Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58166
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2CONACYT, Facultad de Ingeniería Química, Campus de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad Autónoma de Yucatán

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה יעיל עבור חילוץ ו כימות של קפאין ב השעיות תא של ערביקה ג ל' ואת תהליך ניסיוני להערכת הפעילות האנזימטית מתרחשת של קפאין סינתאז עם רמת ביטוי הגן המקודד אנזים זה.

Abstract

קפאין (1,3,7-trimethylxanthine) הוא אלקלואיד פורין נוכח משקאות פופולריים כמו קפה ותה. מטבוליט המשני הזה נחשב הגנה כימית בגלל זה יש פעילות מיקרוביאלית, והוא נחשב של חרקים טבעי. קפאין יכול לייצר גם השפעות שליליות allelopathic למנוע את התפתחותם של צמחים שמסביב. בנוסף, אנשים ברחבי העולם צורכים קפאין על השפעותיו להרגעה, מופחתים. בשל עניין היישומים הטכנולוגיים של קפאין, מחקר על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של מתחם זה גדל. מחקרים אלה התמקדו בעיקר הבנת המנגנונים הביוכימי והמולקולרי המסדירים ביוסינטזה של קפאין. במבחנה תרביות רקמה הפכה מערכת שימושי ללמוד מסלול זה biosynthetic הוחלף נגזר. מאמר זה יתאר פרוטוקול צעד אחר צעד עבור כימות של קפאין, מדידת הרמות את התעתיק של הגן (CCS1) אשר קידוד קפאין סינתאז (CS) ב השעיות תא של ערביקה ג ל, כמו גם את פעילותה.

Introduction

קפאין הוא מטבוליט משני זה biosynthesized על-ידי צמחים הסוג קפה1. אלקלואיד הזה שייך למשפחת methylxanthine, נחשב כהגנה מפעל כימי כי הוא יכול להתנהג מול ההשפעות השליליות של גורמי מחלה, אוכלי עשב2,3. בנוסף, מטבוליט זו אחראית על מאפייני מגרה לשתות קפה, אשר הוא נצרך בדרך כלל עולמית4,5. בשל תכונותיו, מספר קבוצות מחקר מעוניינות ללמוד את מסלול biosynthetic הוחלף נגזר ולבצע קטבוליזם של קפאין6,7. כיום, המפעל במבחנה תרבויות תא/רקמות לשמש אלטרנטיבה להערכת קפאין הצטברות תחת אסטרטגיות והאביוטיים ביוטיים שונים8,9.

קפאין ביוסינטזה מערבת את שחרור hydrolytic של 7-methylxanthine nucleoside ריבוז המתאים ואחריו מסודרות N-methylations-עמדות 3 ו- 1. ספציפית S- adenosyl מתיונין (SAM)-N התלויים-(nmt ב) methyltransferase מזרז מתילציה במיקום 7, ואילו תאוברומין סינתאז (TS) במדעי המחשב הם מעורבים ב 3 - ו 1-methylations, בהתאמה, בהפקת תאוברומין ו קפאין. המחקר של גנים קידוד NMTs ברורים אפשרה להבנת המנגנון המווסת קפאין ייצור10,11. הפקולטה למדעי המחשב, אשר יש N -פעילות methyltransferase, מזרז את שני השלבים האחרונים של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין11. בשתילי עץ הקפה, הוכח כי קרינה אור יכול להגביר פעילות בפקולטה למדעי המחשב, כשהתוצאה היא עלייה ביוסינטזה קפאין. לאחרונה, הראינו כי שמירה על התא השעיות של ערביקה ג ל' תחת אור הקרנה היא התנאי האופטימלית להערכת ההשפעות המייצרים והאביוטיים גורמים להשפיע על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין8. המידע הנקלט במחקרים אלה ייתכן יישומים בביולוגיה מערכות והנדסה מטבולית עבור למקסם את המחקר של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר קפאין במערכות כאלה במבחנה .

