Summary
Этот протокол описывает эффективная методология для извлечения и количественной оценки кофеина в клеточных суспензий л. C. arabica и экспериментальный процесс оценки Ферментативная активность кофеин синтазы с уровнем экспрессии ген, который кодирует этого фермента.
Abstract
Кофеин (1,3,7-trimethylxanthine) является Пуриновые алкалоиды в популярных напитков, как кофе и чай. Это вторичные метаболиты рассматривается как химической обороны, потому что она обладает антимикробной активностью и считается природных инсектицидов. Кофеин может также производить отрицательный аллелопатические эффектов, которые предотвратить рост окружающих растений. Кроме того люди во всем мире потребляют кофеин для его болеутоляющим и стимулирующее воздействие. Из-за интереса в области технологического применения кофеина выросла исследований биосинтетических пути этого соединения. Эти исследования были главным образом сосредоточены на понимание биохимических и молекулярных механизмов, которые регулируют биосинтеза кофеина. В vitro тканевой культуры стала полезной системы для изучения этой биосинтетических путь. Этой статье будут описаны пошаговые протокол для количественного определения кофеина и для измерения уровней Транскрипт гена (CCS1) кодирования кофеин синтазы (CS) в клеточных суспензий C. arabica л, а также ее деятельности.
Introduction
Кофеин является вторичные метаболиты, biosynthesized растениями рода Coffea1. Этот алкалоид принадлежит к семейству метилксантина и рассматривается как химический завод обороны, потому что он может выступать против неблагоприятных последствий патогенов и травоядных животных2,3. Кроме того этот метаболит отвечает за стимулирование свойств кофейный напиток, который обычно потребляются во всем мире4,5. Благодаря своим свойствам несколько исследовательских групп заинтересованы в изучении биосинтетических путь и катаболизма кофеин6,7. В настоящее время завод в пробирке клеток/тканей культур служат в качестве альтернативы для оценки накопления кофеин под различными биотическими и абиотическими стратегии8,9.
Кофеин биосинтез включает гидролитическая выпуск 7-метилксантина от соответствующего рибозы нуклеозидов, после чего приказал N-methylations в позициях 3 и 1. Конкретный S- аденозил-метионина (SAM)-зависимых N-метилтрансфераза (NMT) катализирует метилирования в позиции 7, тогда как теобромин синтаза (ТС) и CS участвуют в 3 - и 1-methylations, соответственно, производства теобромин и Кофеин. Изучение генов, кодирующих собственный NMTs позволяет понять механизм, который регулирует кофеин производства10,11. CS, который имеет N -метилтрансфераза активность, катализирует два последних шага биосинтетических путь кофеин11. В кофе сеянцев было показано, что излучения могут увеличить активность CS, что приводит к увеличению биосинтеза кофеин. Недавно мы показали, что поддержание суспензий клеток C. arabica л под легкие облучения является оптимальное состояние для оценки воздействия, которые производят абиотического стресса факторов, влияющих на биосинтетические путь кофеин8. Информация, полученная в рамках этих исследований могут иметь приложений в метаболических систем и техники биологии для максимального изучение кофеин биосинтетических путь в таких системах в пробирке .
Учитывая преимущества получения подходящую модель для изучения биосинтеза кофеин, мы оптимизировали условий извлечения кофеина на клеточных суспензий C. arabica л Также удалось разработать полезные протокол для изучения ферментативную активность, а также методологических шаги для оценки уровня транскриптов гена кофе кофеин синтетазы кодирования этого фермента 1 (CCS1). Здесь мы приводим протокол для извлечения и количественно кофеина в C. arabica клеточных суспензий тонкослойной хроматографии и денситометрии (TLC-денситометрия).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. кофеин добыча в клеточных суспензий C. arabica л
- Используйте суспензий клеток C. arabica 9. Поддерживать суспензий, раз в две недели субкультур в фотосинтетическую и Скуг средах при рН 4,3 с постоянной тряски при 25 ° C под непрерывный свет (8,3 Вт/м2) 100 об/мин.
- Урожай клетки под вакуумной фильтрации с использованием 11 мкм поры фильтра бумаги и воронку Buchner.
- Зарегистрировать свежие вес собранных клеток, используя шкалу, оберните их в алюминиевой фольги, заморозить их в жидком азоте и держать их на-80 ° C до анализа.
- Lyophilize замороженные клеточным материалом для 72 ч.
- Регистрация веса лиофилизированные клетки для того чтобы оценить урожайность сухого веса.
- Храните порошкового материала в многоразовые полиэтиленовые мешки (9 x 7,5 см). Размачиваем материал для мелкого порошка и в магазине в эксикатор до использования.
- Измерения 0,5 г сухого вещества сотовой на шкале аналитической и добавить его в стеклянную колбу (25 мл).
- Добавить 10 мл ацетона в лиофилизированном клетки и смешать в миксере вихрь 30 s для гомогенизации. Затем уплотнение колбу с алюминиевой фольгой.
- Смесь при 100 об/мин, с использованием ротатор при комнатной температуре (25 ° C) для 5 h.
- Передать все материалы 15 мл Конические трубки и центрифуги на 13 000 x g 10 мин передачи жидкости фазы новой трубки и уменьшить его сухость в вытяжной шкаф при комнатной температуре.
- Ресуспензируйте образца с 25 мкл ацетона.
2. условия для оценки кофеин, тонкий слой хроматографии (ТСХ)-денситометрия
- Применить к стационарной фазы 1 мкл концентрированного экстракта ранее ресуспензированы кофеин.
Примечание: Силикагель пластины (F254) используются в качестве неподвижной фазой. Перед применением образцы, пластины были разработаны с 10 мл хлороформа метанол [9:1 v/v] в камере хроматографии (14 см x 12 см х 9,5 см), и пластины были сушат при комнатной температуре. Характеристики пластину хроматографии, где применяются образцы показаны на рисунке 1. Палата была пропитана растворителя за 30 мин до начала разработки пластину. TLC пластин должен обрабатывать, использовать перчатки, чтобы избежать загрязнения. - Разработка TLC в зале хроматографии с 10 мл подвижная фаза циклогексан-ацетона [40:50 v/v].
Примечание: Эта смесь позволяет разделение кофеина на удержание фактор (РФ) 0.34.- Снять пластину TLC из камеры и дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
- Визуализировать кофеин полос в короткие волны ультрафиолетового излучения (УФ, 254 Нм). Используйте компактный УФ-лампа. Кроме того для этого шага, использовать очки с УФ-защитой.
- Количественную оценку уровней кофеин, денситометрия в 273 Нм. Прибор управляется с хроматографии программного обеспечения.
3. рибонуклеиновой кислоты (РНК) изоляции
- Возьмите клеточных суспензий из шага 1.1 и фильтрат вакуум с фильтровальной бумаги (размер пор 11 мкм).
- Собирать клеточного материала из фильтровальной бумаги, весят, 0,5 г клеточного материала на аналитический баланс и упаковать его в алюминиевую фольгу. Заморозить образца с жидкостью N2.
- Размачиваем образец клеток в фарфоровой ступке с жидким азотом и добавьте 1 mL реагента изоляции РНК до гомогенизированный.
Примечание: Стерилизуйте минометы фарфора в муфельной печи при температуре 300 ° C, для изоляции реагента 6 ч. РНК содержит фенол, Изотиоцианаты гуанидина и другие компоненты.- Передачи 500 мкл пример в стерильных microcentrifuge трубку (1,5 мл). Добавьте 300 мкл хлороформ изоамилового спирта (24:1) и 300 мкл уравновешенной фенола (рН 8,0).
- Смешать с вихревой смеситель образец и затем центрифуги на 20000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Перевести 300 мкл этапа верхней пробки microcentrifuge. Добавьте 200 мкл изопропанола. Инкубировать трубки для 1 ч при-20 ° C.
- Центрифуга трубки на 12000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, а затем декантируют жидкой фазы.
- Добавьте 1 mL этанола (70%), в форме гранул в трубе. Центрифуга на 12000 x g 10 мин и сцеживаться. Повторите этот шаг два раза.
- Сухие образца для 1,5 ч при комнатной температуре (25 ° C). Ресуспензируйте экстракт РНК с 25 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды.
