Summary
Questo protocollo descrive una metodologia efficace per l'estrazione e la quantificazione di caffeina in sospensioni cellulari di L. c. arabica e un processo sperimentale per valutare l'attività enzimatica della sintasi di caffeina con il livello di espressione il gene che codifica per questo enzima.
Abstract
(1,3,7-trimetilxantina) la caffeina è un alcaloide della purina presente nelle popolari bevande quali caffè e tè. Questo metabolita secondario è considerato come una difesa chimica perché ha attività antimicrobica ed è considerato un insetticida naturale. La caffeina può anche produrre effetti negativi allelopatiche che impediscono la crescita di piante circostanti. Inoltre, persone in tutto il mondo consumano caffeina per i suoi effetti analgesici e stimolatori. A causa di interesse per le applicazioni tecnologiche di caffeina, ricerca sulla via biosintetica di questo composto è cresciuta. Questi studi si sono concentrati principalmente sulla comprensione dei meccanismi biochimici e molecolari che regolano la biosintesi di caffeina. Coltura in vitro del tessuto è diventato un sistema utile per lo studio di questa via biosintetica. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la quantificazione di caffeina e per misurare i livelli di trascrizione del gene (CCS1) codifica caffeina sintasi (CS) in sospensioni di cellule di c. arabica L., come pure la sua attività.
Introduction
La caffeina è un metabolita secondario che è biosynthesized da piante del genere Coffea1. Questo alcaloide appartiene alla famiglia delle metilxantine ed è considerato come una difesa di impianto chimico perché può agire contro gli effetti contrari di agenti patogeni ed erbivori2,3. Inoltre, questo metabolita è responsabile per le proprietà stimolanti della bevanda caffè, che è comunemente consumato in tutto il mondo4,5. Grazie alle sue proprietà, diversi gruppi di ricerca sono interessati a studiare la via biosintetica e catabolismo di caffeina6,7. Attualmente, colture di vegetali in vitro cellule/tessuti servono come un'alternativa per la valutazione di accumulo di caffeina sotto varie strategie biotici e abiotici8,9.
Biosintesi di caffeina coinvolge il rilascio idrolitico di 7-methylxanthine dai nucleosidici ribosio corrispondente seguito da ordinato N-iperomocisteinemici nelle posizioni 3 e 1. Una specifico S- adenosil metionina (SAM)-dipendente N-metiltransferasi (NMT) catalizza la metilazione in posizione 7, considerando che la teobromina sintetasi (TS) e CS sono coinvolti in 3 e 1 iperomocisteinemici rispettivamente, producendo teobromina e caffeina. Lo studio dei geni che codificano distinti NMTs ha permesso la comprensione del meccanismo che regola la caffeina produzione10,11. CS, che ha attività di N -metiltransferasi, catalizza gli ultimi due passaggi della via biosintetica di caffeina11. Nei semenzali di pianta del caffè, ha dimostrato che la radiazione luminosa può aumentare attività di CS, che si traduce in un aumento della biosintesi di caffeina. Recentemente, abbiamo dimostrato che il mantenimento delle sospensioni di cellule di c. arabica L. sotto irradiazione di luce è la condizione ottima per valutare gli effetti che producono fattori di stress abiotici che influenzano la via biosintetica di caffeina8. Le informazioni ottenute in questi studi possono avere applicazioni in biologia di ingegneria e sistemi metabolica per massimizzare lo studio della via biosintetica caffeina in tali sistemi in vitro .
Considerati i vantaggi di ottenere un modello adatto per lo studio della biosintesi di caffeina, abbiamo ottimizzato le condizioni di estrazione di caffeina su sospensioni di cellule di c. arabica L. È stato anche possibile sviluppare un protocollo utile per studiare l'attività enzimatica, nonché passaggi metodologici per valutare il livello delle trascrizioni del gene di Coffea caffeina sintasi 1 (CCS1) codifica per questo enzima. Qui, segnaliamo un protocollo per estrarre e quantificare la caffeina in sospensioni di cellule di c. arabica da cromatografia di strato sottile e densitometria (TLC-densitometria).
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Protocol
1. caffeina estrazione in sospensioni di cellule di c. arabica L.
- Utilizzare c. arabica cella sospensioni9. Mantenere le sospensioni da sottoculture bisettimanale nel mezzo di Murashige e Skoog a pH 4,3 con 100rpm costante agitazione a 25 ° C sotto luce continua (8.3 W/m2).
- Raccogliere le cellule sotto vuoto filtrazione utilizzando 11 µm poro carta da filtro e un imbuto di Buchner.
- Registrare il peso fresco delle cellule raccolte utilizzando una scala, avvolgerli in carta stagnola, congelarli in azoto liquido e tenerli a-80 ° C fino all'analisi.
- Lyophilize il materiale cellulare congelato per 72 h.
- Registrare il peso delle cellule liofilizzate per valutare il rendimento di peso a secco.
- Conservare il materiale in polvere in sacchetti di polietilene riutilizzabile (9 x 7,5 cm). Macerare il materiale ad una polvere fine e il negozio in un essiccatore fino all'utilizzo.
- Misurare 0,5 g di sostanza secca cellulare sulla bilancia analitica e aggiungerlo a un fiasco di vetro (25 mL).
- Aggiungere 10 mL di acetone per le cellule liofilizzate e mescolate in un miscelatore vortex per 30 s per omogeneizzazione. Quindi, tappare il matraccio con foglio di alluminio.
- Mescolare a 100 rpm usando un rotatore a temperatura ambiente (25 ° C) per 5 h.
- Trasferire tutto il materiale a una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 13.000 x g per 10 min trasferimento liquido fase ad un nuovo tubo e ridurre ad esso secchezza a temperatura ambiente nella cappa.
- Risospendere il campione con 25 µ l di acetone.
2. condizioni per la valutazione di caffeina da sottile strato cromatografia (TLC)-densitometria
- Applicare 1 µ l di Estratto di caffeina in precedenza sedimento per la fase stazionaria.
Nota: lastre di gel di silice (F254) vengono utilizzati come la fase stazionaria. Prima di applicare i campioni, le piastre sono state sviluppate con 10 mL di cloroformio-metanolo [9:1 v/v] in una camera di cromatografia (14 x 12 cm x 9,5 cm), e le piastre sono state essiccate a temperatura ambiente. Le caratteristiche della lastra cromatografica dove sono applicati i campioni sono mostrate nella Figura 1. La camera era saturo per 30 min con solvente prima di sviluppare la piastra. Lastre TLC dovrebbero maneggiare usando guanti per evitare la contaminazione. - Sviluppare il TLC nella camera di cromatografia con 10 mL di fase mobile cicloesano-acetone [40:50 v/v].
Nota: Questa miscela permette la separazione di caffeina ad un fattore di ritenzione (Rf) di 0,34.- Rimuovere la piastra di TLC dalla camera e lasciarla asciugare completamente a temperatura ambiente.
- Visualizzate le fasce di caffeina in breve lunghezza d'onda di luce ultravioletta (UV, 254 nm). Utilizzare una lampada UV compatta. Inoltre, per questo passaggio, uso gli occhiali con protezione UV.
- Quantificare i livelli di caffeina da densitometria a 273 nm. Lo strumento è controllato con il software di cromatografia.
3. l'acido ribonucleico (RNA) isolamento
- Prendere le sospensioni delle cellule dal passaggio 1.1 e filtrato sottovuoto con carta da filtro (porosità µm 11).
- Raccogliere il materiale cellulare dalla carta da filtro, pesare 0,5 g di materiale cellulare su una bilancia analitica e confezione in carta stagnola. Congelare il campione con liquido N2.
- Macerare il campione di cellule in un mortaio di porcellana con azoto liquido e aggiungere 1 mL di reagente di isolamento del RNA finché non omogeneizzato.
Nota: Sterilizzare i mortai di porcellana in un forno a muffola a 300 ° C per 6 h. RNA isolamento reagente contiene fenolo, guanidina isotiocianato e altri componenti.- Trasferire 500 µ l di campione in una provetta sterile microcentrifuga (1,5 mL). Aggiungere 300 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1) e 300 μL di fenolo equilibrato (pH 8.0).
- Mescolare il campione con un miscelatore vortex e centrifugare quindi esso a 20.000 x g per 15 min a 4 ° C.
- Trasferire 300 μL della fase superiore ad un tubo del microcentrifuge. Aggiungere 200 μL di isopropanolo. Incubare la provetta per 1 h a-20 ° C.
- Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e quindi decantare la fase liquida.
- Aggiungere 1 mL di etanolo (70%) per formare una pallina nel tubo. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min e decantare. Ripetere questo passaggio due volte.
- Essiccare il campione per 1,5 h a temperatura ambiente (25 ° C). Risospendere l'Estratto di RNA con 25 μL di pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua trattata.
Nota: Per l'estrazione di RNA, utilizzare acqua trattata con DEPC 0.1% v/v.
4. incubazione del trascritto di RNA con desossiribonucleasi (DNasi)
- In una microcentrifuga sterile, aggiungere 2 µ g di RNA totale estratto. Aggiungere 1 μL di tampone di reazione x 10 (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1mm CaCl2). Aggiungere 1 μL di 1 U / µ l dnasi.
- Portare la reazione ad un volume finale di 10 μL con acqua trattata con DEPC. Mescolare il campione e centrifugare brevemente a 2.000 x g per 1 min.
- Incubare il campione a 37 ° C per 30 min.
- Interrompere la reazione con l'aggiunta di 1 μL di 50mm disodico diidrato di acido etilendiamminotetraacetico (Na2EDTA) e incubare il campione a 65 ° C per 10 min.
- Analizzare l'integrità del RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- Preparare un gel di agarosio all'1% standard e macchia con 1 µ l di 3 x intercalanti acido nucleico macchia soluzione.
- Applicare 500 ng di RNA a agarose gel ed eseguire il gel.
- Visualizzare l'integrità del RNA utilizzando un sistema di documentazione foto di gel.
- Utilizzare RNA come il modello per la sintesi di cDNA dal transcriptase d'inversione.
5. complementare (cDNA) sintesi dell'acido deossiribonucleico
- Aggiungere 2,5 µ g di RNA totale ad un tubo del microcentrifuge. Aggiungere 1 µ l di primer oligo-deoxythymine (dT) e riempire il tubo fino ad un volume finale di 13 μL con acqua priva di nucleasi. Mescolare il campione e poi Centrifugare a 2.000 x g per 1 min.
- Incubare il campione a 65 ° C per 5 min e poi a 4 ° C per 2 min.
- Aggiungere 4 μL di tampone di reazione utilizzata per trascrittasi inversa, 2 μL di miscela di deossinucleotidi trifosfati (dNTPs) (10 mM di ogni dNTP) e 1 μL della trascrittasi inversa (200 U / µ l): 5x. Mescolare delicatamente e centrifugare a 2.000 x g per 1 min.
- Incubare il campione a 45 ° C per 50 min e poi a 70 ° C per 10 min.
- Quantificare la concentrazione di cDNA utilizzando uno spettrofotometro UV.
- Utilizzare il cDNA come il modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).
Nota: Il tampone di reazione è stato utilizzato come 10 x (punto 4.1.1) e 5 x volte concentrato (punto 5.3), rispettivamente.
6. Real-Time PCR quantitativa (qPCR) per amplificare il Gene CCS1
- Aggiungere 7,5 μL di Taq DNA polimerasi 2 x (0,1 U/mL) e 0,1 μM di 5-carbossi-X-rodamina (ROX) ad un tubo del microcentrifuge PCR.
Nota: L'avviamento a caldo la Taq DNA polimerasi 2 x è stato utilizzato come una soluzione 2 x concentrato.- Aggiungere 5 μL di acqua priva di nucleasi.
- Aggiungere 0,75 µ l di primer forward e reverse μM in 10 per amplificare il gene CCS1 (AB086414) (avanti: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' e d'inversione: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Utilizzare primer per tubulina come il gene house-keeping in una reazione separata (avanti: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' e d'inversione: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.
- Aggiungere 600 ng di modello di cDNA.
- Eseguire la reazione di amplificazione a 50 ° C per 2 min e 95 ° C per 5 min. Incubare la reazione del sistema in tempo reale di PCR per 40 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s.
- Incubare il campione a 50 ° C per 30 s e 20 ° C per 10 s.
- Analizzare i dati con il software PCR.
- Calcolare l'espressione relativa della 2-ΔΔCT metodo descritto da Livak e Schmittgen (2001)12.
Nota: Analizzare una reazione di controllo che contiene tutti i componenti tranne il modello di DNA (nessun controllo di modello, NTC) a scartare contaminati reagenti o dimeri dell'iniettore di amplificazione.
7. totale estratto proteico delle sospensioni di cellule di c. arabica L.
- Sospensioni cellulari filtro sotto vuoto con una carta da filtro medio-poro.
- Pesare 1 g del materiale cellulare e confezione in carta stagnola.
- Congelare il campione con azoto liquido. Macerare il campione in un mortaio di porcellana sterilizzato per ottenere una polvere fine.
- Trasferire il campione in una fiala di vetro e aggiungere 2,5 mL di tampone di estrazione (400 mM tris (idrossimetil) amminometano cloridrato (Tris-HCl), pH 8.0, contenente 10 mM β-mercaptoetanolo, 5mm Na2EDTA e ascorbato di sodio 0,5% (p/v).
- Mescolare il campione in un miscelatore vortex per 2 min.
Nota: È importante che il campione è tenuto su ghiaccio per prevenire la denaturazione delle proteine.
- Mescolare il campione in un miscelatore vortex per 2 min.
- Centrifugare il campione a 20.000 x g per 20 min a 4 ° C e trasferire 500 aliquote µ l in criogenici fiale (2 mL). Conservare i campioni a-72 ° C fino all'utilizzo.
- Misurare la concentrazione di proteine del campione a 562 nm in uno spettrofotometro utilizzando dosaggio acido bicinconinico con albumina di siero bovino come standard.
8. analisi enzimatica per la sintasi di caffeina
- Preparare una miscela di reazione in un tubo del microcentrifuge contenente 200 µM SAM, 4,07 kBq di metile [3H]-SAM, teobromina µM 200, 200 µM MgCl2e caffeina 5 µM. Aumentare il volume a 200 µ l con 100 mM Tris-HCl a pH 8.0.
- Tenere il tubo del microcentrifuge sul ghiaccio e aggiungere un volume della frazione solubile contenente 7-9 mg di proteina. Quindi, mescolare Vortex e incubare per 30 min a 30 ° C in un bagno termostatico/circolatore. Per un lotto di campioni diversi, Incubare ciascun campione in duplicato nei periodi 1 min per dare tempo sufficiente per interrompere le reazioni per tutti i campioni in un periodo di tempo esatto di 30 min.
- Aggiungere 1 mL di cloroformio per fermare la reazione e poi agitare il campione con un Vortex. Agitare il campione utilizzando un miscelatore vortex per 3 min per rimuovere la caffeina radioattiva nel solvente.
- Centrifugare i campioni a 11.000 x g per 5 min e attentamente ripristinare un volume di 900 µ l. Quindi, è possibile trasferire i campioni a scintillazione fiale.
- Evaporare il cloroformio per completare secchezza nella cappa a temperatura ambiente a 25 ° C. Aggiungere 5 mL di liquido di scintillazione al flaconcino e mescolare il campione.
- Analizzare la radioattività incorporata la caffeina in un contatore a scintillazione.
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Representative Results
Gli estratti di caffeina ottenuti tramite il processo qui presentato sono stati analizzati da TLC-densitometria sottoponendo i campioni per piastra cromatografia secondo lo schema illustrato nella Figura 1. Per quantificare i livelli di caffeina in estratti delle cellule, una curva con varie concentrazioni di standard commerciali per questo composto è stato utilizzato (Figura 2A). Il modello di assorbanza per la caffeina è stato analizzato nello spettro della luce visibile (UV-VIS) utilizzando un picco di assorbimento massimo a 273 nm (Figura 2B) e la separazione dei picchi di caffeina sulla piastra di TLC ha mostrato un Rf tra 0,34 e 0,39 (Figura 2).
L'attività della caffeina sintasi valutata usando questo protocollo indicato un'attività specifica per questo enzima di 1,2 pkat (tabella 1). L'attività di questo enzima era simile a quella riportata da altri autori che hanno utilizzato la proteina purificata.
Il primo passo prima di valutare l'espressione genica di CCS1 era l'isolamento di RNA di alta qualità. È stata valutata la qualità dell'estratto di RNA totale derivato da sospensioni cellulari, e la separazione delle subunità di rRNA 28S, 18S e 5S è stata dimostrata, che indica che il RNA Estratto da campioni era di alta qualità (Figura 3A). Tuttavia, questi estratti di RNA ha dovuto essere trattato con enzima dnasi per rimuovere la contaminazione del DNA genomico (Figura 3B), che interferisce con la preparazione di cDNA. Successivamente, qPCR è stata effettuata utilizzando il protocollo descritto in precedenza e il risultato della curva di fusione ha mostrato un prodotto di amplificazione singola per il gene dello synthase di caffeina (Figura 4).
Figura 1. Schema utilizzato per l'applicazione della caffeina estrarre campioni su un piatto di TLC. Lo schema rappresenta una dimensione di piastra di silice (6 x 10 cm) che viene utilizzata per applicare fino a otto campioni tra cui estratti di caffeina o standard. Considerare una distanza di 1 cm tra i campioni della piastra di TLC per ottenere una migliore risoluzione della separazione banda caffeina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rilevamento di caffeina da TLC-densitometria nella cella estratti di c. arabica L. (A) separazione di varie concentrazioni standard di caffeina (lane 1, 0,4; 2, 0,6; 3, 0,8; 4, 1; 5, 6 e 1,2; 1,4 µ g) e separazione delle loro cime nell'immagine sulla destra. (B) modelli di assorbanza di una caffeina standard (linea viola) e caffeina Estratto (linea verde) a lunghezze d'onda utilizzando gli spettri di assorbimento (ultravioletti e visibili). (C) separazione dei picchi di caffeina nella cella estrarre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Estrazione del RNA totale. Gli estratti di RNA delle sospensioni cellulari di c. arabica L. sono stati analizzati tramite l'elettroforesi. (A) estrazione di RNA, (duplicati di corsie 1-2); (B) campioni di RNA sottoposti a trattamento con dnasi. gel di agarosio all'1% sono stati preparati e macchiato con 3x intercalanti acido nucleico macchia soluzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Curva di fusione prodotta utilizzando qPCR software e dati RT-qPCR. La curva in rosso è un singolo prodotto amplificato che corrisponde al gene di synthase di caffeina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Pianta | Estratto proteico | Attività specifica CS | Riferimento |
| Coffea | |||
| Sospensione cellulare | Grezzo | 1,2 pkat | Questo protocollo |
| Endosperma | Purificato | 5.7 pkat | 12 |
| Tè | |||
| Foglie | Purificato | 11 pkat | 13 |
| Guarana | |||
| Semi | Purificato | 20 fkat | 14 |
Tabella 1. Confronto tra l'attività di CS-specifiche in diverse colture.
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Discussion
Vi presentiamo qui le condizioni ottimali per la valutazione del contenuto di caffeina, livelli di attività e trascrizione di CS in un in vitro pianta coltura tissutale, quali sospensioni di cellule di c. arabica. I rapporti precedenti hanno confermato che le celle mantenendo sotto irradiazione di luce e in presenza di teobromina nel terreno di coltura sono parametri adatti per aumentare il livello di caffeina, che permette di valutare i metodi di separazione di caffeina mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni di fase inversa (RP-HPLC). Attualmente, ci sono pochi rapporti che utilizzano un metodo semplice e rapido con vantaggi economici per lo studio della biosintesi di caffeina in sospensioni cellulari. Qui, una valutazione alternativa ha mostrato un metodo di separazione per la caffeina mediante TLC-densitometria, che è efficiente per l'analisi quantitativa di caffeina in estratti cellulari. Per valutare la caffeina nelle cellule, non era necessario alimentare teobromina per le cellule di cultura come riferito precedentemente14,15.
L'attività della sintasi di caffeina è stata valutata in diversi tessuti vegetali, compresi l'endosperma, foglie e semi. In questi studi, i metodi per la determinazione dell'attività della sintasi caffeina incluso un passaggio di purificazione proteina parziale che ha suggerito che era necessario utilizzare l'enzima purificato16,17. Qui, abbiamo effettuato un protocollo ottimale per lo studio dell'attività enzimatica CS usando un Estratto di proteina solubile senza la necessità di passaggi riguardanti la purificazione della proteina. Attività di CS in greggio estratto delle sospensioni di cellule può essere misurata in unità di pkat, come altri autori hanno segnalato. Abbiamo valutato i livelli di caffeina e l'attività enzimatica in foglie, e hanno livelli simili a quelli di cultura in vitro .
Infine, anche se precedenti autori hanno studiato l'espressione di caffeina sintasi, molti hanno usato coltura del tessuto differenziato6,18. La metodologia presentata qui è utile per ottenere un RNA estratto e per valutare i livelli di espressione del gene CCS1 di RT-qPCR in modelli diversi in vitro delle sospensioni di cellule vegetali, come tè e cacao.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro del nostro laboratorio è stato finanziato da una sovvenzione del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) a SMTHS. Questa ricerca è stata sostenuta anche da una borsa di studio concessa a RJPK (No. 37938) da CONACyT e il Sistema Nacional de Investigadores (4422). Gli autori ringraziano CIATEJ per l'uso dei suoi impianti durante la scrittura di questo manoscritto. Un ringraziamento speciale è estesi a Dr. Víctor Manuel González Mendoza per tutti i consigli nella sezione di biologia molecolare e Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM per le strutture durante le riprese di questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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