Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/58171
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

אלקטרופורציה היא גישה יעילה כדי לספק את הגנים של אינטרסים לתוך תאים. על-ידי החלת גישה זה ויוו על הנוירונים של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון (DRG), נתאר מודל ללמוד האקסון התחדשות בתוך vivo.

Abstract

אלקטרופורציה היא גישה תרביות תאים ג'ין נגיפי חיוני כדי להציג את ה-DNA פלסמידים או מולקולות RNA קטנות לתוך התאים. נוירון חישה גנגליון העזוב שורש (DRGs) משתרע על אקסון אחד עם שני סניפים. סניף אחד הולך ההיקפית העצב (סניף היקפיים), ואת הסניף השני נכנס לחוט השדרה דרך השורש העזוב (סניף מרכזי). לאחר הפגיעה העצבית, הענף היקפיים מחדש robustly ואילו הסניף המרכזי לא להתחדש. בשל יכולת ההתחדשות גבוהה, התחדשות האקסון חושית כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד התחדשות האקסון בתרבית של מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) והן על מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שנוצרו קודם לכן הגישה לתמרן ביטוי גנים נוירונים סנסוריים בוגרים ויוו ויה אלקטרופורציה. בהתבסס על תקנים עם פלסמידים או oligos RNA קטנים (siRNAs או מיקרו Rna), הגישה מאפשר שני ניסויים הפסד, רווח-של-פונקציה ללמוד את התפקידים של גנים-של-אינטרסים או מיקרו Rna בוויסות של האקסון התחדשות בתוך vivo. בנוסף, המניפולציה של ג'ין ביטוי ויוו ניתן לשלוט במרחב והן חנותם בתוך מסלול זמן קצר יחסית. מערכת מודל זה מספק כלי ייחודי כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבו האקסון בתרבית של התחדשות הוא מוסדר ויוו.

Introduction

פגיעות במערכת העצבים שנגרם ע י פגיעה עצבית או מחלות ניווניות שונות בדרך כלל תוצאה של ליקויים-מוטורית, חושית ופונקציות קוגניטיביות. לאחרונה, מאמץ רב הוקדש העוצמה משובי הקמתה מחדש בנוירונים למבוגרים כדי לשחזר את functionsof פיזיולוגית נפגע נוירונים1,2,3. החישה הניריונים ב הרפובליקה הם מקבץ של תאי עצב מעבירים גירויים סנסוריים שונים, כגון כאב, טמפרטורה, מגע או תנוחת הגוף, אל המוח. כל אחד הנוירונים הללו מדומים unipolar ומכיל אקסון בודד זה bifurcates עם סניף אחד המתפרש הפריפריה, הסניף השני לכיוון חוט השדרה4. הנוירונים חושית למבוגרים ב- DRGs הם בין כמה נוירונים יונקים בוגרים ידוע להתחדש אקסונים שלהם באופן פעיל לאחר פציעה. לפיכך, פציעות של אקסונים סנסוריים יש כבר בהרחבה מועסקים כמודל מכריע ללמוד על מנגנוני התחדשות עצב בתוך vivo.

In vivo ג'ין תרביות תאים טכניקות, אשר בדרך כלל פחות זמן רב להגדיר וגמיש יותר מאשר באמצעות בעלי חיים מהונדס, יש משחק תפקידים חיוניים לומד את הפונקציות של גנים, איתות המסלולים במערכת העצבים. ניתן לסווג את הטכניקות העיקריות שתי גישות: מבוסס על כלי נגינה, מבוסס על וירוס5. מבוסס-ויראלי ויוו המסירה הגן בנוירונים למבוגרים יכולים לספק מדויק ייתכן מניפולציה של ביטוי גנים6. עם זאת, תהליכים עתירי עבודה מעורבים שיטות מבוססות-ויראלי, כגון ייצור, טיהור של נגיפים המכילים את הגן הרצוי. בנוסף, רבים וקטורים ויראלי יכול להפעיל את מערכת החיסון של הפונדקאי, אשר עשויים להפריע רכישת נתונים, ניתוח נתונים, יכול להטעות את הפרשנות של תוצאות הניסוי. אלקטרופורציה, בגישה תקנים המבוסס על כלי טיפוסי, משתמשת פולס חשמלי כדי להגדיל את החדירות של התא וממברנות גרעיני transiently, אשר מעדיף זרם של וקטורים ג'ין או oligos RNA קטנים מהחלל מחוץ לתאים7 . אלקטרופורציה במבחנה מוכר באופן נרחב אסטרטגיה ארעי אך יעיל ביותר לטיפול ממוקד גנים סוגי תאים רבים. למרות ויוו אלקטרופורציה מוביל רק ביטוי גנים ארעית עם יעילות transfecting נמוך לעומת וקטורים ויראלי, יש לו יתרונות שונים על גישות ויראלי. לדוגמה, ניתן להחיל אותה כמעט כל רקמות ותאים7,8,9. בנוסף, גם פלסמידים קידוד oligos RNA גנים-של-ריבית או קטן (למשל, siRNAs, מיקרו Rna) נגד תעתיקים מסוימים יכול להיות מוזרק ישירות רקמת המטרה, ואז חשמלית פעמו, אשר להפוך את ההליך העבודה פחות - ו זמן - רב. יתר על כן, transfecting פלסמידים מרובים, RNA oligos בו זמנית עם אלקטרופורציה יחיד אפשרי.

יש נוסדה גישה אלקטרופורציה ויוו לתמרן ביטוי גנים ב העכבר למבוגרים החישה הניריונים, הוחלו בהצלחה ואנו לאימות גישה כזו אינספור מחקרים חלוצים1,2,3 8, ,10. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי להקל על השימוש בגישה זו עבור מחקרים עתידיים של האקסון בתרבית של התחדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקול בעלי חיים אושרה על ידי ג'ונס הופקינס אכפת חיה מוסדיים שימוש הוועדה.

1. נוגדנים וחומרים

  1. בעלי חיים
    1. השתמש עכברים CF1 נקבה בת שבוע 6 במשקל של 30 – 35 g עבור הניסויים.
      הערה: העכברים היו שוכנו קבוצה (5 עכברים לכל כלוב) בכלובים סטיריליים בנפרד מאוורר עם 1/4 פלייר תירס קלח מצעים, 2" מרובע nestlets על קינון. הכלובים היו במחזור-בהירה-כהה 12-h מבוקרת נוצר ומתוחזק טמפרטורת החדר היה בין 19.4 ° C 25 º C. העכברים קיבלו עם דיאטה מכרסמים הכללית והמים אוטומטי ויישם מערכת.
  2. כלי נגינה
    1. השתמש מכשירי הניתוח הבא לנהל ביעילות את הניתוח: מזרקים חד פעמיות (27 גרם, 1.0 מ"ל) להזרקה בקרום הבטן, פרווה קליפר לנתיחה סטריאו מיקרוסקופ, מיקרו-ניתוח מלקחיים, מיקרו-ניתוח מספריים, עצם קטן rongeurs וספוגים סטיריליים ארוגים.
      הערה: כל הכלים והחומרים הם בלוק לפני הניתוח או מראש מעוקרות בידי המפיקים. במהלך הניתוח, כלי הנגינה ריססו עם 75% אלכוהול כדי לשמור על העיקור.
  3. פתרונות הרדמה
    1. להשתמש בפתרון הרדמה #1 זירוז ההרדמה ולהשתמש הרדמה פתרון #2 לפני הזרקת DRG כדי לשמור על ההרדמה.
      1. כדי להפוך את פתרון הרדמה #1, לדלל קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים בתוך תמיסת מלח סטרילית-ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל ו- 1.2 מ"ג/מ"ל.
      2. כדי להפוך את פתרון הרדמה #2, לדלל avertin בתוך תמיסת מלח סטרילית-ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל.
  4. פלסמיד ה-DNA ו- RNA Oligos
    1. הכינו את פלסמידים באמצעות ערכת מסחרי בעקבות הפרוטוקולים של היצרן בהתאם. לדלל את פלסמיד DNAs במים יונים סטרילי לריכוז µg 2.0/µL.
    2. הוספת פתרון דיי מהר ירוק להגיע ריכוז סופי של 0.005-0.01% (v/v) עבור כאחראית של החלוקה לרמות DRG במהלך ההזרקה.
    3. להמיס את oligos siRNA או microRNA במאגרי המתאימים שסופקו על-ידי היצרנים להגיע ריכוז סופי ב 50 מיקרומטר.
  5. מיקרו-הזרקת פיפטה
    1. משוך הזכוכית נימי באמצעות את פולר micropipette וחותכים את קצה פיפטה זכוכית נימי משך במספריים למיקרו כדי ליצור פתח בקוטר חיצוני משוער 50 מיקרומטר. ואז לחטא את פיפטה מזכוכית תחת אור UV על ספסל נקי למשך 20-30 דקות בקירוב.
    2. הר פיפטה זכוכית מעוקר את המחזיק פיפטה מחובר microinjection תאיים לוותר על המערכת. להגדיר את הפרמטרים של המערכת microinjection 30 psi לחץ ו- ms 8 של משך.
  6. אלקטרופורציה מערכת
    1. חיבור האלקטרודות למערכת אלקטרופורציה גל מרובע ולהגדיר את הפרמטרים הבאים: 15 ms פולסים בגיל 35 V עם מרווחי 950 ms אלקטרופורציה ויוו .
  7. זלוף ותיקון פתרון
    1. להמיס את האבקה paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 1 x-ריכוז של 4% (w/v). חנות הפתרון מחברים ב 4 º C.

2. בצרות

  1. חשיפה כירורגי של L4 ו- L5 DRGs
    1. עזים ומתנגד העכבר באמצעות זריקה בקרום הבטן של הפתרון הרדמה #1 שהוכנו בעבר (עם קטמין 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חריגות השירותים הווטרינריים 12 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
    2. לגלח את האזור הכירורגי עם המטוס פרווה.
      הערה: מאז תהיה ניתוח נוסף עבור למחוץ בעצב הירך השמאלי, הפרווה של הירך האחורי השמאלי יכול גלחו בו זמנית.
    3. הנח את העכבר לשמיכה מחוממת (35.0 ° C) ונטר הטמפרטורה פי הטבעת עם מכשיר בדיקה טמפרטורה.
    4. כדי לבדוק את ההרדמה, לצבוט את אצבעות הרגליים וזנב של העכבר ולבחון את תגובות התנהגותיות.
    5. קלטת את ארבעת הגפיים של העכבר על לקדמת.
    6. יש לנגב את האזור הכירורגי עם פתרון iodophor ולאחר מכן עם 75% אלכוהול כדי להסיר את iodophor לפני חיתוך העור.
    7. למרוח משחה אופטלמולוגיות עיניים למניעת יובש תחת הרדמה.
    8. לפני החיתוך, לסמן צידי crests iliac עם עט מרקר משובחים. לצייר קו המחבר שתי נקודות crests iliac כדי להקל על זיהוי את העמדות של L5 DRGs.
    9. עושים חתך 3 ס מ לאורך הקו האמצעי של הגב התחתון עם מיקרו-מספריים. יתר על כן, לנתק את השרירים paraspinous, כגון את multifidus musculus lumborum longissimus musculus, מ L3 S1 תהליכים קוצניים, ולחשוף את המפרקים היבט של L4-5 ו L5-6.
    10. השתמש מיקרו-rongeur כדי להסיר את המפרקים היבט של L4-5 ו L5-6. יתר על כן, הסר את הקשת העצבי השמאלי של L4 ו- L5 לחשוף את הצד הגבי של DRGs.
  2. הזרקת DRG
    1. להזריק הרדמה פתרון #2 (עם avertin 200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally כדי לשמור על ההרדמה לפני הזרקת DRG.
    2. טען את פלסמידים DNA או RNA oligos (1 µL לכל DRG) פיפטה נימי זכוכית.
    3. הכנס את קצה פיפטה נימי זכוכית בקפידה הרפובליקה.
    4. בהדרגה להזריק µL 1.0, תמיסת פלסמידים DNA או RNA oligos לתוך הרפובליקה באמצעות microinjection תאיים על לוותר על מערכות (30 psi, 8 מילי-שניות).
      הערה: משך הזמן של הזריקה צריך האחרון לא פחות מ-5 דקות.
  3. אלקטרופורציה
    1. ירידה PBS על קצות האלקטרודות.
    2. לנקות את הדימום עם גזה כותנה מחוטאת מרובע.
    3. לצבוט את המטרה DRG עם האלקטרודות בעדינות ולהחיל 5 פולסים חשמליים מרובע עם מערכת אלקטרופורציה.
    4. סגור את שכבות שריר ועור בהתאמה עם התפרים ניילון 5-0.
    5. הצב את העכבר על שמיכה מחוממת (35.0 ° C) תחת תשומת לב עד זה לגמרי שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. להחזיר את העכבר לכלוב הביתה אחרי זה יש החלים לחלוטין מן ההרדמה.
      הערה: זה לוקח כ 60 דקות אחר העכבר להחלים לגמרי מן ההרדמה השמיכה 37 º C. להמיס איבופרופן הגלולה (200 מ ג) אחד לתוך 1,000 מ ל מים (0.2 מ"ג/מ"ל) לאכילה יומית כדי להקל על הכאבים לאחר ניתוח.
  4. התאהבות בעצב
    1. שניים או שלושה ימים (בהתאם לעיצוב הניסיונית) לאחר אלקטרופורציה DRG, עזים ומתנגד את העכבר intraperitoneally עם הרדמה פתרון #2 (עם avertin 400 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
    2. קלטת את ארבעת הגפיים של העכבר על לקדמת.
    3. עושים חתך 1 ס מ 0.5 ס מ בצד שמאל לאורך הקו האמצעי. חותכים את השרירים, שריר העכוז ו השריר האגסי, longitudinally. לחשוף את הקטע של עצב בין נקב פציעה רבתי את השת.
    4. למחוץ העצב עם מלקחיים למיקרו עבור 12 s ומארק האתר למחוץ בתפר epineural ניילון 10-0. להפוך קשר על קרום קרום כדי לסמן באתר התרסקות.
    5. סגור את שכבות שריר ועור עם תפר ניילון 5-0.
    6. הצב את העכבר על שמיכה מחוממת (35.0 ° C) עם תשומת לב עד זה לגמרי שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. להחזיר את העכבר לכלוב הביתה אחרי זה יש החלים לחלוטין מן ההרדמה.
      הערה: זה לוקח כ 60 דקות אחר העכבר להחלים לגמרי מן ההרדמה השמיכה 37 º C. להמיס איבופרופן הגלולה (200 מ ג) אחד לתוך 1,000 מ ל מים (0.2 מ"ג/מ"ל) לאכילה יומית כדי להקל על הכאבים לאחר ניתוח.
  5. העכבר זלוף, DRG, בעצב קציר
    1. יומיים-שלושה לאחר שיבוא בעצב (בהתאם לעיצוב הניסיונית), עזים ומתנגד את העכבר intraperitoneally עם הרדמה פתרון #2.
    2. Perfuse transcardially את העכבר עם PBS (pH 7.4) ואחריו paraformaldehyde 4% קר כקרח (PFA) (pH 7.5) ב- PBS.
    3. לאחר זלוף, להפריד את DRGs יחד עם שורשי עצבים, בעצב לפני הברך בזהירות עם מיקרו-מספריים, מיקרו-מלקחיים תחת המיקרוסקופ לנתיחה. מקם בעצב ישירות ב- 4% מחברים בין לילה ב 4 º C.
  6. הדמיה ומדידת אקסונים סנסוריים את התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית
    1. מוריד את רקמת המצורף ואת קרום בעצב קבוע עם מיקרו-מספריים, מיקרו-מלקחיים בקפידה תחת המיקרוסקופ לנתיחה. לאחר מכן, להחליף את % 4 מחברים עם PBS, לשטוף העצב שלוש פעמים.
    2. מניחים בעצב על שקופית ולשמור אותו ישר. להוסיף µL 80 של פתרון antifade סביב העצב, ואז לשכב coverslip עליו. לשטח את הרקמה כל הנטען עם לחץ.
    3. במקום הרקמות flattened על המיקרוסקופ epifluorescent הפוכה מצויד אביזר עבור רכישת פסיפס ועיבוד תמונה.
      הערה: אורך עירור, פליטה הם 488 ננומטר ו- 509 ננומטר. זה גם אפשרי לקחת תמונות חופפות מרובות באופן ידני, לתפור את התמונות יחד באמצעות ImageJ עם הפסיפס plug-in.
    4. כאשר מודדים את האורך של אקסונים regenerated, לעקוב אחר כל identifiable התווית על-ידי fluorescently אקסונים בעצב מאתר מעוך (מסומן עם התפר epineural 10-0) בקצוות האקסון דיסטלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לכמת את cytotoxicity של הפרוטוקול הנוכחי, כדי לאמת כי שיעור תרביות תאים ויוו DRG אלקטרופורציה הוא מספיק גבוה, היינו מזריקים גם ו- microRNA מתויג fluorescently electroporated או siRNA לתוך L4 ו- L5 DRGs. מנותקת DRGs עובדו באמצעות הקפאה-חלוקתה אימונוהיסטוכימיה (איור 1א-ב). בעת הערכת שיעור ההישרדות תא ואחרי הזרקה אלקטרופורציה, DRGs שלמות של L4 ו- L5 היו קוצרים ומעובדים באמצעות הקפאה-חלוקתה אימונוהיסטוכימיה. הצפיפויות נוירון, בא לידי ביטוי עם Tuj1 מכתים, לא הראה הבדל משמעותי בהשוואה נוירון הצפיפויות של DRGs ללא פגע, אשר מציין כי אלקטרופורציה לא לגרום מוות תאים עצביים (איור 1C). הקצב תרביות תאים מחושב כיחס בין מספר הנוירונים oligo RNA מתויג ומספר הנוירונים Tuj1-חיוביות. שיעור תקנים אומר miRNA הוא 80.7 ± 4.3% ו- siRNA 94.2 ± 0.3% (איור 1D). בשעת החלת ויוו אלקטרופורציה שיטת הנוכחית ללמוד האקסון התחדשות, בעצב שיטוח, עם תמונה. כל אקסון מחדש עם מסלול ייחודי וסיום האקסון דיסטלי לזיהוי הנמשכת מן האתר למחוץ שציין את הקשר תפר (איור 2). בנוסף, אנו electroporated DRGs עם EGFP פלסמידים וקצרו חוט השדרה של T7 כדי L2 יחד עם השורשים העזוב של L4 ו- L5 לאחר 7 ימים. השתמשנו טישו ומבוססת פרוטוקול ניקוי — uDISCO כדי לנקות את חוט השדרה11. האקסונים התווית על-ידי EGFP עמודה הגבי של חוט השדרה היו עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, ואז זיהה את האורך והן את הווריד להקרין תמונות (איור 3). לחלופין, ניתן לעבד את התמונות קונאפוקלית עם מיקרוסקופ תוכנת ויזואליזציה לשחזר תמונה תלת-ממדית (1 סרטים).

