Summary
Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.
Abstract
Electroporation 세포로 DNA 플라스 미드 또는 작은 RNA 분자를 소개 하는 필수적인 비 바이러스 성 유전자 transfection 접근 이다. 지 루트 신경 절 (Drg)에 감각 신경 두와 단일 축 삭을 확장합니다. 1 개 분 지가 주변 신경 (주변 지점), 그리고 다른 지점 입력 지 루트 (중앙 지점)를 통해 척수. 신경 손상 후 주변 지점 중앙 지점에 다시 생성 하지 않습니다 반면 견고 하 게 재생성 합니다. 높은 재생 능력으로 인해 감각 축 삭 재생 널리 사용 되었습니다 모델 시스템으로 서 말 초 신 경계 (PNS)에 중앙 신경 조직 (CNS) 포유류 축 삭 재생을 공부. 여기, 우리는 성숙한 감각 뉴런에서 vivo에서 electroporation 통해 유전자 발현 조작 하 이전 설립된 접근 프로토콜을 설명 합니다. Transfection 플라스 미드 또는 작은 RNA oligos (siRNAs 또는 microRNAs)을 바탕으로, 접근 방식 모두 손실 및 이득-의-기능 실험 연구 관심사의 유전자 또는 축 삭 재생 비보의 규제 microRNAs의 역할을 수 있습니다. 또한, 유전자 표현에 vivo에서 의 조작 제어할 수 있습니다 공간 및 일시적으로 비교적 짧은 시간 과정 내에서. 이 모델 시스템은 포유류 축 삭 재생 규제 vivo에분자 메커니즘을 조사 하는 독특한 도구를 제공 합니다.
Introduction
신경 외상으로 인 한 신 경계에서 부상 또는 다양 한 신경 퇴행 성 질환은 보통 모터, 감각 및 인지 기능에 결함에 결과. 최근, 많은 노력 복원 생리 functionsof 부상 신경1,2,3성인 신경 재생 효능 다시 설립에 헌신 하고있다. DRG에 감각 신경은 통증, 온도, 터치, 또는 몸 자세, 뇌 등 다른 감각 자극을 전달 하는 신경 세포의 클러스터. 이러한 뉴런의 각각 의사 유 니 폴라 이며 주변으로 확장 한 분기와 척수4향하고 다른 분기를 분기 하는 단일 축 삭을 포함 합니다. Drg의 성인 감각 신경 세포는 부상 후 적극적으로 그들의 축 삭을 재생성 하기 위해 알려진 몇 가지 성숙한 포유류 뉴런 중입니다. 따라서, 감각 축 삭의 상해는 광범위 하 게 고용 되었다 중요 한 모델로 axonal 재생 비보의 메커니즘을 연구.
Vivo에서 유전자 transfection 기법, 일반적으로 덜 설정 시간과 유전자 변형 동물을 사용 하 여 보다는 유전자의 기능을 공부 하 고 신 경계에 경로 신호에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 주요 기술 두 가지 방법으로 분류 될 수 있다: 악기 및 바이러스 기반5. 성인 신경 세포에 유전자 배달 vivo에서 바이러스 성 기반 유전자 식6의 정확한 spatiotemporal 조작을 제공할 수 있습니다. 그러나, 노동 집약적인 프로세스는 바이러스-기반 방법, 생산 등 원하는 유전자를 포함 하는 바이러스 성 입자의 정화에서에서 포함 된다. 또한, 많은 바이러스 성 벡터 데이터 수집, 데이터 분석을 방해 하 고 실험 결과의 해석 가능성이 오해 수 있습니다 호스트의 면역 시스템을 활성화 수 있습니다. Electroporation, 일반적인 악기에 기초를 둔 transfection 접근 유전자 벡터 또는 세포7 외부 공간에서 작은 RNA oligos의 호의 정도, 세포와 핵 막의 침투성을 증가 하는 전기 펄스를 사용 하 여 . 생체 외에서 electroporation 널리 많은 세포 유형에 타겟된 유전자 발현을 조작 하기 위한 과도 하지만 매우 효율적인 전략으로 인식 된다. Vivo에서 electroporation만 일시적인 유전자 발현 바이러스 성 벡터에 비해 낮은 transfecting 효율 리드, 바이러스 접근 다양 한 장점이 있다. 예를 들어, 그것은 거의 모든 조직 및 세포7,,89에 적용할 수 있습니다. 또한, 특정 성적 증명서에 대 한 관심사의 유전자 또는 작은 RNA oligos (예: siRNAs, microRNAs) 인코딩 중 플라스 미드 대상 조직에 직접 주입 하 고 수 다음 전기적 펄스, 절차 하 게 하는 더 적은 노동-고 시간-소모입니다. 또한, 여러 개의 플라스 미드 및 단일 electroporation와 동시에 RNA oligos transfecting 가능 하다.
