Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto
Summary
La electroporación es un enfoque efectivo para entregar genes de interés en las células. Al aplicar este enfoque en vivo en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto (DRG), se describe un modelo para el estudio de la regeneración del axón en vivo.
Abstract
La electroporación es un enfoque de transfección de genes no virales esenciales para introducir ADN plásmidos o pequeñas moléculas de ARN en células. Una neurona sensorial en el ganglio de raíz dorsal (GRD) extiende un solo axón con dos ramas. Una rama va al periférico del nervio (rama periférica) y la otra rama entra en la médula espinal a través de la raíz dorsal (rama central). Después de la lesión neuronal, la rama periférica regenera robusta mientras que la rama central no se regenera. Debido a la gran capacidad regenerativa, regeneración del axón sensorial ha sido ampliamente utilizada como un sistema modelo para estudiar la regeneración del axón mamífero en sistema nervioso periférico (PNS) y sistema nervioso central (SNC). Aquí, describimos un protocolo de acercamiento previamente establecido para manipular genes en neuronas sensoriales maduras en vivo a través de electroporación. Basado en la transfección con plásmidos o pequeño oligos de RNA (siRNAs o microRNA), el enfoque permite para que ambos experimentos de pérdida y ganancia de función estudiar el papel de los genes de interés o microRNA en regulación de la regeneración de axones en vivo. Además, la manipulación de la expresión génica en vivo puede ser controlada tanto espacial como temporal dentro de un curso de tiempo relativamente corto. Este sistema de modelo constituye una herramienta única para investigar los mecanismos moleculares que regeneración del axón mamíferos es regulado en vivo.
Introduction
Lesiones del sistema nervioso causaron por un traumatismo neural o diversas enfermedades neurodegenerativas generalmente son el resultado de defectos en las funciones de motor, sensoriales y cognitivas. Recientemente, se ha dedicado mucho esfuerzo al restablecimiento de potencia regenerativa en neuronas adultas para restaurar la functionsof fisiológica herido las neuronas1,2,3. Las neuronas sensoriales en el DRG son un grupo de células nerviosas que transmiten diferentes estímulos sensoriales, tales como dolor, temperatura, tacto o postura del cuerpo, al cerebro. Cada uno de estas neuronas seudo unipolar y contiene un único axón que se bifurca con una rama que se extiende hacia la periferia y la otra rama hacia la médula espinal4. Las neuronas sensoriales adultos en DRGs son entre unas neuronas maduras de mamíferas conocidas para regenerar sus axones activamente después de la lesión. Por lo tanto, lesiones de los axones sensoriales han sido ampliamente utilizados como un modelo fundamental para el estudio de los mecanismos de regeneración axonal en vivo.
En vivo técnicas de transfección génica, que son generalmente menos desperdiciador de tiempo configurar y más flexible que el uso de animales transgénicos, han jugado papeles esenciales en el estudio de las funciones de genes y señalización de vías en el sistema nervioso. Las principales técnicas pueden dividirse en dos enfoques: instrumento y virus5. Viral basado en vivo entrega de genes en neuronas adultas puede proporcionar precisa manipulación espacio-temporal de gene expresión6. Sin embargo, procesos que requieren mucho trabajo participan en métodos basados en virales, tales como la producción y purificación de partículas virales que contiene el gen deseado. Además, muchos vectores virales podrían activar el sistema inmune del huésped, que puede interferir con la adquisición de datos, análisis de datos y posiblemente confundir la interpretación de resultados experimentales. Electroporación, un enfoque basado en el instrumento típico de la transfección, utiliza un impulso eléctrico para aumentar la permeabilidad celular y las membranas nucleares transitoriamente, que favorece la afluencia de vectores del gene o pequeño RNA oligos de espacio fuera de las células7 . Electroporación in vitro es reconocida ampliamente como una estrategia transitoria pero muy eficiente para manipular la expresión de genes específicos en muchos tipos celulares. Aunque en vivo electroporación sólo conduce a la expresión génica transitoria con baja eficiencia de transferencia en comparación con vectores virales, tiene diversas ventajas sobre enfoques virales. Por ejemplo, se puede aplicar a casi todas las células y tejidos7,8,9. Además, ambos plásmidos que codifican genes de interés o pequeños RNA oligos (p. ej., siRNAs, microRNA) contra ciertas transcripciones pueden ser inyectados directamente en el tejido de la blanco y entonces pulsados eléctricamente, que hacer el procedimiento menos mano de obra – y tiempo – consumiendo. Además, es posible transfectar múltiples plásmidos y RNA oligos simultáneamente con electroporación sola.
Hemos establecido un método de electroporación en vivo para manipular genes en neuronas sensoriales de ratón adulto y aplicado con éxito y validado dicho enfoque en numerosos estudios pioneros de1,2,3 ,8,10. Aquí, presentamos un protocolo detallado para facilitar el uso de este enfoque para futuros estudios de la regeneración del axón mamífero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios pasos quirúrgicos requieren especial atención. La L4 y L5 DRGs (localización del Soma), que dominan el nervio ciático, necesitan ser correctamente identificados e inyectado con construcciones de genes. De lo contrario, el etiquetado de GFP estará ausente en los axones del nervio ciático. Las crestas ilíacas pueden verse como puntos de referencia anatómicas útiles localizar L4 y L5 GRD. En la mayoría de ratones, empalme entre las vértebras L5 y L6 de la faceta es proximal a las crestas ilíacas<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue financiado (otorgado a F-Q. Z.) por NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), la Fundación Craig H. Neilsen y la BrightFocus Foundation.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
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