Figure 1
איור 1 : אימונוהיסטוכימיה DRG הקפאה-סעיף לאחר אלקטרופורציה של מתויג fluorescently שאינם ספציפיים microRNA או siRNA ויוו. (א) נציג הקפאה-סעיף של רקמת DRG מוזרק electroporated עם מתויג fluorescently (Dy547)-יעד מיקרו Rna. תמונה משמאל: התמונה של האות פלורסנט (צבע אדום) של מתויג fluorescently (Dy547)-יעד מיקרו Rna. התמונה האמצעית: חיסונית מכתים (צבע ירוק) של Tuj1 עם fluorophore Alexa488 על נוגדן משני. תמונה מימין: התמונה הממוזגת של ערוצי שני הקודם. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.(B) נציג הקפאה-סעיף של רקמת DRG מוזרק electroporated עם מתויג fluorescently (Cy3)-יעד siRNAs. תמונה משמאל: התמונה של האות פלורסנט (צבע אדום) של מתויג fluorescently (Cy3)-יעד siRNAs. התמונה האמצעית: חיסונית מכתים (צבע ירוק) של Tuj1 עם fluorophore Alexa488 על נוגדן משני. תמונה מימין: התמונה הממוזגת של ערוצי שני הקודם. המאזניים בר מייצג 100 מיקרומטר. (ג) צפיפות נוירון שלם DRG הקפאה-מקטע 809.6 ± 14.2 תאים/מ מ2 (N = 6) מוזרק DRG הקפאה-מקטע הוא ± 27.4 801.6 תאים/מ מ2 (N = 6), זאת אומרת ± SEM, הסטודנט t-לבדוק, NS: אין משמעות. שלושה עכברים היו שבוצעו ויוו DRG אלקטרופורציה על שמאל L4, L5 DRGs עם שתייגת siRNA. הן ימין ועל שמאל L4, L5 DRGs שנקטפו לאחר 48 שעות, מעובד באמצעות הקפאה-סעיף אימונוהיסטוכימיה. יש כבר למחלקה כל DRG לפרוסות 60 בקירוב, עובי הפרוסה 10 μm. שלוש פרוסות של כל DRG שנבחרו על ידי 200 μm, בממוצע. (D) שיעור תרביות תאים miRNA מתויג הוא 80.7 ± 4.3% (N = 4) ומהווה siRNA מתויג 94.2 ± 0.3% (N = 6), זאת אומרת ± ב- SEM... שלושה עכברים היו שבוצעו ויוו DRG אלקטרופורציה על שמאל L4, L5 DRGs עם שתייגת siRNA ועכברים שני עם miRNA מתויגות. DRGs שנקטפו לאחר 48 שעות, מעובד באמצעות הקפאה-סעיף אימונוהיסטוכימיה. יש כבר למחלקה כל DRG לפרוסות 60 בקירוב, עובי הפרוסה 10 μm. שלוש פרוסות של כל DRG שנבחרו על ידי 200 μm, בממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ביטוי ectopically EGFP מציג מחדש העצבית אקסונים בעצב לאחר ריסוק פציעה. האקסונים בעצב שעברו שיטוח סבל מפציעה למחוץ מסומנות עם EGFP (זריחה ירוק) מועבר מן somas אקסונים. הקו האדום מציין את המיקום של אתר פגיעה מוחצת, אשר היה במקור בניתוח מסומן על ידי קשר הפתולוגיים. ראש חץ לבן, החץ ולאחר כוכב מציינים שלושה קצוות אקסון ייחודי, אשר כולם להאריך מן האתר מעוך. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הקרנת תמונות של אקסונים לבטא EGFP בחוט השדרה לאחר ויוו אלקטרופורציה של DRGs. (א) השלכה האורך של האקסונים התווית על-ידי EGFP בתוך עמודת הגבי, שורשי L4/L5 העזוב. שיבוץ תמונות A1 ו- A2 הצג תצוגות המוגדל של שני מלבני האזורים המסומנים בחלונית (א). A1 תערוכות תצוגה מפורטת של אקסונים בעמודה הגבי. A2 תערוכות תצוגה מפורטת של אקסונים באזור הזנת השורשים העזוב (DREZ). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) הסאגיטלי השלכה של האקסונים התווית על-ידי EGFP בתוך העמודה הגבי. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 1
סרט 1: שחזור תלת-ממד של אקסונים לבטא EGFP בחוט השדרה לאחר ויוו אלקטרופורציה של DRGs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר פעולות כירורגיות דורשים תשומת לב מיוחדת. L4 ו- L5 DRGs (מיקום של somas), אשר שולטים בעצב, צריך להיות מזוהה כראוי ו מוזרק עם ג'ין בונה. אחרת, תיוג-GFP תהיה חסרה ב אקסונים בעצב. ניתן להציג את crests iliac בתור ציוני דרך אנטומיות שימושיות לאתר L4 ו- L5 DRGs. במרבית העכברים, היבט משותף בין חוליות L5 ו L6 היא תכתיר iliac crests12. לחלופין, L3 DRG ניתן לבחור במקום L5, במיוחד עבור מבחני כגון אימונוהיסטוכימיה או תספיג13, כמו חשיפה כירורגי של L5 DRG פוגש בדרך כלל בקשיים עקב מיקום עמוק ושם אספקת דם עשירה. בנוסף, הניתוח כולו צריך להימנע DRG מזיק סביב מבנים, כולל חוט השדרה, שורש העצב. השלב השני של מבצעי קריטי ראוי לציין הוא ההזרקה. לצבוע מהר ירוק היה מעורב עם הפתרון של ג'ין בונה כדי להמחיש את הפתרון נפלט מן המחט ומפוזר ב הרפובליקה. זריקה מוצלחת צריך להראות DRG ברור עגול בצורת שתואר על ידי הפלורסנט. אם הפתרון עם תיוג הפלורסנט ידלוף החוצה מן הרפובליקה תוך הזרקת, הגב וושוב-כוונון של עומק של קצה המחט מיקרו יכול להבטיח הזרקה מלאה של כל פתרון בתוך הקפסולה DRG. הימנע משפדים את DRG ב יותר משלושה מוקדים. עוד, מתון הדימום הוא נמנע בדרך כלל לאחר ההזרקה DRG, כפי DRGs בחוזקה כמוסות עם רשת venosum13. זה חשוב לעצור את הדימום כך לא יהיה דם בידוד פני DRG של אלקטרודות במהלך אלקטרופורציה אלקטרופורציה מוצלח תלוי חשמלי התמרה חושית הנוכחי, PBS הפתרון יכול להיות מיושם על האלקטרודה. לבסוף, האתר בעצב בו התרסק עם מלקחיים צריך להיות מסומן עם מיקרו-תפירת, כי האתר פגיעה בלתי נראה תחת המיקרוסקופ וצריך להיות המצוין כנקודת ההתחלה של התחדשות האקסון לניתוח תמונה מאוחר יותר. אם הקשר תפר epineural באתר למחוץ תיפול ואחרי זלוף בעלי חיים לנתיחה, חיוני לתייג מחדש באותו האתר בתפר מיד על העצב מחברים-קבוע בעת כניסת בהשפעת ההתאהבות היא עדיין לזיהוי.