우리 성인 마우스 감각 신경 세포에 유전자 발현 조작 하 비보에 electroporation 접근 설립 및 성공적으로 적용 하 고 수많은 개척자 연구1,2,3 같은 접근 검증 ,8,10. 여기, 우리 포유류 축 삭 재생의 미래 연구를 위한이 방법의 사용을 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시.
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Protocol
모든 동물 실험 동물 프로토콜 존스 홉킨스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 재료 및 시 약
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동물
- 6 주 된 여성 CF1 쥐 실험에 대 한 30-35 g의 무게를 사용 합니다.
참고: 쥐 그룹 보관 (5 쥐 감 금 소 당) 1/4"옥수수 옥수수 속 침구와 2" 광장 nestlets 중첩에 대 한 개별적으로 통풍이 소독 장에 있었다. 감 금 소 제어 12 h 빛 어두운 주기의 유지 되었다 그리고 실내 온도 19.4 ° C와 25 ° C 사이 생쥐는 글로벌 설치류 다이어트와 시스템을 공급 하는 자동 물 먹이 했다.
- 6 주 된 여성 CF1 쥐 실험에 대 한 30-35 g의 무게를 사용 합니다.
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악기
- 다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여 효율적으로 수술을 실시: 일회용 주사기 (27 G, 1.0 mL) 복 주입, 클리퍼, 스테레오 해 부 현미경, 마이크로 수술 집게, 마이크로 수술이 위, 그리고 작은 뼈 rongeurs 모피 그리고 소독된 직 스폰지입니다.
참고: 모든 악기와 자료는 수술 전에 압력가 또는 생산자에 의해 전 멸 균. 수술 동안 악기 75% 알코올 살 균을 유지 하기 위해 뿌리는.
- 다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여 효율적으로 수술을 실시: 일회용 주사기 (27 G, 1.0 mL) 복 주입, 클리퍼, 스테레오 해 부 현미경, 마이크로 수술 집게, 마이크로 수술이 위, 그리고 작은 뼈 rongeurs 모피 그리고 소독된 직 스폰지입니다.
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마 취 솔루션
- 마 취 솔루션 # 1을 사용 하 여 마 취 유도 및 DRG 주입 하기 전에 마 취 솔루션 # 2를 사용 하 여 마 취를 유지.
- 마 취 솔루션 # 1을 하려면 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1.2 mg/mL의 최종 농도에 멸 균 식 염 수에 희석.
- 마 취 솔루션 # 2을 하려면 avertin 20 mg/mL의 최종 농도에 멸 균 식 염 수에 희석.
- 마 취 솔루션 # 1을 사용 하 여 마 취 유도 및 DRG 주입 하기 전에 마 취 솔루션 # 2를 사용 하 여 마 취를 유지.
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플라스 미드 DNA 및 RNA Oligos
- 따라 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 준비 합니다. 플라스 미드 DNAs 2.0 µ g / µ L의 농도에 살 균 이온된 수에 희석.
- 0.005-0.01의 최종 농도 도달 빨리 녹색 염료 솔루션 추가 % (v/v) 주입 중 DRG 개요의 더 나은 시각화.
- 최종 농도 50 µ M에 도달 하는 제조사에서 제공 하는 해당 버퍼에 siRNA 또는 예측에 관한 oligos을 디졸브.
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마이크로 주입 피 펫
- 당겨 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 모 세관 유리 하 고 미세가 위는 대략 50 µ m 외부 직경으로 개방을 생성 하기 위해 가져온된 모 세관 유리 피 펫의 끝을 잘라. 다음 약 20-30 분 동안 깨끗 한 벤치에 UV 빛에서 유리 피 펫을 살 균.
- 멸 균된 유리 피 펫 피 펫 홀더에 세포내 microinjection에 연결 하는 마운트 시스템을 분배. 30 psi의 압력 및 기간 8 ms에서 microinjection 시스템의 매개 변수를 설정 합니다.
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Electroporation 시스템
- 구형 파 electroporation 시스템에 전극을 연결 하 고 다음 매개 변수를 설정: electroporation 비보에 대 한 950 ms 간격 35 V 15 ms 펄스.
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관류 및 솔루션을 해결
- 1 x 4% (w/v)의 농도에 PBS에 paraformaldehyde (PFA) 분말을 용 해. 4 ° c.에 PFA 솔루션 저장
2. 실험 절차
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L4 그리고 L5 Drg의 외과 노출
- 마 취 솔루션 #1 이전 (와 케 타 민 100 mg/kg 몸 무게 xylazine 12 mg/kg 체중) 준비의 복 주사를 사용 하 여 마우스 anesthetize
- 털 깎기로 외과 영역을 면도.
참고: 왼쪽된 좌 골 신경 호감에 대 한 다른 수술 될 것입니다, 이후 왼쪽된 후부 허벅지의 모피 수 있습니다 수 면도 동시에. - 열띤된 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓고 온도 프로브와 직장 온도 모니터링 합니다.
- 마 취를 테스트 하려면 발가락과 마우스의 꼬리를 꼬 집 고 행동 반응 관찰.
- 코르크 판에서 마우스의 4 개의 사지를 테이프.
- 외과 영역을 iodophor 솔루션 그리고 피부를 절단 하기 전에 iodophor 제거 하려면 75% 알코올로 닦아냅니다.
- 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 절 개를 하기 전에 좋은 마커 펜으로 장 골 볏의 양쪽 모두를 표시 합니다. L5 Drg의 위치 식별 용이 하 장 골 볏의 두 점을 연결 하는 선을 그립니다.
- 마이크로-가 위 낮은 뒤로의 중간 선 따라 3cm 절 개를 확인 합니다. 또한, paraspinous 근육 생쥐 multifidus 등 생쥐 longissimus lumborum S1 spinous 프로세스, L3에서 분리 하 고 L4-5와 L5-6의 패싯 관절을 노출.
- L4-5와 L5-6의 패싯 관절을 제거 하는 마이크로-rongeur를 사용 합니다. 또한, L4 및 L5는 Drg의 등 쪽 노출의 왼쪽된 신경 아치를 제거 합니다.
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DRG 주입
- 주입 마 취 솔루션 #2 (200 mg/kg 몸 무게 avertin) DRG 주입 하기 전에 마 취를 유지 하는 것을 intraperitoneally.
- 유리 모 세관 피 펫에 플라스 미드 DNA 또는 RNA oligos (DRG 당 1 µ L)를 로드 합니다.
- 신중 하 게는 DRG에 모 세관 유리 피 펫의 끝을 삽입 합니다.
- 점차적으로 삽입 DNA 플라스 미드의 1.0 µ L 솔루션 또는 세포내 microinjection를 사용 하 여 DRG에 RNA oligos 분배 시스템 (30 psi, 8 ms).
참고: 주사의 지속 시간 5 분 이상 지 속해야 한다.
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Electroporation
- 전극의 팁에 PBS를 드롭.
- 멸 균된 평방 면 거 즈와 출혈 정리.
- 부드럽게 전극과 대상 DRG를 꼬 집으 십시오 고 electroporation 시스템 5 사각 전기 펄스를 적용 합니다.
- 근육과 피부 레이어 각각 5-0 나일론 봉합을 닫습니다.
- 그것은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 세심 한 관심 아래 온수 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓습니다. 후 마 취에서 완전히 복구는 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
참고: 마우스를 37 ° C 담요에 마 취에서 완전히 복구에 대 한 약 60 분 소요 됩니다. 수술 후 통증 완화를 매일 먹이 대 한 1000 ml 물 (0.2 mg/ml)로 1 알 (200mg)이 부 프로펜을 디졸브.
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좌 골 신경 호감
- (실험 설계)에 따라 2 ~ 3 일 후에 DRG electroporation 마우스 마 취 솔루션 #2 (400 mg/kg 몸 무게 avertin)와 intraperitoneally anesthetize.
- 코르크 판에서 마우스의 4 개의 사지를 테이프.
- 중간 선 따라 왼쪽에 1cm 절 개를 0.5 c m를 확인 합니다. 경도 대 둔 근 근육과 piriformis 근육, 등 근육을 잘라. 큰 좌 골 구멍 및 좌 골 노치 사이 좌 골 신경의 세그먼트를 표시 합니다.
- 호감 12 s와 마크는 10-0 나일론 epineural 봉합으로 호감 사이트에 대 한 미세 집게와 신경. 호감 사이트를 표시 하는 경 막 막에 매듭을 만듭니다.
- 5-0 나일론 봉합 근육과 피부 레이어를 닫습니다.
- 그것은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 세심 한 주의와 온수 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓습니다. 후 마 취에서 완전히 복구는 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
참고: 마우스를 37 ° C 담요에 마 취에서 완전히 복구에 대 한 약 60 분 소요 됩니다. 수술 후 통증 완화를 매일 먹이 대 한 1000 ml 물 (0.2 mg/ml)로 1 알 (200mg)이 부 프로펜을 디졸브.
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마우스 관류, DRG와 좌 골 신경 수확
- 좌 골 신경 후 2 ~ 3 일 (실험 설계)에 따라 호감, 마 취 솔루션 # 2와 intraperitoneally 마우스를 anesthetize.
- 뒤에 PBS에 얼음 4 %paraformaldehyde (PFA) (pH 7.5) PBS (pH 7.4)와 마우스 transcardially perfuse
- 관류, 후 마이크로 위 및 해 부 현미경 아래 마이크로 포 셉으로 신경 뿌리 및 좌 골 신경 무릎 앞 Drg을 신중 하 게 구분 합니다. 좌 골 신경 4% PFA 4 ° c.에서 하룻밤에 직접 배치
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이미징 및 측정 형광 표시 감각 축 삭
- 연결 된 조직 및 마이크로 위 및 해 부 현미경 아래 신중 하 게 마이크로 포 셉 고정된 좌 골 신경에 막 떨어져 스트립. 다음, 4% 교환 PBS와 세척 PFA 신경 3 번.
- 좌 골 신경을 슬라이드에 놓고 그것을 똑바로 유지 합니다. 그것에 coverslip 누워 다음 신경 주위 antifade 솔루션의 80 µ L를 추가 합니다. 압력을 가진 전체 탑재 된 조직에 평평 하 게.
- flattened 조직 모자이크 수집 및 이미지 처리에 대 한 액세서리를 갖춘 거꾸로 epifluorescent 현미경에 놓습니다.
참고: 여기 및 방출 길이 488 nm와 509 nm. 그것은 또한 여러 개의 이미지를 겹치는 수동으로 플러그인 모자이크와 함께 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 꿰 매 고 수입니다. - 재생성 된 축 삭의 길이 측정 하면 모든 identifiable fluorescently 표시 된 축 삭 원심 축 삭 끝에 호감 사이트 (10-0 epineural 봉합으로 표시)에서 좌 골 신경에 추적.
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Representative Results
세포 독성 transfection DRG electroporation vivo에서 의 속도가 높은 만큼, 우리 주입의 유효성을 검사 하 고 현재 프로토콜 및 electroporated 붙일 태그가 예측에 관한 siRNA L4 및 L5 Drg로 계량 하기. 분리 된 Drg cryo 단면화 및 immunohistochemistry (그림 1A-B)를 통해 처리 되었습니다. 주입 및 electroporation 후 세포 생존 율을 추정, L4와 L5에서 그대로 Drg 수확 되었고 cryo 단면화 및 immunohistochemistry 통해 처리. Tuj1 얼룩과 반사 신경 밀도 electroporation 신경 세포 죽음 (그림 1C)을 유도 하지 않았다 하는 것을 나타내는 상당한 차이 그대로 Drg의 신경 밀도에 비교 될 때 보여주지 않았다. Transfection 속도 태그 RNA 올리고 신경 세포의 수와 Tuj1 양성 신경의 수 비로 계산 되었다. 미르의 평균 transfection 율 80.7 ± 4.3% 이며 siRNA 94.2 ± 0.3% (그림 1D). 현재 비보에 electroporation 방법을 적용 축 삭 재생을 공부, 좌 골 신경 결합 되었고 몇 군데. 봉합 사 매듭 (그림 2)에 의해 표시 된 호감 사이트에서 독특한 궤도와 인식할 수 있는 원심 축 삭 끝 마다 재생성 된 축 삭을 추적할 수 있습니다. 또한, 우리 electroporated EGFP 플라스 미드와 Drg l2 T7에서 L4 및 L5 지 뿌리 함께 척수 7 일 후 수확. 우리 잘 설립 조직 프로토콜 삭제 사용-척수11를 uDISCO. 척수에 지 열 EGFP 표시 된 축 삭 confocal 현미경으로 몇 군데 있었고은 경도 화살 영사 이미지 (그림 3)에서 확인. 또는, confocal 이미지 (동영상 1) 3 차원 이미지를 재구성 하기 위해 현미경 시각화 소프트웨어와 함께 처리할 수 있습니다.
그림 1 : DRG cryo-섹션 electroporation 붙일 태그가 일반적인 예측에 관한 또는 siRNA에서 vivo에서의 후의 Immunohistochemistry. (A) 대표 cryo-주입 DRG 조직과 붙일 태그 (Dy547) 비 대상 microRNAs와 electroporated의 섹션. 왼쪽된 이미지: (Dy547) 비 대상 microRNAs 붙일 태그의 형광 신호 (붉은 색)의 이미지. 중간 이미지: 면역-얼룩 (그린 색상) Tuj1의 이차 항 체에 Alexa488 fluorophore와. 오른쪽 이미지: 이전 두 채널의 병합 된 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m.(B) 주입 DRG 조직과 붙일 태그 (Cy3) 비 대상 siRNAs와 electroporated의 대표 cryo-섹션. 왼쪽된 이미지: 붙일 태그 (Cy3) 비 대상 siRNAs의 형광 신호 (붉은 색)의 이미지. 중간 이미지: 면역-얼룩 (그린 색상) Tuj1의 이차 항 체에 Alexa488 fluorophore와. 오른쪽 이미지: 이전 두 채널의 병합 된 이미지. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. (C)는 그대로 DRG cryo-섹션의 신경 밀도 809.6 ± 14.2 셀/m m2 (N = 6)를 주입된 DRG cryo-섹션은 801.6 ± 27.4 셀/m m2 (N = 6), ± SEM, 학생의 t의미-테스트, NS: 없음 중요성입니다. 3 마우스 태그 siRNA와 DRG electroporation 왼쪽된 L4 및 L5 Drg 수행 vivo에서 했다. 둘 다 왼쪽 및 오른쪽 L4 및 L5 Drg 48 h 후 수확 이며 cryo 섹션과 immunohistochemistry 통해 처리. 각 DRG 대략 60 조각으로 구분 되 고 조각의 두께 10 μ m. 각 DRG의 3 조각 200 μ m으로 선택 되며 평균. (D) 태그 miRNA의 transfection 율은 80.7 ± 4.3% (N = 4) 태그 siRNA는 94.2 ± 0.3% (N = 6), ± SEM.를 의미 3 마우스 태그 siRNA와 태그 miRNA와 두 개의 마우스 DRG electroporation 왼쪽된 L4 및 L5 Drg 수행 vivo에서 했다. Drg 48 h 후 수확 되며 immunohistochemistry 및 곳을 알아내는-섹션을 통해 처리 됩니다. 각 DRG 대략 60 조각으로 구분 되 고 조각의 두께 10 μ m. 각 DRG의 3 조각 200 μ m으로 선택 되며 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Ectopically 표현된 EGFP 디스플레이 재생성 좌 골 신경의 신경 축 삭 상해 분쇄 후. 호감 부상에서 고통 병합 된 좌 골 신경에서 축 삭 EGFP (그린 형광)는 somas에서 축 삭 수송으로 레이블이 지정 됩니다. 빨간색 선은 원래 수술 suturing 매듭에 의해 표시 되었다 분쇄 상해 사이트의 위치를 나타냅니다. 흰색 화살표, 화살표, 그리고 스타 세 독특한 축 삭 끝, 모두의 호감 사이트에서 확장을 나타냅니다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Drg의 electroporation vivo에서 후 척수에서 EGFP 표현 axons의 프로젝션 이미지. (A) 지 열 및 L4/L5 지 뿌리 EGFP 표시 된 축 삭 경도 투영 삽입 된 이미지 a 1과 A2 패널 (A)에 표시 된 두 개의 직사각형 영역의 확대 보기를 표시 합니다. A 1 등 열에 축 삭의 상세 보기를 전시 한다. A2 지 루트 항목 영역 (DREZ) 축 삭의 상세 보기를 전시 한다. 눈금 막대 = 200 µ m. (B) 화살 프로젝션 등 열 내 EGFP 표시 된 축 삭의. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: Drg의 비보에 electroporation 후 EGFP 표현 axons 척수에서의 3 차원 재구성. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
여러 수술 단계 특히 주의 필요합니다. L4 그리고 L5 Drg (somas의 위치), 좌 골 신경 지배, 올바르게 식별 하 고 유전자 구조와 주입을 해야 합니다. 그렇지 않으면, GFP 레이블링 됩니다 결 석 좌 골 신경 축 삭에. 장 골 볏 L4 및 L5 Drg를 정확 하 게 유용한 해부학 적 랜드마크로 서 볼 수 있습니다. 대부분의 마우스에 L5, L6 척추 사이 관절 면은 장 골 볏12인접. 또는, L3 DRG 선택할 수 있습니다 L5, 대신 immunohistochemistry 또는 서쪽 오 점13같은 분석에 대 한 특히 L5 DRG의 외과 노출 일반적으로 깊은 위치와 풍부한 혈액 공급에 큰 어려움을 충족으로. 또한, 전체 수술 손상 DRG 구조, 척수 및 신경 루트를 포함 하 여 주변을 피해 야 한다. 주목할 만한 두 번째 중요 한 작업 단계는 주사입니다. 빠른 녹색 염료 유전자 구조 시각화 솔루션 바늘에서 배출 하는 DRG에 확산의 솔루션으로 혼합 했다. 