Примечание: Для извлечения РНК, используйте воду, получавших DEPC 0,1% v/v.
4. инкубации Стенограмма РНК с дезоксирибонуклеаза (DNase)
- В стерильные microcentrifuge трубку добавьте экстракт 2 мкг всего РНК. Добавьте 1 мкл 10 x буфер реакции (100 мм трис-HCl, 25 MgCl2, 1 мм CaCl2). Добавьте 1 мкл 1 DNase U/мкл.
- Принесите реакция на окончательный объем 10 мкл DEPC-лечение водой. Mix образца и центрифуги кратко на 2000 x g за 1 мин.
- Проинкубируйте образцы при 37 ° C за 30 мин.
- Остановить реакции с добавлением 1 мкл 50 мм динатриевой тетранатрия дигидрат (Na2ЭДТА) и инкубации образца при 65 ° C для 10 мин.
- Анализ целостности РНК электрофорезом геля агарозы.
- Подготовить стандартный гель агарозы 1% и выведение его с 1 мкл 3 x вставочный решение пятен нуклеиновой кислоты.
- Применить 500 нг РНК агарозы гель и запустить геля.
- Визуализируйте целостность РНК с помощью геля фото документации системы.
- Использования РНК в качестве шаблона для синтеза cDNA, обратной транскриптазы.
5. Дополнительные дезоксирибонуклеиновой кислоты синтеза cDNA (кДНК)
- Добавьте 2,5 мкг всего РНК пробки microcentrifuge. Добавить 1 мкл праймера oligo-deoxythymine (dT) и заполнить трубу к 13 мкл окончательный объем свободной от нуклеиназы водой. Перемешайте образец и затем центрифуга 2000 x g за 1 мин.
- Проинкубируйте образцы на 65 ° C за 5 мин и затем на 4 ° C на 2 мин.
- Добавьте 4 мкл 5 x реакции буфер, используемый для обратной транскриптазы, 2 мкл deoxynucleotide трифосфаты (дНТФ) смеси (10 мм каждого dNTP) и 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Осторожно перемешать и центрифуги на 2000 x g за 1 мин.
- Инкубируйте образца на 45 ° C 50 мин, а затем при 70 ° C на 10 мин.
- Количественного определения концентрации cDNA, используя Спектрофотометр UV.
- Используйте cDNA как шаблон для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Примечание: В буфер реакции был использован в качестве 10 x (шаг 4.1.1) и 5 x раз сосредоточены (шаг 5.3), соответственно.
6. в реальном времени количественного PCR (ПЦР) для того чтобы усилить гена CCS1
- Добавьте 7,5 мкл Taq ДНК полимеразы 2 x (0,1 ед/мл) и 0,1 мкм 5-карбоксильную X-родамин (ROX) пробки microcentrifuge ПЦР.
Примечание: Горячий старт полимеразы дна Taq 2 x был использован в качестве решения 2 x концентрации.- Добавьте 5 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Добавьте 0,75 мкл 10 мкм прямого и обратного праймера для того чтобы усилить гена CCS1 (AB086414) (вперед: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' и обратное: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Использовать Праймеры для тубулин, как уборка гена в отдельном реакции (вперед: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' и обратное: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- Добавить 600 нг cDNA шаблона.
- Выполните реакции амплификации при 50 ° C за 2 мин и 95 ° C за 5 минут инкубации реакции в системе реального времени PCR для 40 циклов 95 ° c за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s.
- Инкубировать образца при температуре 50 ° C за 30 s и 20 ° C для 10 s.
- Анализировать данные с помощью ПЦР программного обеспечения.
- Вычислить относительное выражение 2-ΔΔCT метод описан Livak и Schmittgen (2001)12.
Примечание: Анализ реакции управления, которая содержит все компоненты, за исключением ДНК шаблон (без шаблона элемента управления, NTC) для удаления загрязненных реагентов или амплификации грунт димеры.
7. Общий экстракт белков клеточных суспензий C. arabica л
- Фильтрации суспензий клеток под вакуумом с бумагой средне поры фильтра.
- Весят 1 g клеточного материала и упаковать его в алюминиевую фольгу.
- Заморозить образца с жидким азотом. Размачиваем образец в стерилизованные фарфоровой ступке для получения мелкодисперсного порошка.
- Передать образец стекла флакона и добавить 2,5 мл извлечения буфера (400 мм трис (гидроксиметил) aminomethane гидрохлорид (Tris-HCl), при рН 8,0, содержащие β-меркаптоэтанол 10 мм, 5 мм Na2ЭДТА и Аскорбат натрия 0,5% (w/v).
- Перемешайте образец в вихревой смеситель на 2 мин.
Примечание: Важно, что образец хранится на льду во избежание денатурации белков.
- Перемешайте образец в вихревой смеситель на 2 мин.
- Центрифугуйте образцы на 20000 x g 20 мин при температуре 4 ° C и передачи 500 мкл аликвоты в криогенных флаконов (2 мл). Хранить образцы-72 ° c до использования.
- Измерить концентрацию белка образца в 562 Нм в спектрофотометр с помощью bicinchoninic кислоты пробирного с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.
8. ферментативный Assay для синтазы кофеин
- Приготовить смесь реакции в microcentrifuge тубы 200 мкм Сэм, 4.07 КБК метил [3H]-Сэм, 200 мкм теобромин, 200 мкм MgCl2и 5 мкм кофеин. Повышайте громкость до 200 мкл с 100 мм трис-HCl при рН 8,0.
- Держите пробки microcentrifuge на льду и добавить тома растворимых фракций, содержащих 7-9 мг белка. Затем смешать вихря и Инкубируйте 30 мин при 30 ° C в термостатический термостат. Для выпечки несколько образцов Инкубируйте каждый образец в двух экземплярах в 1 мин периоды дать достаточно времени, чтобы остановить реакции для всех образцов в точное время период 30 мин.
- Добавьте 1 мл хлороформа для остановки реакции и затем встряхнуть образца с вихревой смеситель. Встряхните образца с помощью вихревой смеситель для 3 мин для удаления радиоактивных кофеин в растворителе.
- Центрифугуйте образцы на 11000 x g 5 минут и тщательно восстановить объем 900 мкл. Затем перенесите образцы на сцинтилляционный флаконов.
- Испарится метилхлороформа завершить сухости в капот при комнатной температуре в 25 ° C. Добавить 5 мл жидкости сцинтилляционные флакона и перемешать образца.
- Анализируйте радиоактивности, включены в кофеин в сцинтилляционный счетчик.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кофеин экстракты, полученные через этот процесс, представленные здесь были проанализированы TLC-денситометрия, подвергая образцы для пластины хроматографии по схеме показано на рисунке 1. Для количественной оценки уровни кофеина в клеточных экстрактов, кривой с различных концентраций коммерческого стандарта для этого соединения был использован (рисунок 2A). Модель поглощения для кофеина было проанализировано в спектре видимого света (UV-VIS) с помощью пик максимального поглощения в 273 Нм (рис. 2B) и пик разделение кофеина на пластину TLC показал РФ между 0,34 и 0.39 (рис. 2 c).
Действие кофеина синтетазы оцениваются с помощью этого Протокола указали конкретные действия для этого фермента 1,2 pkat (Таблица 1). Активность этого фермента был похож на сообщения от других авторов, которые использовали очищенный протеин.
Первым шагом перед вычислением выражения гена CCS1 был изоляции высокого качества РНК. Оценивалось качество экстракт всего РНК, производные от клеточных суспензий, и была продемонстрирована разделение 28S, 18S и 5S рРНК субблоков, указав, что РНК, извлеченные из образцов высокого качества (Рисунок 3А). Однако эти экстракты РНК пришлось лечить с DNase фермента для удаления геномной ДНК загрязнения (рис. 3B), которая мешает подготовке cDNA. Впоследствии ПЦР была выполнена с использованием протокола, описанных выше и в результате расплава кривой показан один амплификации продукт для кофеина синтазы гена (рис. 4).
