RNA. RNA ekstrakter af cellulære suspensioner af C. arabica L. blev analyseret af elektroforese. (A) RNA udvinding, (baner 1-2 dubletter); (B) RNA prøver underkastes behandling med DNase. 1% agarosegelitris blev forberedt og farves med 3 x intercalating nukleinsyre pletten løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Smeltende kurve fremstillet ved hjælp af qPCR software og RT-qPCR data. Kurven markeret med rødt er en enkelt forstærket produkt, der svarer til koffein syntase genet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plante | Protein ekstrakt | CS specifikke aktivitet | Reference |
| Coffea | |||
| Cellesuspension | Rå | 1.2 pkat | Denne protokol |
| Frøhvide | Renset | 5.7 pkat | 12 |
| Te | |||
| Blade | Renset | 11 pkat | 13 |
| Guarana | |||
| Frø | Renset | 20 fkat | 14 |
Tabel 1. Sammenligning af CS-specifikke aktivitet i forskellige afgrøder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer her de optimale betingelser for at vurdere koffeinindholdet, CS aktivitet og udskrift niveauer i en in vitro- plante vævskultur, såsom celle suspensioner af C. arabica. Tidligere rapporter har bekræftet at opretholde celler under lys bestråling og theobromin i substratet er passende parametre til at øge niveauet for koffein, gør det muligt at evaluere metoderne koffein adskillelse Brug af omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC). I øjeblikket, er der få rapporter, der bruger en enkel og hurtig metode med økonomiske fordele for at studere koffein biosyntese i celle suspensioner. Her, en alternativ vurdering viste en adskillelse metode for koffein ved hjælp af TLC-densitometri, som er effektive til kvantitativ analyse af koffein i celle ekstrakter. For at evaluere koffein i cellerne, var det ikke nødvendigt at fodre theobromin kultur celler som rapporteret tidligere14,15.
Koffein syntase aktivitet er blevet evalueret i flere plantevæv, herunder frøhvide, blade og frø. I disse undersøgelser indgår metoder til bestemmelse af koffein syntase aktivitet et skridt af delvis protein oprensning, der foreslog, at det var nødvendigt at anvende renset enzym16,17. Her, udførte vi en optimal protokol for studiet af CS enzymatisk aktivitet ved hjælp af et opløseligt protein ekstrakt uden behov for skridt involverer rensning af proteinet. CS aktivitet i den rå ekstrakt af celle suspensioner kan måles i enheder af pkat, som andre forfattere har rapporteret. Vi evalueret koffein niveauer og enzymatisk aktivitet i bladene, og de har lignende niveauer til dem i in vitro- kultur.
Endelig, selv om tidligere forfattere har undersøgt udtryk for koffein syntase, har flere anvendes differentierede vævskultur6,18. Den metode, der præsenteres her er nyttigt at få en RNA ekstrakt og evaluere udtryk niveauer af genet CCS1 af RT-qPCR i forskellige in vitro- modeller af anlægget celle suspensioner, te og kakao.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Arbejdet i vores laboratorium blev finansieret af et tilskud fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) til SMTHS. Denne forskning blev også støttet af et fellowship tildeles RJPK (No. 37938) af CONACyT og Sistema Nacional de Investigadores (4422). Forfatterne takke CIATEJ for brug af sine anlæg under skrivning af dette manuskript. Særlig tak forlænges til Dr. Víctor Manuel González Mendoza med alle henstillinger i Molekylærbiologi sektion og Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM for faciliteterne under optagelserne af denne artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