לאור היתרונות של קבלת מודל מתאים לצורך המחקר של קפאין ביוסינטזה, אנחנו ממוטב תנאי מיצוי קפאין על התא המתלים של ערביקה ג ל' היה זה גם אפשר לפתח פרוטוקול שימושי ללמוד את פעילות אנזימטי וכן את השלבים מתודולוגי להערכת רמת גן תעתיקים של קפה קפאין סינתאז 1 (CCS1) קידוד אנזים זה. במסמך זה, אנו מדווחים על פרוטוקול כדי לחלץ ולכמת קפאין ב השעיות תא ערביקה ג על ידי שכבת דק ו- densitometry (TLC-densitometry).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קפאין החילוץ ב השעיות תא של ערביקה ג ל'

  1. השתמש ערביקה ג תא המתלים9. לשמר את המתלים על-ידי התרבויות דו-שבועיים בינוני Murashige ו- Skoog ב- pH 4.3 עם 100 סל"ד קבוע רועד 25 ° c תחת תאורה רציפה (8.3 W/m2).
  2. לקצור את התאים תחת ואקום סינון באמצעות נייר סינון נקבובית מיקרומטר 11 ומשפך בוכנר.
  3. לרשום את המשקל טריים של התאים שנאספו באמצעות סרגל, עטפי אותם בנייר אלומיניום, להקפיא אותם בחנקן נוזלי ולשמור אותם ב-80 מעלות צלזיוס עד הניתוח.
  4. Lyophilize את החומר הסלולר קפוא עבור 72 h.
  5. לרשום את המשקל של התאים lyophilized כדי לאמוד את התשואה משקל יבש.
  6. לאחסן את החומר אבקת שקיות פוליאתילן לשימוש חוזר (9 ס"מ על 7.5 ס"מ). Macerate את החומר אבקה, בחנות desiccator עד השימוש.
  7. למדוד 0.5 גרם של חומר יבש הסלולר בסולם אנליטי ולהוסיף אותו בקבוקון זכוכית (25 מ ל).
    1. להוסיף 10 מ של אצטון על התאים lyophilized ולערבב במיקסר מערבולת ב-30 s עבור המגון. לאחר מכן, חותם את הבקבוקון ברדיד אלומיניום.
    2. מערבבים-100 סל"ד באמצעות מסובב בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 5 שעות.
  8. העברת כל החומר צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 13,000 x g עבור 10 דקות העברת הנוזל שלב לרכבת התחתית החדשה ולהפחית את זה יובש בטמפרטורת החדר בשכונה fume.
  9. Resuspend הדגימה עם 25 µL של אצטון.

2. התנאים ההערכה של קפאין על ידי דק שכבה כרומטוגרפיה (TLC)-Densitometry

  1. 1 µL של התמצית קפאין בעבר resuspended חלות על השלב נייח.
    הערה: סיליקה ג'ל צלחות (F254) משמשים שלב נייח. לפני החלת הדגימות, הלוחות פותחו עם 10 מ"ל של כלורופורם-מתנול [9:1 v/v] בתוך תא כרומטוגרפיה (14 ס מ x 12 ס"מ x 9.5 ס מ), הצלחות היו מיובשים בטמפרטורת החדר. המאפיינים של צלחת כרומטוגרפי שבו מוחלות הדגימות מוצגים באיור1. החדר היה רווי למשך 30 דקות עם הממס לפני לפתח את הצלחת. צלחות TLC צריך לטפל באמצעות כפפות כדי למנוע זיהום.
  2. לפתח את TLC בתא גזים עם 10 מ"ל של שלב ניידים ציקלוהקסאן-אצטון [40:50 וי/v].
    הערה: תערובת זו מאפשר ההפרדה של קפאין-גורם השמירה (Rf) של 0.34.
    1. הסר את לוחית TLC מן החדר ולתת לו להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר.
  3. דמיינו קפאין להקות באור אולטרה סגול באורך גל קצר (UV, 254 ננומטר). השתמש מנורת UV קומפקטי. בנוסף, בשלב זה, השתמש משקפי עם הגנת UV.
  4. לכמת רמות הקפאין על ידי densitometry ב 273 ננומטר. הכלי נשלט עם בדיקות תוכנה.

3. חומצה ריבונוקלאית (RNA) בידוד

  1. קח את המתלים תא מ שלב 1.1 ופילטרט של ואקום עם נייר סינון (11 µm גודל הנקבוביות).
  2. לאסוף את החומר הסלולר נייר הסינון, שוקל לצאת 0.5 גר' חומר הסלולר על איזון האנליטי, תכניסו אותו רדיד אלומיניום. להקפיא את הדגימה עם נוזל N2.
  3. Macerate את דגימת תאים במרגמה פורצלן עם חנקן נוזלי ולהוסיף 1 מ"ל של ריאגנט בידוד RNA ובודקים.
    הערה: לעקר את הפגזים פורצלן תנור לעמעם ב 300 ° C עבור 6-אייץ RNA בידוד ריאגנט מכיל פנול, guanidine isothiocyanate ורכיבים אחרים.
    1. העברת µL 500 מדגם צינור microcentrifuge סטרילי (1.5 מ ל). הוסף µL 300 באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1) ו- 300 μL של equilibrated פנול (pH 8.0).
  4. לערבב את הדגימה עם מערבל מערבולת, אז centrifuge זה ב x 20,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
  5. העברת μL 300 השלב העליון צינור microcentrifuge. להוסיף 200 μL של אלכוהול איזופרופיל. דגירה הצינור עבור h 1 ב-20 ° C.
  6. Centrifuge את הצינור ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant את שלב נוזלי.
    1. להוסיף 1 מ"ל אתנול (70%) כדי ליצור גלולה בצינור. צנטריפוגה ב x 12,000 g למשך 10 דקות, decant. חזור על שלב זה פעמיים.
  7. יבש את הדגימה עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר (25 ° C). Resuspend את תמצית ה-RNA עם 25 μL של diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים.
    הערה: על החילוץ RNA, להשתמש במים שטופלו 0.1% DEPC וי/v....

4. דגירה של RNA תעתיק עם Deoxyribonuclease (DNase)

  1. לתוך צינור microcentrifuge סטרילי, להוסיף 2 µg של RNA הכולל לחלץ. להוסיף 1 μL x 10 תגובה מאגר (100 מ"מ טריס-HCl, 25 מ מ MgCl2, 1 מ"מ CaCl2). להוסיף 1 μL של DNase U/µL 1.
    1. להביא התגובה נפח סופי של μL 10 במים שטופלו DEPC. מערבבים את הדגימה ואת צנטריפוגה בקצרה ב 2,000 x g עבור 1 דקות.
  2. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. עוצרים את התגובה עם התוספת של 1 μL של 50 מ מ ניתרן ethylenediaminetetraacetate וגופרית והרכבו (נה2EDTA), דגירה המדגם-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. לנתח את התקינות של RNA ידי agarose בג'ל.
    1. הכנת ג'ל agarose 1% סטנדרטיים, את הכתם עם µL 1 של 3 x intercalating חומצת גרעין הכתם פתרון.
    2. להחיל 500 ננוגרם של RNA כדי agarose ג'ל ולהפעיל את הג'ל.
    3. דמיינו בשלמות הרנ א באמצעות מערכת תיעוד צילום ג'ל.
    4. השתמש RNA כתבנית עבור סינתזה cDNA מאת רוורס טרנסקריפטאז.

5. משלימים חומצה Deoxyribonucleic (cDNA) סינתזה

  1. להוסיף 2.5 μg של RNA סה כ צינור microcentrifuge. להוסיף 1 μL של פריימר oligo-deoxythymine (dT) ולמלא את הצינור לאמצעי הסופי 13 μL במים נטולי נוקלאז. לערבב את הדגימה, ואז centrifuge 2,000 x g עבור 1 דקות.
  2. דגירה המדגם 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  3. להוסיף 4 μL של 5 x תגובת מאגר להשתמש רוורס טרנסקריפטאז, 2 μL של deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) מיקס (10 מ מ כל dNTP) של μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL). לערבב בעדינות, צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 1 דקות.
  4. דגירה המדגם 45 º C למשך 50 דקות ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. לכמת את הריכוז cDNA באמצעות ספקטרופוטומטרים UV.
  6. השתמש את cDNA כתבנית עבור תגובת שרשרת פולימראזית (PCR).
    הערה: המאגר התגובה שימש 10 x (שלב 4.1.1) 5 x פעמים מרוכזת (שלב 5.3), בהתאמה.

6. בזמן אמת PCR כמותי (qPCR) כדי להגביר את ג'ין CCS1

  1. להוסיף 7.5 μL של Taq DNA פולימראז 2 x (0.1 U/mL) ו- 0.1 μM של 5-carboxy-X-rhodamine (רוקס) צינור microcentrifuge ה-PCR.
    הערה: התחלה לוהטת Taq DNA פולימראז 2 x שימש פתרון 2 x מרוכז.
    1. להוסיף 5 μL של נוקלאז ללא מים.
    2. להוסיף 0.75 μL כל של 10 μM ואחורה פריימר כדי להגביר את הגן CCS1 (AB086414) (לפנים: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' ו הפוכה: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). לשימוש תחל טובולין כמו הגן משק בית בתגובה נפרדת (לפנים: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' ו הפוכה: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
    3. להוסיף 600 ng cDNA תבנית.
  2. לבצע את התגובה הגברה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ו- 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק דגירה התגובה במערכת ה-PCR בזמן אמת עבור 40 מחזורי 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s.
  3. דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 30 s ו- 20 ° C עבור 10 s.
  4. לנתח את הנתונים בתוכנת ה-PCR.
  5. לחשב את הביטוי יחסי על-ידי ה-2-ΔΔCT בשיטה המתוארת באמצעות Livak ו- Schmittgen (2001)12.
    הערה: לנתח תגובה שליטה המכילה את כל הרכיבים למעט תבנית ה-DNA (אין תבנית שליטה, NTC) ריאגנטים להשליך מזוהמים או הגברה פריימר-הדימרים.

7. כמות חלבון תמצית של תא השעיות של ערביקה ג ל'

  1. לסנן תא המתלים תחת ואקום עם נייר סינון בינוני-הנקבובית.
  2. שוקל 1 g של חומר הסלולר ותארוז את זה בנייר אלומיניום.
    1. להקפיא את הדגימה עם חנקן נוזלי. Macerate הדגימה במרגמה פורצלן סטיריליים לקבל אבקה.
  3. להעביר את הדגימה בקבוקון זכוכית ולהוסיף 2.5 מ ל חילוץ מאגר (400 מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane הידרוכלוריד (טריס-HCl), ב- pH 8.0, המכיל 10 מ מ β-mercaptoethanol, 5 מ מ נה2EDTA ו- 0.5% (w/v) סודיום אסקורבט.
    1. מערבבים את הדגימה במיקסר מערבולת למשך 2 דקות.
      הערה: חשוב כי הדגימה נשמרת בקירור כדי למנוע דנטורציה של חלבונים.
  4. Centrifuge הדגימה ב x 20,000 g למשך 20 דקות ב 4 ° C, להעביר 500 µL aliquots לתוך מבחנות הקפאה (2 מ"ל). לאחסן דגימות ב-72 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  5. למדוד את ריכוז חלבון המדגם-562 nm בספקטרופוטומטר שימוש assay חומצה bicinchoninic עם אלבומין שור התקנית.

8. Assay אנזימטי של קפאין סינתאז

  1. להכין תערובת התגובה צינור microcentrifuge המכילה 200 מיקרומטר סאם, kBq 4.07 של מתיל [3H]-סאם, 200 מיקרומטר תאוברומין, 200 מיקרומטר MgCl2ו- 5 מיקרומטר קפאין. להגביר את עוצמת הקול כדי µL 200 עם 100 מ מ טריס-HCl ב- pH של 8.0.
  2. לשמור את הצינור microcentrifuge על קרח ולהוסיף אמצעי אחסון של השבר מסיסים המכיל 7-9 מ"ג של חלבון. לאחר מכן, לערבב על ידי מערבולת, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 30 מעלות צלזיוס ברים, מערכות אינסטלציה אמבטיה/סירקולטור. עבור אצווה של מספר דגימות, דגירה כל דגימה של כפילויות בתקופות 1 דקות לתת מספיק זמן כדי להפסיק את התגובות עבור כל הדגימות תקופת הזמן המדויק של 30 דקות.
    1. להוסיף 1 מ"ל של כלורופורם להפסיק את התגובה, אז תלחצו את הדגימה עם מערבל מערבולת. לנער את הדגימה באמצעות מערבל מערבולת למשך 3 דקות כדי להסיר את הקפאין רדיואקטיבי הממס.
  3. צנטריפוגה דגימות ב 11,000 x g למשך 5 דקות, בזהירות לשחזר אמצעי אחסון של 900 µL. לאחר מכן, העבר את הדגימות נצנוץ בקבוקונים.
  4. להתאדות ההרדמה כדי להשלים יובש בשכונה בטמפרטורת החדר 25 º C. הוסף 5 מ של נוזל נצנוץ למבחנה ומערבבים את הדגימה.
  5. לנתח רדיואקטיביות שולבו את הקפאין ב מונה נצנוץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמציות קפאין שהושג דרך התהליך המוצג כאן נותחו על ידי TLC-densitometry במינים את הדוגמאות כדי צלחת כרומטוגרפיה על פי התכנית המוצגת באיור1. כדי לכמת את הרמות של קפאין תמציות תא, עקומה עם ריכוזים שונים של תקן מסחרי מתחם זה היה בשימוש (איור 2 א). הדפוס של ספיגת עבור קפאין נותחו בתחום האור הנראה (UV-VIS) באמצעות ספיגה מירבית לשיא ב 273 nm (איור 2B), נגד ההפרדה שיא של קפאין על הצלחת TLC הראה של Rf בין 0.34 0.39 (איור 2C).

הפעילות של קפאין סינתאז להעריך באמצעות פרוטוקול זה ציין פעילות ספציפית עבור האנזים של 1.2 pkat (טבלה 1). הפעילות של אנזים זה היה דומה לזה שדווחו על-ידי מחברים אחרים אשר השתמשו חלבון מטוהרים.

הצעד הראשון לפני חישוב הביטוי ג'ין CCS1 היה הבידוד באיכות גבוהה RNA. האיכות של תמצית RNA הכולל נגזר תא המתלים הוערך ולאחר ההפרדה של subunits rRNA 28S. 18S, 5S הודגם, המציין כי הרנ א שחולצו מן הדגימות היה באיכות גבוהה (איור 3 א). עם זאת, אלה תמציות RNA היה צריך להיות מטופלים עם אנזים DNase להסיר גנומית זיהום דנ א (איור 3B), אשר משבשת הכנת cDNA. לאחר מכן, qPCR בוצעה באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, התוצאה של העקומה להמיס הראה מוצר יחיד הגברה עבור הגן סינתאז קפאין (איור 4).

Figure 1
איור 1. המשמשת עבור יישום של קפאין לחלץ דוגמיות על צלחת TLC. ערכת מראה ממד צלחת סיליקה (6 x 10 ס מ) המשמש כדי להחיל עד שמונה דגימות כולל תמציות קפאין או תקנים. שקול למרחק של 1 ס מ בין דגימות בצלחת TLC להשיג רזולוציה טובה יותר ההפרדה הלהקה קפאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. זיהוי של קפאין על ידי TLC-densitometry תא תמציות של ערביקה ג ל' (א) ההפרדה של קפאין ריכוזים סטנדרטי (ליין 1, 0.4; 2, 0.6; 3, 0.8; 4, 1; 5, 1.2; ו- 6. 1.4 µg) שונים ההפרדה שלהם הפסגות בתמונה מצד הימין. (ב) ספיגת דפוסים של קפאין סטנדרטי (קו סגול) וכן קפאין לחלץ (הקו הירוק) באורכי גל שונים באמצעות ספקטרום בליעה (סגול, גלוי). (ג) שיא ההפרדה של קפאין בתא לחלץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. הפקת הרנ א סה כ. תמציות RNA של המתלים הסלולר של ערביקה ג ל' נותחו על ידי אלקטרופורזה. (א) RNA החילוץ, (כפילויות נתיבים 1-2); (ב) RNA דגימות נתון לטיפול עם DNase. ג'לים agarose 1% היו מוכנים, מוכתם 3 x intercalating חומצת גרעין הכתם פתרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. עקומת ההיתוך המיוצר באמצעות תוכנת qPCR ונתונים RT-qPCR. העקומה מסומן באדום הוא מוצר מוגבר יחיד התואם הגן סינתאז קפאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

צמח תמצית חלבון פעילות ספציפית CS הפניה
קפה
התליה תא גולמי 1.2 pkat פרוטוקול זה
האנדוספרם מטוהר 5.7 pkat 12
תה
עלים מטוהר 11 pkat 13
גוארנה
זרעים מטוהר 20 fkat 14

טבלה 1. השוואה של פעילות ספציפיים למדעי המחשב בגידולים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים כאן את תנאים אופטימליים עבור הערכת את הקפאין תוכן, פעילות CS ורמות תעתיק במבחנה לשתול תרביות רקמה, כגון תא השעיות של ערביקה ג. בדו"חות קודמים אישרו כי שמירה על תאים תחת אור הקרנה ובפני תאוברומין במדיום תרבות הם פרמטרים מתאימים להגדיל את רמת של קפאין, כך שניתן להעריך את שיטות ההפרדה קפאין באמצעות הפוך-פאזי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (RP-HPLC). כיום, ישנם דיווחים מעטים המשתמשות שיטה פשוטה ומהירה עם יתרונות כלכליים ללמוד קפאין ביוסינטזה ב השעיות התא. . הנה, הערכה חלופית הראה שיטת ההפרדה קפאין באמצעות TLC-densitometry, אשר יעילה לניתוח כמותי של קפאין תא תמציות. כדי להעריך את הקפאין בתאים, זה לא היה נחוץ להאכיל תאוברומין התאים התרבות כפי שדווח בעבר14,15.

קפאין סינתאז פעילות יוערכו ברקמות הצמח מספר, כולל את האנדוספרם, עלים וזרעים. במחקרים אלה, השיטות לקביעת קפאין סינתאז פעילות כלל שלב טיהור חלקי חלבון שרמז כי היה צורך להשתמש מטוהרים אנזים ה-16,17. כאן, אנו לבצע פרוטוקול אופטימלית עבור המחקר של הפעילות האנזימטית מתרחשת למדעי המחשב באמצעות תמצית חלבון מסיס ללא צורך שלבים הטיהור של החלבון. פעילות CS תמצית גולמי של המתלים תא נמדד ביחידות של pkat, כפי מחברים אחרים דיווחו. הערכנו את רמות קפאין ופעילות אנזימטי עלים, ויש להם רמות דומות לאלה בתרבות במבחנה .

בסופו של דבר, למרות מחברים הקודם למד את הביטוי של קפאין סינתאז, מספר השתמשו תרביות רקמה הבדיל6,18. המתודולוגיה המוצגת כאן היא שימושית כדי להשיג RNA תמצית וכן להעריך את רמות הביטוי של הגן CCS1 מאת RT-qPCR במודלים שונים במבחנה של המתלים תא הצמח, כגון תה, קקאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

העבודה של המעבדה שלנו מומן על ידי מענק Consejo נאסיונאל דה Ciencia, y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS. מחקר זה גם נתמך על ידי התחברות שהוענקו RJPK (מס 37938) מאת CONACyT, את "סיסטמה" נסיונאל דה Investigadores (4422). המחברים תודה CIATEJ על השימוש של התקנות שלה במהלך הכתיבה של כתב היד הזה. תודה מיוחדת מורחבות כדי ד ר Víctor מנואל גונזלס מנדוזה לקבלת המלצות כל סעיף ביולוגיה מולקולרית, ולנטין מנדוזה רודריגס, IFC, UNAM מתקנים במהלך הצילומים של מאמר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture PhytoTechnology Laboratories M524 Packge Size: 50 L
Reagent (mg/L)
Ammonium Nitrate (1650)
Boric acid (6.2)
Calcium chloride, anhydrous (322.2)
Cobalt Chloride•H2O (0.025)
Cupric Sulfate•5H2O (0.025)
Na2EDTA•2H2O (37.26)
Ferrous Sulfate•7H2O (27.8)
Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7)
Manganese Sulfate•H2O (16.9)
Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25)
Potassium Iodide (0.83)
Potassium Nitrate (1900)
Potassium Phosphate, Monobasic (170)
Zinc Sulfate•7H2O (8.6)
Supplemented with
myo-inositol (100)
thiamine (10)
cysteine (25)
sucrose (30000)
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3)
6-benzylamine purine (1)
Caffeine SIGMA C0750-5G STANDARD-5g
Theobromine SIGMA T4500 20 g
CAMAG TLC Scanner-4 CAMAG 27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software CAMAG 1.4.10 Software
Isoamyl alcohol (24:1) SIGMA C-0549 500 mL
Cyclohexane JALMEX C4375-13 1 L
Acetone J.T. BAKER 900643 4 L
Methanol J.T. BAKER 9093-03 4 L
Chloroform JALMEX C-4425-15 3.5 L
TLC silica gel 60 F254 Merck 1.05554.0001 TLC plate
β-mercaptoethanol M6250 SIGMA 100 mL
(+)-sodium L- ascorbate A4034 SIGMA 100 g
Trizma base SIGMA T6066 1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38% J.T. Baker 9535-05 2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo scientific 232227 Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine Perkin Elmer NET155 Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials SIGMA Z253081
Thermostatic bath/circulator Cole Parmer 60714
Micro centrifugue tube Eppendorf Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials Heathrow Scientific HS23202A 2 mL
Centrifuge 5804 Eppendorf 5804 000925
Vortex Thermolyne LR 5947
Porcelain mortar Fisherbrand FB961B
Filter paper Whatman Z274844 Porosity medium
Picofuge Stratagene 400550 2000 x g
Analytical balance AND HR-120 Model HR-120
Scintillation counter Beckman Coulter 6500
Gel photodocumentation system Bio-Rad Chemic XRS Model Chemic XRS
Compact UV lamp UVP 95002112 UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel SIGMA 2419907 Type 37600 mixer
TRIzol reagent Thermo scientific 15596-018 200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase Thermo scientific #EP0441 10000 U
Oligo (dT)18 primer Thermo scientific #S0131 100 µM
DNase I, RNase-free Thermo scientific #EN0525 1000 U
Magnesium chloride Thermo scientific EN0525 1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid Thermo scientific EN0525 1 mL
dNTP mix Thermo scientific R0191 R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X) Thermo scientific K0251 For 200 reactions of 25 µL
PikoReal Thermo scientific 2.2 Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure USB J75829 100 mL
Isopropyl alcohol Karal 2040 1 L
Ethyl alcohol SIGMA 64175 1 L
Diethyl pyrocarbonate SIGMA D5758 100 mL
Lab Rotator LW Scientific Mod. LW210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
  2. Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
  3. Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
  4. Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
  5. De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
  6. Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
  7. Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
  8. Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
  9. Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
  10. Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
  11. Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
  12. Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
  14. Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
  15. Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
  16. Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
  17. Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
  18. Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).

Tags

ביוכימיה בעיה 140 קפה ערביקה המתלים תא מיצוי קפאין קפאין סינתאז פעילות ביטוי גנים CSS1 TLC-densitometry מטבוליטים משניים
מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pech-Kú, R.,… More

Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Hernández-Sotomayor, S. M. T. Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions. J. Vis. Exp. (140), e58166, doi:10.3791/58166 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter