Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Summary

Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.

Abstract

Electroporation is een essentiële, niet-virale gen transfectie benadering te introduceren van DNA-plasmiden of kleine molecules van RNA in cellen. Een sensorisch neuron in de achterwortelganglia ganglion (DRG) strekt zich uit van een enkele axon met twee takken. Eén tak gaat naar de perifere zenuwen (perifere tak), en de andere tak voert het ruggenmerg via de achterwortelganglia (centrale tak). Na de neurale letsel regenereert de perifere tak krachtig overwegende dat de centrale tak doet niet regenereren. Als gevolg van de hoge regeneratief vermogen, zintuiglijke axon regeneratie wijd gebruikt als een modelsysteem te onderzoeken zoogdieren axon regeneratie in zowel het perifere zenuwstelsel (PNS) en het centrale zenuwstelsel (CNS). Hier beschrijven we een protocol van tevoren vastgelegde benadering om te manipuleren genexpressie in volwassen sensorische neuronen in vivo via electroporation. Op basis van transfectie met plasmiden of kleine oligos van RNA (siRNAs of microRNAs), de aanpak maakt het mogelijk voor beide experimenten van de verlies - en winst-van-functie te bestuderen van de rol van genen-van-belangen of microRNAs in verordening van axon regeneratie in vivo. Bovendien, de manipulatie van gen expressie in vivo controleerbaar zowel stoffelijk als ruimtelijk binnen een relatief korte tijd cursus. Dit modelsysteem biedt een uniek instrument voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen waarmee zoogdieren axon regeneratie gereglementeerde in vivo is.

Introduction

Verwondingen in het zenuwstelsel veroorzaakt door neurale trauma of verschillende neurodegeneratieve ziekten meestal resulteren in defecten in motorische, zintuiglijke en cognitieve functies. Onlangs, heeft veel moeite besteed aan herstel van het regeneratieve potentie in volwassen neuronen te herstellen van de fysiologische functionsof gewond neuronen^1,2,3. Sensorische neuronen in de DRG zijn een cluster van zenuwcellen die verschillende zintuiglijke prikkels, zoals pijn, temperatuur, touch of lichaamshouding, naar de hersenen doorgeven. Elk van deze neuronen is pseudo-unipolaire en bevat een enkele axon die bifurcates met één tak uitbreiding naar de periferie en de andere tak die richting het ruggenmerg⁴. De volwassen sensorische neuronen in DRG behoren tot een paar volwassen zoogdieren neuronen bekend om te regenereren hun axonen actief na blessure. Vandaar, beschadigingen van sensorische axonen zijn uitgebreid tewerkgesteld als een cruciale model te bestuderen van de mechanismen van axonale regeneratie in vivo.

In vivo gene transfectie technieken, die meestal minder tijdrovende instellen en flexibeler dan het gebruik van transgene dieren, speel essentiële rol in het bestuderen van de functies van genen en signalering van trajecten in het zenuwstelsel. De belangrijkste technieken kunnen worden onderverdeeld in twee benaderingen: instrument- en virus gebaseerde⁵. Viral gebaseerde in vivo gene levering in volwassen neuronen kan bieden nauwkeurige Spatio manipulatie van gen expressie⁶. Arbeidsintensieve processen zijn echter betrokken bij virale gebaseerde methoden, zoals de productie en zuivering van virale deeltjes die met het gewenste gen. Daarnaast kunnen veel virale vectoren activeren het immuunsysteem van de gastheer, die kan interfereren met de data-acquisitie, data-analyse en de interpretatie van de experimentele resultaten mogelijk te misleiden. Electroporation, een typisch instrument gebaseerde transfectie aanpak, gebruikt een elektroimpuls te vergroten van de permeabiliteit van de cel en nucleaire membranen Transient, die gunsten van de toestroom van gene vectoren of kleine RNA oligos vanuit de ruimte buiten de cellen⁷ . In vitro electroporation wordt algemeen erkend als een voorbijgaande maar zeer efficiënte strategie voor het manipuleren van gerichte genexpressie in veel celtypen. Hoewel in vivo electroporation alleen tot voorbijgaande genexpressie met lage transfecting efficiëntie ten opzichte van virale vectoren leidt, heeft diverse voordelen ten opzichte van virale benaderingen. Bijvoorbeeld, kan het worden toegepast op vrijwel alle weefsels en cellen^7,8,-⁹. Bovendien ofwel plasmiden genen-of-interest of kleine RNA oligos (b.v., siRNAs, microRNAs) tegen bepaalde afschriften codering kunnen worden geïnjecteerd rechtstreeks in het doelweefsel en dan elektrisch gepulseerde, waardoor de procedure minder arbeid - en tijd - consumeren. Bovendien is het mogelijk meerdere plasmiden en RNA oligos gelijktijdig met één electroporation transfecting.

