Summary
Bu iletişim kuralı çıkarma ve miktar hücre süspansiyonlar C. arabica L., kafein için verimli bir metodoloji ve kafein synthase enzimatik aktivite ile ifade düzeyini değerlendirmek için deneysel bir işlem açıklar Bu enzimi kodlayan gen.
Abstract
Kafein (1,3,7-trimethylxanthine) bir pürin alkaloid popüler içecekler kahve ve çay gibi mevcut olduğunu. Bu Antimikrobiyal aktivite ve doğal bir böcek ilacı olarak kabul edilir çünkü bu ikincil metaboliti kimyasal bir savunma olarak kabul edilir. Kafein Ayrıca çevredeki bitkilerin büyüme engelleyen olumsuz allelopathic etkileri üretebilir. Buna ek olarak, dünyanın her yerinden insanlar kafein analjezik ve uyarıcı etkileri için tüketmek. Kafein teknolojik uygulamalar ilgi nedeniyle bu bileşik biyosentetik yol üzerinde araştırma büyüdü. Bu çalışmalar öncelikle kafein biyosentezi düzenleyen biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları anlama üzerinde odaklanmıştır. Vitro doku kültürü biyosentetik bu yolu çalışmak için kullanışlı bir sistem haline gelmiştir. Bu makale için miktar kafein ve kafein synthase (CS) kodlama transkript düzeyleri gen (CCS1) ölçmek için adım adım bir protokol içinde hücre süspansiyonlar C. arabica L. hem de faaliyete anlatacağız.
Introduction
Kafein bitkilerin cins Coffea1tarafından uzarlar olan ikincil bir metaboliti olduğunu. Bu alkaloit methylxanthine ailesine ait ve bu patojenler ve otobur2,3olumsuz etkilerine karşı hareket edebilir çünkü bir kimya fabrikası savunma olarak kabul edilir. Buna ek olarak, bu metaboliti yaygın olarak tüketilen dünya çapında4,5kahve içecek uyarıcı özellikleri için sorumludur. Onun özellikleri nedeniyle, birkaç araştırma grubu biyosentetik yolu ve katabolizma kafein6,7okumak ilgilendi. Şu anda, bitki vitro hücre/doku kültürleri çeşitli biyotik ve abiyotik stratejileri8,9altında kafein birikimi değerlendirmek için bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Kafein biyosentezi içerir tarafından sipariş edilen Ntakip karşılık gelen riboz nükleozit hydrolytic açıklaması, 7-methylxanthine-methylations pozisyonlarda 3 ve 1. Belirli bir S- adenosyl metiyonin (SAM)-bağımlı N-Metiltransferaz (NMT) tromboksan metilasyonu pozisyonda 7, oysa theobromine synthase (TS) ve CS söz konusu olursa 3 - ve 1-methylations yılında, sırasıyla, theobromine üreten ve kafein. Genlerin farklı NMTs kodlama çalışma kafein üretim10,11düzenleyen mekanizması anlama izin verdi. N -metiltransferaz etkinliği olan CS, kafein11biyosentetik yolun son iki adımı tromboksan. Kahve ağacı fidan ışık radyasyon kafein biyosentezi artış sonuçlanır CS etkinlik artırabilir gösterilmiştir. Son zamanlarda, C. arabica L. ışık ışınlama altında hücre Süspansiyonlar bakım kafein8biyosentetik yolu etkileyen abiyotik stres faktörleri üretmek etkilerini değerlendirmek için en uygun koşul olduğunu gösterdi. Bu çalışmalarda elde edilen bilgileri kafein biyosentetik yolu çalışmanın tür vitro sistemlerde maksimize etmek için metabolik Mühendisliği ve sistemleri biyoloji uygulamaları olabilir.
Kafein biyosentezi incelenmesi için uygun bir model alma avantajları göz önüne alındığında, biz C. arabica L. çıkarma koşulları hücre süspansiyonlar kafeini için en iyi duruma getirilmiş Enzimatik aktivite yanı sıra organik kafein synthase bu enzim kodlama 1 (CCS1) gen tutanaklar düzeyini değerlendirmek için metodolojik adımları eğitim için yararlı bir protokolü geliştirmeye mümkündü. Burada, biz ayıklayın ve ince katmanlı Kromatografi ve Dansitometresi (TLC-Dansitometresi) tarafından C. arabica hücre süspansiyonlar kafein ölçmek için bir protokol raporu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kafein çekme içinde hücre süspansiyonlar, C. arabica L.
- C. arabica hücre süspansiyonlar9kullanın. Sürekli 100 sürekli ışık (8.3 W/m2) altında 25 ° C'de sallayarak rpm ile pH 4,3 Murashige ve Skoog ortamda iki haftada bir altkültürler tarafından süspansiyonlar bakımını yapar.
- 11 µm gözenek filtre kağıdı ve bir Buchner huni kullanarak vakum filtrasyon altında hücre hasat.
- Bir ölçek kullanarak kendine hakim hücre taze ağırlığını kayıt, alüminyum folyo poşete, onları sıvı azot içinde dondurma ve-80 ° C'de analiz kadar tutun.
- 72 h için dondurulmuş hücresel malzeme lyophilize.
- Lyophilized hücreleri ağırlığını Kuru ağırlık verim tahmin etmek için kayıt.
- Toz malzeme (9 cm x 7.5 cm) yeniden kullanılabilir polietilen torbalarda saklayın. Malzeme ince toz ve bir desiccator deposunda kadar kullanmak macerate.
- Analitik ölçekte kuru hücresel maddenin 0.5 g ölçmek ve bir cam şişeye (25 mL) ekleyin.
- 10 mL aseton lyophilized hücrelere ve girdap karıştırıcı 30 karıştırın s homojenizasyon için. O zaman, şişeye alüminyum folyo ile kapatın.
- 100 rpm bir rotator (25 ° C) Oda sıcaklığında 5 h için kullanarak karıştırın.
- 15 mL konik tüp ve 13.000 x g , santrifüj 10 dk. sıvı faz için yeni bir tüp ve azaltmak için Transfer için tüm malzeme transfer kuruluk duman başlıklı oda sıcaklığında.
- Aseton 25 µL örnekle resuspend.
2. koşullar kafein ince tarafından değerlendirilmesi için katman Kromatografi (TLC)-Dansitometresi
- Daha önce resuspended kafein ekstresinin 1 µL durağan faz için geçerlidir.
Not: Silis jeli tabak (F254) durağan faz kullanılır. Örnekleri uygulamadan önce tabakları bir kromatografi odasında kloroform-metanol [9:1 v/v] 10 mL ile geliştirilmiştir (14 cm x 12 cm x 9,5 cm), ve tabakları oda sıcaklığında kurutulur. Örnekleri uygulandığı kromatografik plaka özellikleri Şekil 1' de gösterilmiştir. Odası için 30 dk plaka geliştirme önce solvent ile doymuş. TLC plakaları kirlenmesini önlemek için eldiven kullanarak işlemesi gerekir. - TLC ile mobil faz Siklokekzan-aseton [40:50 v/v] 10 mL Kromatografi odasında geliştirmek.
Not: Bu karışımı bir saklama faktör 0.34 (Rf) kafein ayırma verir.- TLC plaka odasından kaldırın ve oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
- Kısa dalga boyu ultraviyole ışık bantlarında kafein görselleştirmek (UV, 254 nm). Kompakt bir UV lamba kullanın. Ayrıca, bu adımda, UV koruma ile kullanım gözlükler.
- Tarafından Dansitometresi 273, kafein düzeyleri ölçmek nm. Araç Kromatografi yazılımı ile kontrol edilir.
3. ribonükleik asit (RNA) yalıtım
- Hücre süspansiyonlar adım 1.1 ve filtre kağıdı (11 µm gözenek boyutu) ile vakum filtrate al.
- Filtre kağıdı hücresel malzeme toplamak, dışarı bir analitik bakiyesine hücresel malzemenin 0.5 g tartmak ve alüminyum folyo paketi. Sıvı N2örnekle dondur.
- Bir porselen havan topu sıvı azot ile hücre örnekte macerate ve homojenize oluncaya kadar RNA izolasyon reaktif 1 mL ekleyin.
Not: 6 h. RNA izolasyon reaktif fenol, guanidin isothiocyanate ve diğer bileşenler içerir için 300 ° c Muffe fırın porselen havan Sterilize.- Örnek 500 µL steril microcentrifuge tüp (1,5 mL) aktarın. Kloroform izoamil alkol (24:1) 300 µL ve denge fenol (pH 8.0) 300 μL ekleyin.
- Örnek bir girdap mikser ile karıştırın ve sonra 20.000 x g 4 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi
- Üst aşaması 300 μL microcentrifuge tüp aktarın. İsopropanol 200 μL ekleyin. -20 ° C'de 1 h için tüp kuluçkaya
- Tüp, 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve sıvı faz dikkatle boşaltmak.
- 1 mL tüp bir Pelet oluşturmak için etanol (% 70) ekleyin. 12.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve dikkatle boşaltmak. Bu iki kez tekrarlayın.