בין טכניקות תרביות תאים, אלקטרופורציה יש שיעור גבוה יותר של תרביות תאים. על פי המחקר, הקצב תרביות תאים של נוירון DRG מיקרו Rna או siRNAs לאחר ויוו אלקטרופורציה קרובה 90%. חשוב מכך, אין ויוו אלקטרופורציה היא הרבה פחות זמן רב יותר שיטות מבוססות-וירוס, אשר דורשים אריזה וירוס של הגן הרצוי בונה. ככל שאנו יודעים, אף-על-פי תקנים מבוססי lipofectamine ויוו יש פחות רעילות מאשר אלקטרופורציה, lipofectamine לא עובד על הנוירונים DRG במיוחד, לא בתוך vivo ולא במבחנה. ראוי לציין, המתודולוגיה הנוכחית יש מספר מגבלות טכניות. ראשית, משך הזמן של siRNA יעילות כדי להפיל את ג'ין-של-ריבית הוא קצר יותר מבוסס-וירוס מסירת פלסמידים. לכן, כל התהליך החל אלקטרופורציה כדי להקריב חיה יש אשר אמור להסתיים תוך 4-6 ימים14. בנוסף, הניתוח מבוצע תחת המיקרוסקופ דורש תרגול מיומנות ידנית כלשהי. עבור טירון, משך הניתוח הוא בדרך כלל זמן רב יותר מהצפוי. המינון הרדמה המתקדם העכבר חייב להיות נשלט היטב כדי למנוע תמותה לא רצויים. לבסוף, שיטוח בעצב את גורם חופפים של אקסונים כאשר פלורסנטי דימות ניצוח. הדמיה העצבים שיטוח עם מיקרוסקופ קונפוקלי הוא אפשרות חלופית.

מבחינה אנטומית, הנוירונים חושית DRG יש שני סניפים עצב - הענף יורד היקפיים, הסניף המרכזי עולה מקרין לתוך העמודה הגבי של חוט השדרה10. המתודולוגיה הנוכחי מציג גם תיוג הייחודי של העמודה הגבי של חוט השדרה. לפיכך, מתודולוגיה דומה יכול לשמש כמודל לחקור האקסון חושית חידוש לאחר פגיעה בחוט השדרה. בשילוב עם טכניקות ניקוי רקמות11, מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונאלי או מיקרוסקופ אור גיליונות יכול להיות מועסק על הדגימה חוט השדרה שנוקה לבנות תמונות תלת-ממד המשוחזרת של אקסונים סנסוריים בתוך העמודה הגבי של חוט השדרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחקר מומן (מוענק F-Q. צ) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), קרן Neilsen ה. קרייג ושל קרן BrightFocus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square wave electroporation system BTX Harvard Apparatus 45-0052 For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0524 For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III Parker Instrumentation 1096 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller NARISHIGE PC-10
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. 1902328
Stereo Dissection Microscope Leica M80
Microsurgery Rongeur F.S.T 16221-14
Microsurgery Forceps FST by DUMONT, Switzerland 11255-20 Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary World Precision Instruments, Inc. TW100-4 10 cm, standard wall
Tape Fisherbrand 15-901-30 For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402 Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC003 Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 Dharmacon CP-004500-01-05 Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit Invitrogen Purelink K210016 GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye Millipore-Sigma F7252 For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine Putney, Inc NDC 26637-731-51 Anesthesia induction
Xylazine AnaSed NDC 59399-110-20 Anesthesia induction
Acetaminophen McNeil Consumer Healthcare NDC 50580-449-36 Post-surgical pain relief

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saijilafu,, et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
  2. Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
  3. Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
  4. Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
  5. Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
  6. Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
  7. Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  8. Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
  11. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
  12. Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
  13. Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
  14. Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).

Tags

מדעי המוח גיליון 139 אלקטרופורציה העזוב שורש גנגליון DRG ויוו הנדסה גנטית נוירון חישה התחדשות האקסון פגיעה במערכת העצבים ההיקפית תרביות תאים נגיפי
התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: <em>In Vivo</em> אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Q.… More

Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Q. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (139), e58171, doi:10.3791/58171 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter