Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv metode for utvinning og kvantifisering av koffein i cellen suspensjoner av C. arabica L. og en eksperimentell prosess for evaluering av den enzymatiske aktiviteten av koffein syntase med hvilket uttrykk genet som kodes dette enzymet.
Abstract
Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) er et purine alkaloid i populære drikker som kaffe og te. Denne Sekundær metabolitt er ansett som en kjemisk forsvar fordi det har antimikrobielle aktivitet og regnes som en naturlig insektmiddel. Koffein kan også produsere negative allelopathic effekter som hindrer vekst av rundt planter. I tillegg bruker mennesker over hele verden koffein for sin smertestillende og stimulerende. På grunn av interesse for den teknologiske anvendelser av koffein, har forskning på den biosyntetiske sti av dette sammensatte vokst. Disse studiene har primært fokusert på å forstå de biokjemiske og molekylære mekanismene som regulerer biosyntesen av koffein. In vitro vev kultur har blitt et nyttig system for å studere denne biosyntetiske veien. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for kvantifisering av koffein og måle transkripsjon nivået av genet (CCS1) koding koffein syntase (CS) i celle suspensjoner C. arabica L. samt sin virksomhet.
Introduction
Koffein er en Sekundær metabolitt som er biosynthesized av planter av slekten Coffea1. Denne alkaloid tilhører methylxanthine familie, og regnes som kjemiske fabrikk forsvar fordi det kan fungere mot de negative effektene av patogener og planteetere2,3. I tillegg er denne metabolitten ansvarlig for egenskapene stimulerende kaffe drikke, som vanlig forbrukt verdensomspennende4,5. På grunn av sine egenskaper, er flere forskningsgrupper interessert i å studere biosyntetiske veien og katabolisme koffein6,7. Foreløpig tjene anlegget i vitro cellen/vev kulturer som et alternativ for å vurdere koffein akkumulering under ulike biotiske og abiotiske strategier8,9.
Koffein biosyntesen innebærer hydrolytisk utgivelsen av 7-methylxanthine fra den tilsvarende ribose nukleosid etterfulgt av bestilte N-methylations posisjoner 3 og 1. En bestemt S- adenosyl metionin (SAM)-avhengige N-methyltransferase (NMT) gir metylering i posisjon 7, mens theobromine syntase (TS) og CS er involvert i den 3 - og 1-methylations, henholdsvis produsere theobromine og koffein. Studiet av gener som koder distinkte NMTs har tillatt forstå mekanismen som regulerer koffein produksjon10,11. CS, som har Nmethyltransferase aktivitet, gir de to siste trinnene av biosyntetiske veien koffein11. I kaffe treet planter, har det vært vist at lys stråling kan øke CS aktivitet, som resulterer i en økning i koffein biosyntesen. Nylig viste vi at vedlikehold av cellen suspensjoner av C. arabica L. under lys bestråling er den optimale tilstanden for evaluering av virkningene som produserer abiotiske stress faktorer påvirker biosyntetiske veien koffein8. Informasjonen i disse studiene kan ha programmer i metabolske engineering og systemer biologi for å maksimere studiet av koffein biosyntetiske veien i slike in vitro -systemer.
Gitt fordelene ved å få en passende modell for studiet av koffein biosyntesen, optimalisert vi utvinning vilkårene for koffein på cellen suspensjoner av C. arabica L. Det var også mulig å utvikle en nyttig protokoll for å studere den enzymatiske aktiviteten samt metodologiske trinn for å vurdere nivået på genet transkripsjoner av Coffea koffein syntase 1 (CCS1) koding Dette enzymet. Her, rapportere vi en protokoll for å trekke ut og kvantifisere koffein i C. arabica celle suspensjoner av tynne lag kromatografi og densitometry (TLC-densitometry).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koffein utvinning i cellen suspensjoner av C. arabica L.
- Bruke C. arabica celle suspensjoner9. Vedlikehold av suspensjon av annenhver uke subkulturer i Murashige og Skoog medium ved pH 4.3 med konstant 100 rpm risting ved 25 ° C under kontinuerlig lys (8.3 W/m2).
- Høste celler under vakuum filtrering ved hjelp av 11 µm pore filterpapir og Buchner trakt.
- Registrere frisk vekten av det avhentet celler med en skala, pakk dem i aluminiumsfolie, fryse dem i flytende nitrogen og holde dem ved-80 ° C før analysen.
- Lyophilize frosne mobilnettet materialet 72 h.
- Registrere vekten av lyofilisert cellene for å anslå tørrvekt avkastningen.
- Lagre pulverisert materialet i gjenbrukbare polyetylen poser (9 cm x 7,5 cm). Macerate materialet til et fint pulver og oppbevar i en desiccator før bruk.
- Måle 0,5 g tørr mobilnettet saken på analytisk skala og legge den til en glass kolbe (25 mL).
- Tilsett 10 mL aceton til lyofilisert cellene og bland i en vortex blandebatteri for 30 s homogenisering. Deretter forsegle kolbe med aluminiumsfolie.
- Bland på 100 rpm bruker et rotator ved romtemperatur (25 ° C) for 5 h.
- Overføre alt materiale til en 15 mL konisk rør og sentrifuge 13.000 x g for 10 min. overføring væske fase til en ny tube og redusere det tørr ved romtemperatur i avtrekksvifte.
- Resuspend prøven med 25 µL av acetone.
2. betingelser for vurdering av koffein av tynne lag kromatografi (TLC)-Densitometry
- Bruke 1 µL av tidligere resuspended koffein ekstraktet på den stasjonære fasen.
Merk: Silica gel plater (F254) brukes som stasjonære fasen. Tidligere anvender prøvene, platene ble utviklet med 10 mL kloroform-metanol [9:1 v/v] i en kromatografi kammer (14 cm x 12 cm x 9,5 cm), og platene var tørket ved romtemperatur. Karakteristikkene av brukt kromatografiske platen der eksemplene brukes er vist i figur 1. Kammeret var mettet i 30 min med løsemiddel før utvikling av platen. TLC platene skal håndtere bruke hansker for å unngå forurensning. - Utvikle TLC i kromatografi kammer med 10 mL mobile fasen cyclohexane-aceton [40:50 v/v].
Merk: Denne blandingen tillater separasjon av koffein på en oppbevaring faktor (Rf) på 0,34.- Fjern TLC platen fra kammeret og la det tørke i romtemperatur.
- Visualisere koffein band i kort bølgelengde ultrafiolett lys (UV, 254 nm). Bruk en kompakte UV-lampe. I tillegg for dette trinnet, bruk beskyttelsesbriller med UV-beskyttelse.
- Kvantifisere koffein nivåer av densitometry på 273 nm. Apparatet er kontrollert med kromatografi programvare.
3. ribonukleinsyre (RNA) isolasjon
- Ta av cellen suspensjon fra trinn 1.1 og vakuum filtratet med filter papir (11 µm porestørrelse).
- Samle mobilnettet materialet fra filter papir, veie ut 0,5 g cellular materiale på en analytical balanse og Pakk den i aluminiumsfolie. Fryse prøven med flytende N2.
- Macerate celle prøven i en porselen morter med flytende nitrogen og tilsett 1 mL av RNA isolasjon reagens til homogenisert.
Merk: Sterilisere porselen mørtel i en dempe ovn ved 300 ° C for 6 h. RNA isolasjon reagens inneholder fenol, guanidine isothiocyanate og andre komponenter.- Overføre 500 µL av utvalget til et sterilt microcentrifuge rør (1,5 mL). Legg 300 µL kloroform-isoamyl alkohol (24:1) og 300 μL equilibrated fenol (pH 8.0).
- Bland prøven med en vortex mikser og deretter virvel det 20.000 x g i 15 min på 4 ° C.
- Overføre 300 μL av øvre fasen slik microcentrifuge. Tilsett 200 μL av isopropanol. Inkuber røret 1t på 20 ° C.
- Sentrifuge røret på 12.000 x g i 10 min på 4 ° C, og deretter Dekanter flytende fase.
- Legg 1 mL av etanol (70%) til å danne pellets i røret. Sentrifuge 12.000 x g i 10 min og Dekanter. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Tørr utvalget for 1,5 t ved romtemperatur (25 ° C). Resuspend RNA ekstrakt med 25 μL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann.
Merk: For RNA utvinning, bruke vann behandlet med 0,1% DEPC v/v.
4. inkubasjon i RNA utskrift med Deoxyribonuclease (DNase)
- I et sterilt microcentrifuge rør, legge 2 µg av totale pakke. Tilsett 1 μL 10 x reaksjon bufferen (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Tilsett 1 μL av 1 U/µL DNase.
- Bringe reaksjonen til et endelig antall 10 μL med DEPC-behandlet vann. Bland utvalg og sentrifuge kort på 2000 x g for 1 min.
- Inkuber prøven på 37 ° C i 30 min.
- Stopp reaksjon med tillegg av 1 μL 50 mM disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (Na2EDTA) og ruge prøven ved 65 ° C i 10 min.
- Analysere integriteten av det ved agarose gel geleelektroforese.
- Forberede en standard 1% agarose gel og flekk det med 1 µL av 3 x intercalating nukleinsyre flekk løsning.
- Bruke 500 ng av til agarose gel og kjøre gel.
- Visualisere integriteten til RNA bruker gel Foto dokumentasjon system.
- Bruker RNA som mal for cDNA syntese av revers transkriptase.
5. utfyllende deoksyribonukleinsyre (cDNA) syntese
- Legge til 2,5 μg av totale slik microcentrifuge. Tilsett 1 μL av oligo-deoxythymine (dT) primer og fylle røret til et 13 μL siste volum med nuclease uten vann. Bland prøven, og deretter virvel en 2000 x g for 1 min.
- Inkuber prøven på 65 ° C i 5 minutter og deretter på 4 ° C i 2 minutter.
- Tilsett 4 μL av 5 x reaksjon bufferen for revers transkriptase, 2 μL av deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) (10 mM av hver dNTP) og 1 μL revers transkriptase (200 U/µL). Bland forsiktig og sentrifuge 2000 x g for 1 min.
- Inkuber prøven på 45 ° C i 50 min og deretter på 70 ° C i 10 min.
- Kvantifisere cDNA konsentrasjonen med en UV spektrofotometeret.
- Bruk av cDNA som mal for polymerasekjedereaksjons (PCR).
Merk: Reaksjon bufferen ble brukt som 10 x (trinn 4.1.1) og 5 x ganger konsentrert (trinn 5.3), henholdsvis.
6. sanntid kvantitative PCR (qPCR) å forsterke Gene CCS1
- Legg 7,5 μL Taq DNA polymerase 2 x (0,1 U/mL) og 0,1 μM av 5-carboxy-X-rhodamine (ROX) til en PCR microcentrifuge tube.
Merk: Den varmt start Taq DNA polymerase 2 x ble brukt som en løsning 2 x konsentrert.- Tilsett 5 μL av nuclease-fritt vann.
- Tilsett 0,75 μL hver av 10 μM forover og bakover grunning å forsterke genet CCS1 (AB086414) (frem: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3 "og omvendt: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3"). Bruke primere for tubulin som vaktmester genet i en egen reaksjon (frem: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3 "og omvendt: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3")9.
- Legge til 600 ng cDNA mal.
- Utføre forsterkning reaksjonen på 50 ° C for 2 min og 95 ° C i 5 min. ruge reaksjonen i sanntid PCR systemet for 40 sykluser 95 ° c for 30 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C for 30 s.
- Inkuber prøven ved 50 ° C for 30 s og 20 ° C for 10 s.
- Analysere data med PCR programvaren.
- Beregne relative uttrykket av 2-ΔΔCT metoden beskrevet av Livak og Schmittgen (2001)12.
Merk: Analysere en kontroll reaksjon som inneholder alle komponenter unntatt DNA malen (mal kontroll NTC) Forkast forurenset reagenser eller forsterkning primer-dimers.
7. total Protein ekstrakt av cellen suspensjoner av C. arabica L.
- Filtrere celle suspensjoner under vakuum med middels-pore filter papir.
- Veie 1 g cellular materiale og Pakk den i aluminiumsfolie.
- Fryse prøven med flytende nitrogen. Macerate prøven i en sterilisert porselen morter å få et fint pulver.
- Overføre prøven til et hetteglass og legge 2,5 mL av utvinning buffer (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydroklorid (Tris-HCl), ved pH 8.0, som inneholder 10 mM β-mercaptoethanol, 5 mM Na2EDTA og 0,5% (w/v) natrium ascorbate.
- Bland eksemplet i en vortex mikser i 2 minutter.
Merk: Det er viktig at prøven holdes på is å hindre protein rødsprit.
- Bland eksemplet i en vortex mikser i 2 minutter.
- Sentrifuge prøven på 20.000 x g for 20 min på 4 ° C og overføre 500 µL dele i Kryogenisk ampuller (2 mL). Lagre prøver-72 ° c før bruk.
- Måle protein konsentrasjonen av prøven på 562 nm i et spektrofotometer med bicinchoninic syre analysen med bovin serum albumin som standard.
8. enzymatisk analysen for koffein syntase
- Forbered en reaksjonen blanding i et microcentrifuge rør som inneholder 200 µM SAM, 4.07 kBq av methyl [3H]-SAM, 200 µM theobromine, 200 µM MgCl2og 5 µM koffein. Øk volumet til 200 µL med 100 mM Tris-HCl på en pH på 8.0.
- Hold microcentrifuge røret på is og Legg til et volum i løselig brøken inneholder 7-9 mg protein. Deretter blande av vortex og ruge i 30 min på 30 ° C i en termostatstyrt bad/Sirkulator. Med flere prøver flere, ruge hvert utvalg i duplikat i 1 min perioder å gi nok tid til å stoppe reaksjonene for alle prøvene i en nøyaktig tidsperiode 30 min.
- Legg 1 mL av kloroform stoppe reaksjonen og deretter riste prøven med en vortex mikser. Riste prøven med en vortex blandebatteri for 3 min for å fjerne radioaktivt koffein i løsemiddelet.
- Sentrifuge prøver 11.000 x g i 5 min og nøye gjenopprette et volum på 900 µL. Deretter overføre prøvene til scintillation ampuller.
- Fordampe kloroform å fullføre tørrhet i panseret ved romtemperatur ved 25 ° C. Legg 5 mL scintillation væske til ampullen og bland prøven.
- Analysere radioaktiviteten innlemmet i koffein i en scintillation teller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Koffein utdrag Hentet via prosessen presenteres her ble analysert av TLC-densitometry ved å utsette prøvene til platen Ture i henhold til ordningen som vist i figur 1. Å kvantifisere nivåer av koffein i cellen ekstrakter, en kurve med ulike konsentrasjoner av kommersielle standard for denne forbindelsen ble brukt (figur 2A). Mønsteret av absorbansen for koffein var analysert i det synlige lyse spekteret (UV-VIS) med en maksimal absorpsjon topp på 273 nm (figur 2B), og topp separasjon av koffein på TLC plate viste en Rf mellom 0,34 og 0,39 (figur 2C).
Aktiviteten av koffein syntase vurdert denne protokollen indikerte en bestemt aktivitet for dette enzymet av 1,2 pkat (tabell 1). Denne enzymaktiviteten var lik som rapportert av andre forfattere som brukte renset protein.
Det første trinnet før CCS1 gene uttrykket evalueres var isolering av høy kvalitet RNA. Kvaliteten på utdrag av den totale avledet fra cellen suspensjoner ble vurdert, og separasjon av 28S, 18S og 5S rRNA underenheter ble demonstrert, som indikerer at RNA utvunnet fra prøvene var av høy kvalitet (figur 3A). Men måtte disse RNA ekstrakter behandles med DNase enzym fjerne genomisk DNA forurensning (figur 3B), som forstyrrer utarbeidelsen av cDNA. Deretter ble qPCR utført ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, og resultatet av smelte kurven viste et enkelt forsterkning produkt for koffein syntase genet (Figur 4).
Figur 1. Metode som brukes for anvendelse av koffein trekke ut eksempler på en TLC plate. Ordningen viser en silica plate dimensjon (6 x 10 cm) som brukes til å angi opptil åtte prøver inkludert koffein ekstrakter eller standarder. Vurdere en avstand på 1 cm mellom prøvene i TLC plate å få bedre oppløsning av koffein bandet separasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Påvisning av koffein av TLC-densitometry i celle uttrekk av C. arabica L. (A) separasjon av ulike koffein standard konsentrasjoner (lane 1, 0.4; 2; 3, 0,6 0,8; 4, 1, 5, 1,2, og 6, 1,4 µg) og separasjon av sine topper i bildet til høyre. (B) absorbans mønstre av koffein standard (lilla linje) og koffein trekke (grønn linje) ved forskjellige bølgelengder bruker absorpsjon spectra (ultrafiolett og synlig). (C) topp separasjon av koffein i cellen ekstra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Utvinning av den totale RNA. RNA ekstrakter av mobilnettet suspensjoner av C. arabica L. ble analysert av geleelektroforese. (A) RNA utvinning, (baner 1-2 dubletter); (B) RNA prøver utsatt for behandling med DNase. 1% agarose gels var forberedt og farget med 3 x intercalating nukleinsyre flekk løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Smeltende kurve produsert ved hjelp av qPCR programvare og RT-qPCR data. Kurven markert i rødt er ett forsterket produkt som tilsvarer koffein syntase genet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Anlegget | Protein ekstrakt | CS aktiviteten | Referanse |
| Coffea | |||
| Cellen suspensjon | Råolje | 1.2 pkat | Denne protokollen |
| Endosperm | Renset | 5.7 pkat | 12 |
| Te | |||
| Blader | Renset | 11 pkat | 13 |
| Guarana | |||
| Frø | Renset | 20 fkat | 14 |
Tabell 1. Sammenligning av CS-spesifikke aktiviteten i ulike vekster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer her de optimale forholdene for å vurdere koffein innhold, CS aktivitet og transkripsjon nivåer i en i vitro plante vev kultur, for eksempel celle suspensjoner av C. arabica. Tidligere rapporter har bekreftet at opprettholde celler under lys bestråling og i nærvær av theobromine i kultur medium er passende parametere for å øke nivået av koffein, gjør det mulig å evaluere metodene koffein separasjon bruker omvendt-fase høyytelses flytende kromatografi (RP-HPLC). Foreløpig er det noen rapporter som bruker en enkel og rask metode med økonomiske fordeler for å studere koffein biosyntesen i cellen suspensjoner. Her en alternativ vurdering viste et skille metode for koffein bruker TLC-densitometry, som er effektive for kvantitativ analyse av koffein i cellen ekstrakter. For å evaluere koffein i cellene, var det ikke nødvendig å mate theobromine til kultur cellene som rapportert tidligere14,15.
Koffein syntase aktivitet er evaluert i flere anlegg vev, inkludert endosperm, blader og frø. I disse studiene inkludert metoder for fastsettelse av koffein syntase aktivitet et skritt i delvis protein-rensing som antydet at det var nødvendig å bruke renset enzym16,17. Her utført vi en optimal protokoll for studier av CS enzymatiske aktiviteten bruker en løselig protein pakke uten behov for foranstaltningene innvolvere rensing av protein. CS aktivitet i rå ekstrakt av cellen suspensjoner kan måles i enheter av pkat, som andre forfattere har rapportert. Vi vurdert koffein nivåer og enzymatiske aktiviteten i blader, og de har samme nivå de i i vitro kultur.
Til slutt, selv om tidligere forfattere har studert uttrykket av koffein syntase, har flere brukt differensiert vev kultur6,18. Metodene som presenteres her er nyttig å få en RNA ekstrakt og evaluere uttrykk nivåene av genet CCS1 av RT-qPCR i forskjellige i vitro modeller av anlegget celle suspensjoner, som kaffe og kakao.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet med vårt laboratorium ble finansiert av en bevilgning fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) til SMTHS. Denne forskningen ble også støttet av et fellesskap gitt til RJPK (nr. 37938) av CONACyT og Sistema Nacional de Investigadores (4422). Forfatterne takker CIATEJ for bruk av installasjonene under skriving av dette manuskriptet. Spesiell takk er utvidet til Dr. Víctor Manuel González Mendoza for alle anbefalinger i molekylærbiologi delen og Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM for fasiliteter under filmingen av denne artikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