- Örnek oda sıcaklığında (25 ° C) 1,5 saat için kuru. RNA özü 25 μL dietil pyrocarbonate (DEPC) ile resuspend-tedavi su.
Not: RNA ayıklama için %0,1 DEPC v/v ile tedavi su kullanın.
4. kuluçka RNA transkript deoksiribonükleaz (DNaz) ile
- Steril microcentrifuge tüp içine 2 µg toplam RNA'ın özü ekleyin. 10 x reaksiyon arabellek (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) 1 μL ekleyin. 1 U/µL DNaz 1 μL ekleyin.
- Son hacmi 10 μL DEPC tedavi su ile reaksiyon getir. Örnek ve 1 dk. için 2.000 x g de kısaca santrifüj karıştırın.
- Örnek için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- 50 mM disodyum ethylenediaminetetraacetate dihydrate (Na2EDTA) 1 μL ilavesi ile reaksiyonu durdurmak ve örnek 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.
- RNA bütünlüğünü özel jel elektroforez tarafından analiz.
- Standart bir % 1'özel jel hazırlamak ve nükleik asit leke çözüm enterkalasyon x 3 1 µL ile leke.
- 500 uygulamak ng RNA'ın özel jel ve jel çalıştırın.
- Bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü görselleştirin.
- RNA transkriptaz tarafından cDNA sentezi için şablon olarak kullanın.
5. tamamlayıcı Deoksiribonükleik asit (cDNA) sentezi
- Toplam RNA'ın 2.5 μg microcentrifuge tüp ekleyin. 1 μL oligo-deoxythymine (dT) astar ekleyin ve 13 μL son hacim tüp nükleaz ücretsiz su ile doldurun. Örnek mix ve 2.000 x g için 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Örnek 5 min için 65 ° C ve daha sonra 4 ° C'de 2 min için kuluçkaya.
- Ters transkriptaz, 2 μL deoxynucleotide trifosfatlardan (dNTPs) Mix (her dNTP 10 mM) ve ters transkriptaz (200 U/µL) 1 μL için kullanılan tepki arabellek x 5 4 μL ekleyin. Karışımı yavaşça ve 2.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi.
- Örnek 50 dk 45 ° C ve daha sonra 10 dk 70 ° C kuluçkaya.
- UV spektrofotometre kullanarak cDNA konsantrasyon ölçmek.
- CDNA polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için şablon olarak kullanın.
Not: Tepki arabellek 10'a kadar kullanıldı (adım 4.1.1) x ve 5 x kere konsantre (adım 5.3), anılan sıraya göre.
6. Gene CCS1 yükseltmek için gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR)
- Taq DNA polimeraz 2 x (0.1 U/mL) ve 0,1 mikron 5-carboxy-X-rodamine (ROX), 7.5 μL PCR microcentrifuge tüp ekleyin.
Not: Sıcak başlangıç Taq DNA polimeraz 2 x 2 x konsantre bir çözüm olarak kullanıldı.- 5 μL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
- 0,75 μL her 10 mikron ileriye ve geriye doğru ilk gen CCS1 (AB086414) yükseltmek için Ekle (ileri: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' ve ters: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Ev tutma gen ayrı bir tepki olarak tübülin için astar kullanmak (ileri: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' ve ters: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- 600 eklemek cDNA şablonunun ng.
- 2 dk ve 95 ° C 5 dakika süreyle tepki 40 devredir 30 95 ° c için gerçek zamanlı PCR sistemdeki kuluçkaya için 50 ° c amplifikasyon reaksiyonu gerçekleştirmek s, 60 ° C 30 30 72 ° C ve s s.
- Örneği 50 ° C'kuluçkaya 30 s ve 20 ° C 10 s.
- PCR yazılımlarıyla veri analiz.
- 2 tarafından göreli Ifade hesaplamak-ΔΔCT yöntemi Livak ve Schmittgen tarafından açıklanan (2001)12.
Not: DNA şablon (şablon kontrol, NTC) dışında tüm bileşenleri içeren bir denetim tepki kontamine atma reaktifler veya amplifikasyon astar-dimer çözümleyebilirsiniz.
7. Toplam Protein özü hücre süspansiyonlar, C. arabica L.
- Bir orta-gözenek filtre kağıdı ile vakum altında hücre süspansiyonlar filtre.
- Hücresel malzeme 1 g tartmak ve alüminyum folyo paketi.
- Sıvı azot ile örnek dondur. İnce bir toz almak için sterilize porselen havan mermisi örnekte macerate.
- Örnek bir cam şişe nakletmek ve eklemek 2.5 mL ayıklama arabelleği (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hidroklorid (Tris-HCl), pH 8.0, 10 mM β-mercaptoethanol, 5 mM Na2EDTA ve %0,5 (w/v) sodyum askorbat içeren.
- Örnek bir girdap karıştırıcı 2 min için karıştırın.
Not: Örnek proteini denatürasyon önlemek için buza tutulur önemlidir.
- Örnek bir girdap karıştırıcı 2 min için karıştırın.
- 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de örnek santrifüj kapasitesi ve 500 µL aliquots kriyojenik şişeleri (2 mL) aktarın. -72 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak.
- 562 örnek protein konsantrasyonu ölçmek bicinchoninic asit tahlil Sığır serum albümin ile standart olarak kullanarak bir spektrofotometre nm.
8. enzimatik tahlil için kafein Synthase
- 200 µM SAM, metil [3H] 4,07 kBq içeren bir microcentrifuge tüp bir reaksiyon karışım hazırlamak-SAM, 200 µM theobromine, 200 µM MgCl2ve 5 mikron kafein. 100 mM Tris-HCl pH 8.0 ile 200 µL birime artırın.
- Microcentrifuge tüp buz üzerinde tutun ve 7-9 mg protein içeren çözünür kesir bir ses eklemek. Sonra gönderen vortex mix ve termostatik banyo/sirkülatörün 30 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Çeşitli örnekleri bir toplu iş için her örnek içinde yinelenen bir 30 dk tam zaman diliminde tüm örnekleri için tepkiler durdurmak için yeterli zaman vermek için 1 dk dönemlerde kuluçkaya.
- Reaksiyon durdurmak ve örnek bir girdap mikser ile sallamak için kloroform 1 mL ekleyin. Radyoaktif kafein çözücü içinde kaldırmak için 3 dk bir girdap Mikser kullanarak örnek sallamak.
- 11.000 x g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve dikkatle 900 µL hacmi yeniden elde etmek. Ardından örnekleri için mercek şişeleri aktarın.
- Kuruluk başlıklı 25 ° C'de oda sıcaklığında tamamlamak için kloroform buharlaşır Mercek sıvı 5 mL flakon ve örnek karıştırın.
- Kafein bir mercek Counter içine dahil radyoaktivite analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan oluşum yolu ile elde edilen kafein özleri TLC-Dansitometresi tarafından Kromatografi Şekil 1' de gösterilen düzenine göre plaka örnekleri subjecting tarafından analiz edildi. Bu bileşik için hücre özleri kafein, bir eğri seviyeleri çeşitli ticari standart konsantrasyonları ile ölçmek için (Şekil 2A) kullanılır. Kafein absorbans desen görünür ışık spektrumu (UV-VIS) maksimum emilim tepe 273 kullanarak analiz nm (Şekil 2B) ve kafein TLC plaka üzerinde tepe ayrılması bir Rf 0,34 ve 0,39 (Şekil 2C) arasında gösterdi.
Bu iletişim kuralı kullanılarak hesaplandı kafein sentaz aktivitesini 1.2 pkat (Tablo 1) Bu enzim için belirli bir aktiviteyi belirtti. Bu enzim aktivitesi saf protein kullanılan diğer yazarlar tarafından bildirilen benzerdi.
CCS1 gen ifade değerlendirme önce ilk yüksek kaliteli RNA izolasyonu adımdı. Hücre süspansiyonlar elde edilen toplam RNA'ın özü kalitesini değerlendirildi ve örnekleri çıkarılan RNA (Şekil 3A) yüksek kalitede olduğunu belirten 28S, 18S ve 5S rRNA alt birimleri ayrılması gösterilmiştir. Ancak, bu RNA özleri cDNA hazırlanması ile müdahale genomik DNA kirlilik (Şekil 3B), DNaz enzim ile tedavi edilebilir gerekiyordu. Daha sonra qPCR yukarıda açıklanan protokolü ve kafein sentaz gen (Şekil 4) için bir tek amplifikasyon ürünü gösterdi eritebilir eğrisi sonucu kullanılarak gerçekleştirildi.
Şekil 1. Kafein uygulanması için kullanılan düzeni örnekleri TLC tabakta ayıklamak. Düzeni kafein özleri veya standartlar dahil olmak üzere en çok sekiz örnekleri uygulamak için kullanılan silis plaka boyutu (6 x 10 cm) gösterir. Kafein grup ayrılık daha iyi çözünürlük elde etmek için TLC plaka örnekleri arasında 1 cm mesafe göz önünde bulundurun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kafein TLC-Dansitometresi hücre tarafından algılanmasını ayıklar C. arabica L. (A) çeşitli kafein standart konsantrasyonları (lane 1, 0,4; 2, 0.6; 3, 0.8; 4, 1; 5, 1.2; ve 6, 1.4 µg) ve onların doruklarına sağdaki resimdeki ayrılması ayrılması. (B) absorbans desenleri bir kafein standart (mor çizgi) ve kafein (yeşil hat) emme spectra (ultraviyole ve görünür) kullanarak farklı dalga boylarında ayıklayın. (C) en yüksek kafein hücredeki ayrılması ayıklayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Toplam RNA çıkarımı. C. arabica L. hücresel süspansiyonlar RNA özleri Elektroforez tarafından analiz edildi. (A) RNA ayıklama, (yineleme yolları 1-2); (B) RNA örnekleri DNaz ile tedaviye tabi. % 1'özel jelleri kurumlara ve nükleik asit leke çözüm enterkalasyon x 3 ile lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. QPCR yazılım ve RT-qPCR veri kullanılarak üretilen erime eğrisi. Kırmızı ile işaretlenmiş eğri kafein sentaz gen için karşılık gelen bir tek güçlendirilmiş bir üründür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bitki | Protein özü | CS belirli aktivite | Başvuru |
| Organik | |||
| Hücre süspansiyon | Ham | 1.2 pkat | Bu iletişim kuralı |
| Endosperm | Saf | 5.7 pkat | 12 |
| Çay | |||
| Yaprakları | Saf | 11 pkat | 13 |
| Guarana | |||
| Tohumlar | Saf | 20 fkat | 14 |
Tablo 1. CS özel etkinlik farklı bitkileri karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada içerik kafein değerlendirmek için en uygun koşulları mevcut, CS etkinlik ve transkript düzeyleri bir vitro doku kültürü, C. arabicahücre süspansiyonlar gibi bitki. Önceki raporlar Bakımı hücreleri ışık ışınlama altında ve theobromine kültür orta huzurunda kafein, kafein ayırma yöntemleri değerlendirmek edinerek düzeyini artırmak için uygun parametreler olduğunu doğruladı ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) kullanarak. Şu anda hücre süspansiyonlar içinde biyosentezi kafein eğitimi için ekonomik avantajları ile basit ve hızlı bir yöntem kullanan birkaç raporlar vardır. Burada, bir alternatif değerlendirme TLC-Dansitometresi, olan hücre özleri kafein Nicel analiz verimli kullanarak kafein için bir ayırma yöntemi gösterdi. Hücreler hücrelerin içindeki kafein değerlendirmek için daha önce14,15bildirildiği gibi kültür hücrelere theobromine beslemek gerekli değildi.
Kafein synthase etkinlik içinde birkaç bitki doku, endosperm, yaprak ve tohum gibi değerlendirilmiştir. Bu çalışmalarda yöntemleri kafein synthase aktivite tayini için bir adım arıtılmış enzim16,17kullanmak gerekli önerilen kısmi protein arınma dahil. Burada, en iyi bir iletişim kuralı çözünür protein özü arıtma protein içeren adımları için gerek kalmadan kullanarak CS enzimatik aktivite incelenmesi için gerçekleştirilen. Diğer yazarlar bildirdin gibi CS etkinlik hücre süspansiyonlar ham özü pkat, birimlerinde ölçülebilir. Kafein düzeyleri ve yaprakları enzimatik aktivite değerlendirildi ve onlar-si olmak o vitro kültür benzer düzeyde.
Son olarak, her ne kadar önceki yazarlar kafein synthase ifade inceledik, birkaç farklı doku kültürü6,18kullandık. Burada sunulan metodoloji özü bir RNA edinme ve bitki hücre süspansiyonlar, çay ve kakao gibi farklı vitro modellerinde gen CCS1 RT-qPCR tarafından ifade düzeylerini değerlendirmek için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bizim Laboratuvar çalışmalarını Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS için bir hibe tarafından finanse edildi. Bu araştırma RJPK (No. 37938) CONACyT ve Sistema Nacional de Investigadores (4422) tarafından verilen bir arkadaş grubu tarafından da desteklenmiştir. Yazarlar CIATEJ Bu makale yazma sırasında onun teçhizatları kullanım için teşekkür ederiz. Özel teşekkür Dr Víctor Manuel González Mendoza tesisleri için moleküler biyoloji bölümü ve Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM tüm öneriler için bu makalenin çekimler sırasında genişletilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