Рисунок 1. Схема используется для применения кофеина извлечения образцов на табличке TLC. Схема показывает кремнезема пластины размерности (6 x 10 см), который используется для применения до восьми образцов, включая кофеин экстрактов или стандартов. Рассмотрим на расстоянии 1 см между выборками в пластину TLC получить лучшее разрешение кофеин полосы разделения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Обнаружение кофеина на TLC-денситометрия в ячейке экстракты C. arabica л (A) разделение различных стандартных концентрации кофеина (переулок 1, 0,4; 2, 0,6; 3, 0,8; 4, 1; 5, 6 и 1,2; 1,4 мкг) и разделения их вершины на изображении справа. (B) absorbance шаблоны кофеин стандарт (фиолетовая линия) и кофеин экстракт (зеленая линия) на разных длинах волн с помощью спектров поглощения (ультрафиолетовой и видимой). (C) пик разделение кофеина в ячейке экстракт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Извлечения всего РНК. РНК экстракты клеточных суспензий C. arabica л были проанализированы электрофорезом. (A) РНК добыча, (дубликаты полос 1-2); (B) РНК образцы обращению с DNase. Гели агарозы 1% были подготовлены и витражи с 3 x вставочный решение пятен нуклеиновой кислоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Кривую плавления, производится с помощью ПЦР программного обеспечения и данных RT-ПЦР. Кривая, отмеченные красным цветом является единый усиливается продукт, который соответствует гена синтазы кофеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Завод | Экстракт белка | Удельная активность CS | Ссылка |
| Кофейное дерево | |||
| Суспензию клеток | Сырой | 1.2 pkat | Этот протокол |
| Эндосперма | Очищенный | 5.7 pkat | 12 |
| Чай | |||
| Листья | Очищенный | 11 pkat | 13 |
| Гуарана | |||
| Семена | Очищенный | 20 fkat | 14 |
Таблица 1. Сравнение CS-конкретной деятельности в различных культурах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем оптимальные условия для оценки содержания кофеина, уровней активности и Стенограмма CS в в vitro растений культуры ткани, такие как клеточных суспензий C. arabica. Предыдущие доклады подтвердили, что поддержание клетки под легкие облучения и в присутствии теобромин в среде культуры являются подходящие параметры для повышения уровня кофеина, что делает его возможным оценить методы разделения кофеин Использование вспять фазы высокой производительности жидкостной хроматографии (RP-ВЭЖХ). В настоящее время существует несколько отчетов, которые используют простой и быстрый метод с экономическими преимуществами для изучения биосинтез кофеин в клеточных суспензий. Здесь альтернативной оценки показан метод разделения для кофеина, с помощью TLC-денситометрия, который является эффективным для количественного анализа кофеина в клеточных экстрактов. Чтобы оценить кофеин в клетках, нет необходимости кормить теобромин в культуре клетки, как сообщалось ранее,14,15.
Кофеин синтазы деятельность проводилась в несколько растительных тканей, включая эндосперма, листья и семена. В этих исследованиях методы для определения активности синтетазы кофеин включали шаг очищение частичной протеина, который предложил, что было необходимо для использования очищенных ферментных16,17. Здесь мы провели оптимальный протокол для изучения CS ферментативной активности с использованием растворимого белка экстракт без необходимости мер с участием очищение протеина. Активность CS в сырой экстракт суспензий клеток может быть измерена в единицах pkat, как другие авторы сообщили. Мы оценили уровень кофеина и ферментативную активность в листьях, и они имеют аналогичные уровни для тех, кто в культуре в пробирке .
Наконец хотя предыдущие авторы изучали выражение синтазы кофеин, несколько использовали дифференцированной культуры ткани6,18. Методологии, представленные здесь полезен для получения экстракта РНК и оценить уровни выражения гена CCS1 , RT-ПЦР в разных в vitro модели суспензий клеток растений, например, чай и какао.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа нашей лаборатории был профинансирован грант от Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ 219893) на SMTHS. Это исследование было также поддержано стипендий, предоставленных КОНАСИТ и Sistema Nacional de Investigadores (4422) к RJPK (№ 37938). Авторы благодарят CIATEJ за использование его объектов во время написания этой рукописи. Специальная благодарность д-р Виктор Мануэль Гонсалес Мендоса для всех рекомендаций, содержащихся в секции молекулярной биологии и Валентин Мендоса Родригес, МФК, ЮНАМ для удобства во время съемок этой статьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