성공적인 주입 형광 염료에 의해 설명 된 명확한 라운드 모양 DRG를 표시 해야 합니다. 경우에 형광 염료와 솔루션은 DRG에서 주입 하는 동안 밖으로 누출, 마이크로-바늘의 팁의 깊이에 뒤로-및-앞뒤 튜닝 DRG 캡슐에 모든 솔루션의 완전 한 주입을 보장할 수 있습니다. 세 개 이상의 다른 사이트에서 DRG impaling 하지 마십시오. Drg는 밀접 하 게 네트워크 venosum13캡슐화로 추가, 가벼운 출혈 DRG 주사 후 일반적으로 불가피 하다. 그것은 혈액 electroporation 동안 전극에서 DRG의 표면 절연 되지 것입니다 있도록 출혈을 멈추게 해야 합니다. 그리고 성공적인 electroporation 전기 현재 변환에 따라 PBS 솔루션 전극에 적용 될 수 있다. 마지막으로, 사이트 좌 골 신경에 어디에 짓 눌린은 집게를 표시 해야 합니다 마이크로 봉합으로 부상 사이트 현미경 보이지 않습니다 이미지 분석에 대 한 축 삭 재생 나중의 시작 점으로 표시 될 필요가 있기 때문에. 호감 사이트에서 epineural 봉합 사 매듭 동물 관류와 해 부 후 떨어짐, 그것은 다시 호감 유도 들여쓰기는 여전히 식별 하는 경우 즉시 PFA 고정 신경에 봉합 하는 동일한 사이트를 분류 하는 중요 한.
Transfection 기법으로, electroporation 높은 transfection 비율을 했다. 우리의 연구에의 하면 microRNAs 또는 vivo에서 electroporation 후 siRNAs DRG 신경 transfection 비율은 90% 이다. 더 중요 한 것은, electroporation vivo에서 바이러스 포장 원하는 유전자 구조를 요구 하는 바이러스-기반 방법 보다 훨씬 적은 시간이 소요 되는. lipofectamine 우리가 아는, vivo에서 lipofectamine에 기초를 둔 transfection는 electroporation 보다 덜 독성에도 불구, DRG의 신경에는 작동 하지 않습니다 특히,도 비보에 생체 외에서. 주목, 현재 방법론은 몇 가지 기술적인 제한이 있습니다. 첫째, 노크 관심의 유전자를 siRNA 효능의 기간 플라스 미드의 바이러스 기반 배달 보다 짧습니다. 따라서, 동물 희생을 electroporation에서 전체 절차 4-6 일14에 완료 될 수 있다. 또한, 수술 현미경 하에서 수행 연습 및 일부 수동 손 재주가 필요 합니다. 초보자를 위한 수술 기간은 종종 예상 보다 더 오래입니다. 마우스를 관리 하는 마 취 복용량 원치 않는 죽음을 방지 하기 위해 신중 하 게 제어 될 수 있다. 마지막으로, 병합 좌 골 신경 축 삭의 중복 epifluorescent 이미징 할 때 발생 합니다. Confocal 현미경으로 평평된 신경 이미징 대체 옵션입니다.
해부학, DRG 감각 신경 두 axonal 분기-주변 하강 지점 및 척수10의 지 열으로 계산 오름차순 중앙 지점 있다. 현재 방법론은 또한 척수의 등 쪽 란의 독특한 라벨을 보여 줍니다. 따라서, 유사한 방법론 조사 척수 부상 후 감각 축 삭 재생을 모델로 사용할 수 있습니다. 결합 조직-개간 기술11, 전통적인 confocal 현미경 검사 법 또는 빛 시트 현미경 사용할 수 있습니다 지운된 척수 샘플에는 척수의 등 쪽 열 내 감각 축 삭의 3D 복원된 이미지를 구축 하.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구 추진 하는 사업 (F Q를 수 여. Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), 크레이그 H. Neilsen 재단 및 BrightFocus 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
References
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