We hebben vastgesteld van een in vivo electroporation aanpak om te manipuleren genexpressie in volwassen muis sensorische neuronen en met succes toegepast en gevalideerd dergelijke aanpak in talrijke pionier studies^1,,^{2,3 ,8,10}. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol ter vergemakkelijking van het gebruik van deze benadering voor toekomstige studies van zoogdieren axon regeneratie.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd overeenkomstig het dierlijke protocol goedgekeurd door het Johns Hopkins institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. materialen en reagentia

1. Dieren
   1. Gebruik de zes weken oude vrouwelijke CF1 muizen met een gewicht van 30 – 35 g voor de experimenten.
      Opmerking: De muizen waren groep-gevestigd (5 muizen per kooi) in apart geventileerde gesteriliseerde kooien met 1/4" corn cob beddengoed en 2" vierkante nestlets voor nesten. De kooien werden onderhouden in een gecontroleerde 12 uur licht-donker cyclus en de kamertemperatuur was tussen 19.4 ° C en 25 ° C. De muizen waren gevoed met wereldwijde knaagdier dieet en automatische water systeem leveren.
2. Instrumenten
   1. Gebruik de volgende chirurgische instrumenten om het efficiënt uitvoeren van de operatie: disposable spuiten (27 G, 1,0 mL) voor intraperitoneale injectie, bont clipper, stereo dissectie Microscoop micro-chirurgie pincet, schaar van micro-chirurgie en kleine bot rongeurs en gesteriliseerde nonwoven sponzen.
      Opmerking: Alle instrumenten en materialen zijn gesteriliseerde met autoclaaf voor de operatie of vooraf gesteriliseerd door de producenten. Tijdens de operatie, zijn de instrumenten gespoten met 75% alcohol om de sterilisatie.
3. Verdoving oplossingen
   1. Gebruik verdoving oplossing #1 om induceren van de verdoving en narcose oplossing #2 vóór DRG injectie te handhaven van de narcose.
      1. Verdund om verdoving oplossing #1, ketamine en xylazine in een steriele zoutoplossing op een eindconcentratie van 10 mg/mL en 1,2 mg/mL.
      2. Zodat de verdoving oplossing #2, Verdun avertin in steriele zoutoplossing op een eindconcentratie van 20 mg/mL.
4. Plasmide DNA en RNA Oligos
   1. De plasmiden met behulp van de commerciële kit na de fabrikant protocollen dienovereenkomstig voor te bereiden. Verdun de plasmide ANI in steriel gedeïoniseerd water tot de concentratie van 2,0 µg/µL.
   2. Voeg snel groene kleurstof oplossing te bereiken van een eindconcentratie van 0.005 – 0,01% (v/v) voor betere visualisatie van de omtrek van de Deutsche Reichsbahn tijdens de injectie.
   3. Los de siRNA of microRNA oligos in overeenkomstige buffers geboden door fabrikanten te bereiken een eindconcentratie op 50 µM.
5. Micro-injectie pipet
   1. Trek het capillaire glas met behulp van de trekker van de micropipet en snijd het puntje van de getrokken capillaire glazen pipet met een microchirurgie schaar voor het genereren van een opening met een geschatte 50 µm-buitendiameter. Vervolgens steriliseren ongeveer de glazen pipet onder UV-licht op een schone bankje voor 20-30 min.
   2. Mount de gesteriliseerde glazen pipet op de pipet houder verbonden met een intracellulair microinjection afzien systeem. De parameters van het systeem van microinjection vastgesteldop 30 psi druk en 8 ms van duur.
6. Electroporation systeem
   1. De elektroden aansluit op de blokgolf electroporation systeem en stel de volgende parameters: 15 ms pulsen op 35 V met 950 ms intervallen voor in vivo electroporation.
7. Perfusie en tot vaststelling van de oplossing
   1. Los het poeder paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS met een concentratie van 4% (m/v). Winkel de PFA oplossing bij 4 ° C.

2. experimentele Procedures

1. Chirurgische blootstelling van de L4 en L5 DRG
   1. Anesthetize de muis met behulp van een intraperitoneale injectie van de verdoving oplossing #1 bereid eerder (met ketamine 100 mg/kg lichaamsgewicht en xylazine 12 mg/kg lichaamsgewicht).
   2. Scheren het chirurgische gebied met de clipper bont.
      Opmerking: Aangezien er een andere operatie voor linker Ischiaszenuw crush, de vacht van de linker posterior dij kan worden geschoren gelijktijdig.
   3. Plaats de muis op de verwarmde deken (35.0 ° C) en de rectale temperatuur controleren met een temperatuursonde.
   4. Om te testen de narcose, knijp de tenen en de staart van de muis en de gedrags reacties observeren.
   5. Tape de vier ledematen van de muis op het prikbord.
   6. Veeg het chirurgische gebied met iodophor oplossing en daarna met 75% alcohol te verwijderen van de iodophor voordat de huid snijden.
   7. Ophthalmic zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
   8. Markeren voordat insnijding van beide zijden van de iliacale toppen met een fijne viltstift. Teken een lijn die twee verbindingspunten van iliac toppen ter vergemakkelijking van de identificatie van de standpunten van L5 DRG.
   9. Maak een incisie van 3 cm langs de middellijn van de lage rug met micro-schaar. Bovendien los van de paraspinous spieren, zoals de musculus multifidus en de musculus longissimus lumborum, uit de L3 naar S1 spinous processen, en bloot de facetgewrichten van L4-5 en L5-6.
   10. Gebruik een micro-rongeur te verwijderen van de facetgewrichten van L4-5 en L5-6. Bovendien, verwijderen de linker neurale boog van L4 en L5 naar de dorsale zijde van de DRG bloot.
2. Deutsche Reichsbahn injectie
   1. Inspuiten van de verdoving oplossing #2 (met avertin 200 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneally om de narcose vóór DRG injectie.
   2. Laad de DNA-plasmiden of RNA oligos (1 µL per DRG) in de glazen capillaire pipet.
   3. Breng de tip van de capillaire glazen pipet zorgvuldig in de Deutsche Reichsbahn.
   4. Geleidelijk injecteren 1,0 µL oplossing van DNA-plasmiden of RNA oligos in de DRG met behulp van de intracellulaire microinjection afzien systemen (30 psi, 8 ms).
      Opmerking: De duur van de injectie moet niet minder dan 5 minuten duren.
3. Electroporation
   1. PBS op de toppen van de elektroden neerzet.
   2. Clean-up het bloeden met gesteriliseerde vierkante katoen gaas.
   3. Het doel DRG met de elektroden zachtjes knijpen en 5 vierkant elektrische pulsen met het electroporation systeem toe te passen.
   4. Sluit de spieren en huid lagen respectievelijk met 5-0 nylon hechtingen.
   5. Totdat het volledig voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen, plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmde deken (35.0 ° C) onder de aandacht. Terug de muis naar de kooi nadat het volledig is hersteld van de narcose.
      Opmerking: Het duurt ongeveer 60 min voor de muis volledig herstellen van verdoving op de 37 ° C-deken. Los één pil (200 mg) ibuprofen in 1000 ml water (0,2 mg/ml) voor dagelijkse voeding ter verlichting van de post chirurgische pijn.
4. Nervus ischiadicus Crush
   1. Twee of drie dagen (afhankelijk van de proefopzet) na de DRG electroporation, anesthetize de muis intraperitoneally met verdoving oplossing #2 (met avertin 400 mg/kg lichaamsgewicht).
   2. Tape de vier ledematen van de muis op het prikbord.
   3. Maak een incisie van 1 cm 0.5 cm aan de linkerkant langs de middellijn. De spieren, zoals de Musculus gluteus maximus en piriformis spier, overlangs snijden. Het segment van de nervus ischiadicus tussen de grotere ischialgie foramen en de ischialgie inkeping bloot.
   4. Crush de zenuw met microchirurgie pincet voor 12 s en mark de verbrijzeling-site met een 10-0 nylon epineural hechtdraad. Maak een knoop op het dural membraan ter gelegenheid van de verbrijzeling-site.
   5. Sluit de spieren en huid lagen met 5-0 nylon hechtdraad.
   6. Plaats de muis op een verwarmde deken (35.0 ° C) met grote aandacht totdat het volledig voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Terug de muis naar de kooi nadat het volledig is hersteld van de narcose.
      Opmerking: Het duurt ongeveer 60 min voor de muis volledig herstellen van verdoving op de 37 ° C-deken. Los één pil (200 mg) ibuprofen in 1000 ml water (0,2 mg/ml) voor dagelijkse voeding ter verlichting van de post chirurgische pijn.
5. Muis perfusie, DRG en oogst van de nervus ischiadicus
   1. Twee of drie dagen na de Verbrijzeling van de nervus ischiadicus (afhankelijk van de proefopzet), anesthetize de muis intraperitoneally met verdoving oplossing #2.
   2. Perfuse de transcardially van de muis met PBS (pH 7.4) gevolgd door de ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) (pH 7.5) in PBS.
   3. Scheid de DRG samen met de zenuwwortels en de nervus ischiadicus vóór de knie na perfusie, zorgvuldig met micro-schaar en micro-pincet onder de Microscoop dissectie. Plaats van de nervus ischiadicus rechtstreeks in 4% PFA overnacht bij 4 ° C.
6. Imaging en het meten van de fluorescentie-geëtiketteerden sensorische axonen
   1. Strip uit de bijgevoegde weefsel en membraan op de vaste nervus ischiadicus met micro-schaar en micro-pincet zorgvuldig onder de loep dissectie. Dan wisselen de 4% PFA met PBS en wassen de zenuw drie keer.
   2. De nervus ischiadicus plaatst op een dia en houd het recht. Voeg 80 µL van antifade oplossing rond de zenuw, dan lag een dekglaasje aan op het. Flatten het geheel gemonteerd weefsel met druk.
   3. Plaats de flattened weefsels op de omgekeerde epifluorescent Microscoop uitgerust met een accessoire voor Mozaïek verwerving en beeldverwerking.
      Opmerking: De excitatie en emissie lengtes zijn 488 nm en 509 nm. Het is ook mogelijk om meerdere, overlappende afbeeldingen handmatig en steek de beelden samen met behulp van ImageJ met de plug-in mozaïek.
   4. Bij het meten van de lengte van geregenereerde axonen, traceren alle identifiable fluorescently-geëtiketteerden axonen in de ischiadicus zenuw van de site van de verbrijzeling (gemarkeerd met de 10-0 epineural hechtdraad) tot aan de uiteinden van de distale axon.

Representative Results

Te kwantificeren van de cytotoxiciteit van het huidige protocol en om te valideren dat transfectie in vivo DRG electroporation is hoog genoeg, we geïnjecteerd en electroporated fluorescently-tagged microRNA of siRNA in L4 en L5 DRG. De vrijstaande DRG werden verwerkt via cryo-segmenteren en immunohistochemistry (Figuur 1A-B). Bij de berekening van de cel overlevingskansen na injectie en electroporation, waren de intact DRG van L4 en L5 geoogst en verwerkt via cryo-segmenteren en immunohistochemistry. De neuron dichtheden, weerspiegeld met Tuj1 vlekken, bleek niet een significant verschil in vergelijking met de neuron dichtheden van intact DRG, waarmee wordt aangegeven dat de electroporation deed niet het induceren van neuronale celdood (Figuur 1C). De transfectie tarief werd berekend als de verhouding tussen het aantal tagged RNA oligo neuronen en het aantal Tuj1-positieve neuronen. De gemiddelde transfectie van miRNA bedraagt 80.7 ± 4,3% en de siRNA 94.2 ± 0,3% (Figuur 1D). Bij de toepassing van de huidige in vivo electroporation methode om te studeren van axon regeneratie, was de nervus ischiadicus afgeplat en beeld. Elke geregenereerde axon met kenmerkende traject en herkenbare distale axon eind kan worden getraceerd van de verbrijzeling site aangegeven door de knoop van de hechtdraad (Figuur 2). Bovendien, we electroporated de DRG met EGFP plasmiden en het ruggenmerg van T7 aan L2 samen met dorsale wortels van L4 en L5 na 7 dagen geoogst. We gebruikten een gevestigde weefsel clearing protocol — uDISCO om de ruggenmerg¹¹. De axonen van de dorsale kolom EGFP-label in het ruggenmerg zijn beeld met een confocal microscoop en vervolgens geïdentificeerd in de lengterichting zowel de Sagittaal projecteren beelden (Figuur 3). Als alternatief kunnen de confocal beelden worden verwerkt met microscopie Visualisatie software te reconstrueren van een 3D-beeld (film 1).

Figuur 1 : Immunohistochemistry van DRG cryo-afdeling na de electroporation van fluorescently-tagged aspecifieke microRNA of siRNA in vivo. (A) vertegenwoordiger cryo-sectie van de DRG weefsel geïnjecteerd en electroporated met fluorescently-tagged (Dy547) van de doelsoort, de microRNAs van de verpakking. Linker beeld: het beeld van het fluorescent signaal (rood) van fluorescently-tagged (Dy547) van de doelsoort, de microRNAs van de verpakking. Middelste afbeelding: immuno-kleuring (groene kleur) van Tuj1 met een fluorophore van de Alexa488 op het secundaire antilichaam. Rechterafbeelding: de samengevoegde afbeelding van de vorige twee kanalen. Schaal bar = 100 µm.()B) vertegenwoordiger cryo-sectie van de DRG weefsel geïnjecteerd en electroporated met fluorescently-tagged (Cy3) van de doelsoort, de siRNAs van de verpakking. Linker beeld: het beeld van het fluorescent signaal (rood) van fluorescently-tagged (Cy3) van de doelsoort, de siRNAs van de verpakking. Middelste afbeelding: immuno-kleuring (groene kleur) van Tuj1 met een fluorophore van de Alexa488 op het secundaire antilichaam. Rechterafbeelding: de samengevoegde afbeelding van de vorige twee kanalen. De schaal bar vertegenwoordigt 100 µm. (C) de neuron dichtheid van een intact DRG cryo-sectie is 809.6 ± 14.2 cellen/mm² (N = 6) en een ingespoten DRG cryo-sectie is 801.6 ± 27,4 cellen/mm² (N = 6), betekenen ± SEM, Student t-test, NS: geen betekenis. Drie muizen werden uitgevoerd in vivo DRG electroporation op de linker L4 en L5 DRG met tagged siRNA. Zowel links en rechts L4 en L5 DRG zijn na 48u geoogst en verwerkt via cryo-sectie en immunohistochemistry. Elke DRG heeft zijn gesegmenteerd in ongeveer 60 plakjes en de dikte van het segment is 10 μm. Drie segmenten van elk DRG worden geselecteerd door 200 μm en gemiddeld. (D) het tarief van de transfectie van het tagged miRNA is 80.7 ± 4,3% (N = 4) en de tagged siRNA is 94.2 ± 0,3% (N = 6), ± SEM. betekenen Drie muizen werden uitgevoerd in vivo DRG electroporation op de linker L4 en L5 DRG met tagged siRNA en twee muizen met tagged miRNA. De DRG zijn na 48u geoogst en verwerkt via cryo-sectie en immunohistochemistry. Elke DRG heeft zijn gesegmenteerd in ongeveer 60 plakjes en de dikte van het segment is 10 μm. Drie segmenten van elk DRG worden geselecteerd door 200 μm en gemiddeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Ectopically uitgedrukt EGFP displays geregenereerd neuronale axonen in nervus ischiadicus na verpletterende letsel. De axonen in een afgevlakte nervus ischiadicus crush schade lijden worden aangeduid met EGFP (groene fluorescentie) van het SOMA naar axonen vervoerd. De rode lijn geeft de positie van de verpletterende letsel site, die oorspronkelijk chirurgisch werd gekenmerkt door een hechten knoop. De witte pijlpunt pijl en de sterren geven drie onderscheidende axon uiteinden, die allemaal uit te na de verbrijzeling-site breiden. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Projectie beelden van EGFP-uitdrukken in het ruggenmerg na in vivo electroporation van DRG axonen. (A) longitudinale projectie van de axonen van EGFP-geëtiketteerden binnen de dorsale kolom en de L4/L5 dorsale wortels. Inzet beelden A1 en A2 tonen vergrote standpunten van de twee rechthoekige gebieden gemarkeerd in het deelvenster (A). A1 vertoont een detailweergave van axonen in de dorsale kolom. A2 vertoont een detailweergave van axonen in de achterwortelganglia vermelding zone (DREZ). Schaal bar = 200 µm. (B) Sagittaal projectie van de axonen van EGFP-geëtiketteerden binnen de dorsale kolom. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Film 1: 3D reconstructie van EGFP-uiten axonen in het ruggenmerg na in vivo electroporation van DRG. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

Verschillende chirurgische stappen moet bijzondere aandacht. De L4 en L5 DRG (locatie van SOMA), die de nervus ischiadicus domineren, moeten correct worden geïdentificeerd en ingespoten met gene constructies. Anders, het GFP-labeling afwezig zal zijn in de Ischiaszenuw axonen. De iliacale toppen kunnen worden beschouwd als nuttig anatomische monumenten te lokaliseren L4 en L5 DRG. In de meeste muizen is het gemeenschappelijke tussen L5 en L6 wervels facet naaste iliac toppen¹². Als alternatief, L3 DRG kan worden gekozen in plaats van L5, vooral voor assays zoals immunohistochemistry of westelijke vlek¹³, zoals chirurgische blootstelling van L5 DRG meestal voldoet aan grote problemen als gevolg van een diepe locatie en rijke bloedtoevoer. Ook moet de hele operatie te vermijden schadelijke DRG omringende structuren, met inbegrip van het ruggenmerg en de wortel van de zenuw. De tweede kritische bewerkingsstap vermeldenswaard is de injectie. De snelle groene kleurstof werd gemengd met de oplossing van gene constructies om te visualiseren de oplossing uit de naald uitgeworpen en diffuus in de Deutsche Reichsbahn. Een succesvolle injectie moet een duidelijk ronde-vorm-DRG geschetst door de fluorescente kleurstof worden weergegeven. Als de oplossing met fluorescente kleurstof uit de DRG terwijl injecteren lekt, een heen-en-weer "fine-tuning"-op de diepte van de tip van micro-naald kan ervoor zorgen volledige injectie van alle oplossing in de DRG-capsule. Vermijd het spietsen van de DRG op meer dan drie verschillende locaties. Verdere, milde bloeding is meestal onvermijdelijk na injectie van de Deutsche Reichsbahn, zoals DRG zijn strak ingekapseld met rete venosum¹³. Het is belangrijk om te stoppen met bloeden zodat er geen bloed isolatie van het oppervlak van de Deutsche Reichsbahn van elektroden tijdens electroporation zal zijn. Succesvolle electroporation hangt af van elektrische huidige transductie en PBS oplossing kan worden toegepast op de elektrode. Tot slot, de site op de Ischiaszenuw waar is geplet met pincet moeten gemarkeerd worden met micro-wordt, omdat de site schade onzichtbaar onder de Microscoop en moet worden vermeld als het beginpunt van axon regeneratie voor beeldanalyse later. Als de epineural hechtdraad knoop op de site van crush eraf valt na dierlijke perfusie en dissectie, is het van cruciaal belang om opnieuw de dezelfde site met een hechtdraad onmiddellijk op de zenuw PFA-vaste label wanneer de inspringing crush-geïnduceerde nog steeds te herkennen is.

Onder transfectie technieken heeft electroporation een hoger tarief van de transfectie. Volgens ons onderzoek de transfectie van het neuron DRG voor microRNAs of siRNAs na in vivo electroporation bedraagt bijna 90%. In vivo electroporation is en wat nog belangrijker is, veel minder tijd in beslag dan virus gebaseerde methoden, waarvoor virus verpakking van gewenste gen constructies. Voor zover wij weten, alhoewel de transfectie lipofectamine gebaseerde in vivo minder toxiciteit dan electroporation heeft, de lipofectamine doet niet werkzaamheden voort DRG neuronen in het bijzonder in vivo noch in vitro. Opmerkelijk, de huidige methodologie heeft verschillende technische beperkingen. Ten eerste is de duur van siRNA werkzaamheid te kloppen van gen-of-interest korter dan de virus gebaseerde levering van plasmiden. Daarom heeft het hele procédé vanaf electroporation dierlijk offer te worden afgewerkt in 4-6 dagen¹⁴. Bovendien vereist de operatie uitgevoerd onder de Microscoop praktijk en enige handigheid. Voor een beginner duurt de operatie vaak langer dan verwacht. De verdoving dosis aan de muis bestuurd moet zorgvuldig worden gecontroleerd om te voorkomen dat ongewenste sterfte. Ten slotte, afvlakking van de nervus ischiadicus zorgt ervoor dat overlappende van axonen bij het uitvoeren van epifluorescerende imaging. De afgevlakte zenuwen met een confocal microscoop Imaging is een alternatief.

Anatomisch, hebben de sensorische neuronen van de DRG twee axonale vestigingen - de perifere aflopende tak en de oplopende centrale tak projecteren in de dorsale kolom van het ruggenmerg¹⁰. De huidige methode toont ook onderscheidend labeling van de dorsale kolom van het ruggenmerg. Dus, een soortgelijke methodologie kan dienen als een model om te onderzoeken van sensorische axon regeneratie na dwarslaesie. In combinatie met weefsel-clearing technieken¹¹, kan conventionele confocale microscopie of licht vel microscopie worden toegepast op het gewiste ruggenmerg monster om te bouwen van 3D gereconstrueerde beelden van sensorische axonen binnen de dorsale kolom van het ruggenmerg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief