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Neuroscience

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/58171
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Abstract

Elektroporation ist eine wesentliche nicht-viralen Gen Transfektion Annäherung an DNA Plasmide oder kleinen RNA-Molekülen in Zellen bringen. Eine sensorische Neuron im Dorsal Root Ganglion (DRGs) erstreckt sich ein einziges Axon mit zwei Niederlassungen. Ein Zweig geht an die peripheren Nerven (periphere Zweig) und der andere Zweig tritt das Rückenmark durch den Dorsal Root (zentrale Niederlassung). Nach der neuronalen Verletzung regeneriert der peripheren Zweig robust während der zentralen Zweig nicht regenerieren. Aufgrund der hohen Regenerationsfähigkeit hat sensorische Axon Regeneration als Modellsystem verbreitet Säugetier-Axon Regeneration im peripheren Nervensystem (PNS) und das zentrale Nervensystem (ZNS) zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll über vorher festgelegten Ansatz zur Genexpression in Reife sensorischen Neuronen in Vivo über Elektroporation zu manipulieren. Basierend auf Transfektion mit Plasmide oder kleine RNS Oligos (SiRNAs oder Micro-RNAs), ermöglicht der Ansatz sowohl Verlust und Gewinn-of-Function-Experimente, die Rolle der Gene-of-Interests oder Micro-RNAs in Regulation der Axon Regeneration in Vivozu studieren. Darüber hinaus kann die Manipulation der Gene Expression in Vivo innerhalb einer relativ kurzen zeitlichen Verlauf sowohl räumlich als auch zeitlich gesteuert werden. Dieses Modellsystem bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen mit denen Säugetier-Axon Regeneration regulierten in Vivoist.

Introduction

Verletzungen des Nervensystems verursacht durch neuronale Trauma oder verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen führen in der Regel Mängel in motorischen, sensorischen und kognitiven Funktionen. Vor kurzem wurde viel Aufwand regenerative Potenz Wiedereinsetzung in den vorigen in Erwachsenen Neuronen zur Wiederherstellung der physiologischen Functionsof verletzte Nervenzellen1,2,3gewidmet. Sensorische Neuronen in der DRG sind eine Ansammlung von Nervenzellen, die verschiedene sensorische Reize wie Schmerz, Temperatur, Touch oder Körperhaltung, an das Gehirn vermitteln. Jedes dieser Neuronen ist Pseudo-unipolar und enthält ein einziges Axon, das mit einer Erweiterung in Richtung der Peripherie und der andere Zweig in Richtung Rückenmark4gabelt. Die Erwachsenen sensorischen Neuronen in DRGs gehören ein paar Reifen Säugetier-Neuronen bekannt, deren Axone aktiv nach Verletzungen zu regenerieren. Daher sind Verletzungen von sensorischen Axonen ausgiebig als entscheidende Modell eingesetzt worden, um die Mechanismen der axonalen Regeneration in Vivozu studieren.

In Vivo gen Transfection Techniken, die in der Regel weniger zeitaufwendig, einrichten und flexibler als die Verwendung von transgenen Tieren sind, spielen wichtige Rollen im Studium der Funktionen der Gene und Signalwege im Nervensystem. Die wichtigsten Techniken können kategorisiert werden, in zwei Ansätze: Instrument und Virus-basierte5. Viral-basierte in-Vivo -gen Lieferung in Erwachsenen Neuronen bieten präzise raumzeitlichen Manipulation der Gen-Expression-6. Arbeitsintensive Prozesse sind jedoch im viral-basierte Methoden wie die Produktion und Reinigung der Viruspartikel enthält das gewünschte gen beteiligt. Darüber hinaus könnten viele virale Vektoren das Immunsystem des Wirtes, aktivieren, die stören der Datenerfassung, Datenanalyse und die Interpretation der experimentellen Ergebnisse möglicherweise in die Irre führen kann. Elektroporation, ein typisches Instrument-basierte Transfektion Ansatz nutzt einen elektrischen Impuls erhöhen die Durchlässigkeit der Zell- und Kernmembran vorübergehend, der den Zustrom von Gen-Vektoren oder kleine RNS Oligos aus Raum außerhalb der Zellen7 begünstigt . In-vitro- Elektroporation ist weithin anerkannt als eine vorübergehende aber höchst effiziente Strategie für die Manipulation gezielt Genexpression in vielen Zelltypen. Obwohl nur mit geringer transfecting Effizienz im Vergleich zu viralen Vektoren in Vivo Elektroporation zu transiente Genexpression führt, hat verschiedene Vorteile gegenüber viralen Ansätzen. Zum Beispiel kann es auf fast allen Geweben und Zellen7,8,9angewendet werden. Darüber hinaus entweder Plasmide Kodierung Gene-of-Interest oder kleine RNS Oligos (z. B. SiRNAs, Micro-RNAs) gegen bestimmte Protokolle können direkt in das Zielgewebe injiziert und dann elektrisch gepulst, die machen des Verfahrens weniger Arbeit - und Zeit - Konsum. Darüber hinaus ist es möglich, mehrere Plasmide und RNS Oligos gleichzeitig mit einzelnen Electroporation transfecting.

Wir haben eine in Vivo Elektroporation Ansatz zur Genexpression in Erwachsenen Maus sensorischen Neuronen zu manipulieren und erfolgreich im Einsatz und Validierung solcher Ansatz in zahlreichen Pionier Studien1,2,3 ,8,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um die Nutzung dieses Ansatzes für zukünftige Studien der Säugetier-Axon Regeneration zu erleichtern.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß dem tierischen Protokoll durch die Johns Hopkins institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt durchgeführt.

(1) Materialien und Reagenzien

  1. Tiere
    1. Verwenden Sie sechs Wochen alten weiblichen CF1 Mäuse mit einem Gewicht von 30 – 35 g für die Experimente.
      Hinweis: Die Mäuse waren Gruppe untergebracht (5 Mäusen pro Käfig) in individuell belüfteten sterilisierte Käfigen mit 1/4" Corn Cob Betten und 2" quadratischen Nestlets für den Nestbau. Die Käfige wurden in einem kontrollierten 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus beibehalten und die Raumtemperatur war zwischen 19,4 ° C und 25 ° C. Die Mäuse wurden mit globale Nagetier Diät Wasser und automatische Lieferung System eingespeist.
  2. Instrumente
    1. Folgende chirurgische Instrumente nutzen, um effizient die Operation durchführen: Einwegspritzen (27 G, 1,0 mL) für die intraperitoneale Injektion, Pelz, Clipper, Stereo-Dissektion Mikroskop, Mikro-Chirurgie-Zange, Schere Mikro-Chirurgie und kleine Knochen Rongeurs und sterilisierte Vlies Schwämme.
      Hinweis: Alle Instrumente und Materialien sind vor der Operation autoklaviert oder vorsterilisierten von den Herstellern. Während der Operation werden die Instrumente mit 75 % Alkohol weiterhin die Sterilisation besprüht.
  3. Betäubende Lösungen
    1. Verwenden Sie Betäubungsmittel Lösung #1 zu induzieren die Narkose und Anästhesie Lösung #2 vor DRG Injektion verwenden, um die Narkose aufrechtzuerhalten.
      1. Um Betäubungsmittel Lösung #1 zu machen, Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 mg/mL und 1,2 mg/mL zu verdünnen.
      2. Um Betäubungsmittel Lösung #2, verdünnen Sie avertin in steriler Kochsalzlösung in einer Endkonzentration von 20 mg/mL.
  4. Plasmid DNA und RNS Oligos
    1. Bereiten Sie die Plasmide mit dem kommerziellen Kit des Herstellers Protokolle entsprechend nach. Verdünnen Sie das Plasmid DNA in sterilen deionisiertes Wasser auf die Konzentration von 2,0 µg/µL.
    2. Fügen Sie schnell grüne Farbstofflösung zur Erreichung eine Endkonzentration von 0,005-0,01 % (V/V) zur besseren Visualisierung der DRG Gliederung beim Einspritzen.
    3. Auflösen der SiRNA oder MicroRNA Oligos in entsprechenden Puffer zur Verfügung gestellt von Herstellern, eine Endkonzentration an 50 µM zu erreichen.
  5. Mikro-Injektion Pipette
    1. Ziehen Sie die Kapillare Glas Mikropipette Puller und schneiden Sie die Spitze der Kapillare gezogenem Glaspipette mit Mikrochirurgie Schere, eine Öffnung mit einem ungefähren Außendurchmesser 50 µm zu generieren. Dann Sterilisieren Sie die Glaspipette unter UV-Licht auf einer sauberen Werkbank für 20 – 30 min. ca..
    2. Berg der sterilisierten Glaspipette auf die Pipette Halter mit einer intrazellulären Mikroinjektion verbunden verzichten System. Legen Sie die Parameter des Systems der Mikroinjektion 30 PSI Druck und 8 ms Dauer.
  6. Electroporation System
    1. Schließen Sie die Elektroden an das Rechtecksignal Elektroporation System und legen Sie die folgenden Parameter: 15 ms Impulse bei 35 V mit 950 ms-Takt für in Vivo Elektroporation.
  7. Perfusion und Befestigung Lösung
    1. Lösen Sie das Paraformaldehyd (PFA) Pulver in 1 X PBS in einer Konzentration von 4 % (w/V). Die PFA-Lösung bei 4 ° c Lagern

(2) experimentelle Verfahren

  1. Chirurgische Exposition von L4 und L5 DRGs
    1. Betäuben Sie die Maus über eine intraperitoneale Injektion von Betäubungsmittel Lösung #1 zuvor (mit Ketamin 100 mg/kg Körpergewicht und Xylazin 12 mg/kg Körpergewicht) zubereitet.
    2. Der OP-Bereich mit Fell Clipper zu rasieren.
      Hinweis: Da gibt es eine weitere Operation für linken Ischiasnerv Crush, kann das Fell am linken hinteren Oberschenkel gleichzeitig rasiert.
    3. Platzieren Sie den Mauszeiger auf die beheizte Decke (35,0 ° C) und überwachen Sie die rektale Temperatur mit einem Temperaturfühler.
    4. Um die Narkose zu testen, drücken Sie die Zehen und Tail der Maus und beobachten Sie die Verhaltensreaktionen.
    5. Kleben Sie die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
    6. Wischen Sie den OP-Bereich mit jodophor Lösung und dann mit 75 % Alkohol, die jodophor vor dem Schneiden der Haut zu entfernen.
    7. Tragen Sie ophthalmologischen Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    8. Vor dem Schnitt markieren Sie beide Seiten der Beckenkamm Wappen mit einem feinen Filzstift. Zeichnen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten der Beckenkamm Wappen zu erleichtern, die Positionen der L5 DRGs zu identifizieren.
    9. Machen Sie einen 3 cm Schnitt entlang der Mittellinie des unteren Rücken mit Mikro-Schere. Darüber hinaus lösen Sie die Paraspinous Muskeln, wie der Musculus Multifidus und der Musculus Longissimus Lumborum von L3 bis S1 Dornfortsätze und setzen Sie der Facettengelenke der L4-5 und L5-6 aus.
    10. Verwenden Sie eine Mikro-Rongeur, um der Facettengelenke der L4-5 und L5-6 zu entfernen. Darüber hinaus entfernen Sie Links neuralen Bogens von L4 und L5, die dorsale Seite der DRGs verfügbar zu machen.
  2. DRG-Injektion
    1. Injektion von Betäubungsmittel Lösung #2 (mit avertin 200 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal weiterhin die Betäubung vor der DRG-Injektion.
    2. Die Kapillare Glaspipette Plasmid DNA oder RNS Oligos (1 µL pro DRG) bestücken.
    3. Die Kapillare Glas PIPETTENSPITZE vorsichtig in die DRG einführen.
    4. 1,0 µL Lösung von DNA Plasmide allmählich zu injizieren oder RNS Oligos in die DRG mit der intrazellulären Mikroinjektion verzichten Systeme (30 Psi, 8 ms).
      Hinweis: Die Dauer der Injektion sollte nicht weniger als 5 Minuten dauern.
  3. Elektroporation
    1. Fallen Sie PBS auf Tipps der Elektroden.
    2. Bereinigen Sie die Blutung mit sterilisierten quadratische Baumwoll Gaze.
    3. Das Ziel DRG mit den Elektroden sanft Kneifen und 5 quadratische elektrische Impulse mit dem Elektroporation-System anwenden.
    4. Schließen Sie die Muskel und Haut Schichten jeweils mit 5: 0-Nylon-Fäden.
    5. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer beheizten Decke (35,0 ° C) unter Beachtung der engen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen vollständig wiedererlangt hat. Die Maus zu Hause Käfig zurück, nachdem es vollständig von der Narkose erholt hat.
      Hinweis: Es dauert ca. 60 min. für die Maus aus der Narkose auf 37 ° C Decke vollständig erholen. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung um postoperative Schmerzen zu lindern.
  4. Ischiasnerv Crush
    1. Betäuben Sie zwei oder drei Tage (abhängig von den Versuchsplan) nach der DRG-Elektroporation, die Maus intraperitoneal mit Narkose Lösung #2 (mit avertin 400 mg/kg Körpergewicht).
    2. Kleben Sie die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
    3. Machen Sie einen 1 cm Schnitt 0,5 cm auf der linken Seite entlang der Mittellinie. Geschnitten Sie die Muskeln, wie Musculus Muskel und Piriformis Muskel Längsrichtung. Setzen Sie das Segment des Nervus ischiadicus zwischen größeren sciatic Foramen und sciatic Kerbe.
    4. Crush der Nerv mit Mikrochirurgie Zangen für 12 s und Mark die Crush-Website mit einer 10-0 Nylon Epineural Naht. Machen Sie einen Knoten auf der duralen Membran anlässlich die Crush-Website.
    5. Schließen Sie die Muskel und Haut Schichten mit 5: 0-Nylon-Naht.
    6. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer beheizten Decke (35,0 ° C) mit großer Aufmerksamkeit, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen vollständig wiedererlangt hat. Die Maus zu Hause Käfig zurück, nachdem es vollständig von der Narkose erholt hat.
      Hinweis: Es dauert ca. 60 min. für die Maus aus der Narkose auf 37 ° C Decke vollständig erholen. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung um postoperative Schmerzen zu lindern.
  5. Maus-Perfusion, DRG und Ischiasnerv Ernte
    1. Zwei oder drei Tage nach der Ischiasnerv crush (abhängig von den experimentellen Design), die Maus intraperitoneal mit Narkose Lösung #2 zu betäuben.
    2. Durchspülen der Maus-Transcardially mit PBS (pH 7,4) gefolgt von eiskalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,5) mit PBS-Puffer.
    3. Nach Perfusion trennen die DRGs zusammen mit den Nervenwurzeln und Ischiasnerv vor das Knie vorsichtig mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten unter dem Mikroskop Dissektion. Legen Sie den Ischiasnerv direkt in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C.
  6. Imaging und Messung der Fluoreszenz-markierten sensorische Axone
    1. Die beigefügten Gewebe und Membran auf den festen Ischiasnerv mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten sorgfältig unter dem Mikroskop Dissektion abzustreifen. Dann tauschen die 4 % PFA mit PBS und Waschen der Nerv drei Mal.
    2. Legen Sie den Ischiasnerv auf einer Folie und halten Sie gerade. Fügen Sie 80 µL antifade Lösung um den Nerv, dann legen Sie einem deckgläschen auf. Glätten Sie das ganze montierte Gewebe mit Druck.
    3. Das invertierte Epifluorescent Mikroskop ausgestattet mit Zubehör für Mosaik-Akquisition und Bildverarbeitung legen Sie plattgewalzt Gewebe auf.
      Hinweis: Die Anregung und Emission Längen sind 488 nm und 509 nm. Es ist auch möglich, mehrere überlappende Bilder manuell und Nähen Sie die Bilder zusammen mit ImageJ mit dem Mosaik-Plug-in.
    4. Bei der Messung der Länge des regenerierten Axone verfolgen Sie alle identifizierbare mit der Bezeichnung von fluorescently Axone in den Ischiasnerv von der Crush-Website (gekennzeichnet mit dem 10-0-Epineural-Naht) an den distalen Axon enden.

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Representative Results

Zur Quantifizierung der Zytotoxizität des aktuellen Protokolls und zu validieren, dass Transfektion in Vivo DRG Elektroporation ist hoch genug, wir injiziert und elektroporiert eindringmittel getaggt MicroRNA oder SiRNA in L4 und L5 DRGs. Die freistehende DRGs wurden durch Cryo-schneiden und Immunohistochemistry (Abbildung 1A-B) verarbeitet. Wenn die Zelle Überlebensrate nach Injektion und Elektroporation schätzen, waren die intakte DRGs von L4 und L5 geerntet und verarbeitet durch Cryo-schneiden und Immunohistochemistry. Die Neuron-dichten, mit Tuj1 Färbung, reflektiert zeigen keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu der Neuron-dichten von intakten DRGs gibt an, dass die Elektroporation nicht dazu, neuronaler Zelltod (Abbildung 1C veranlassen). Die Transfektion wurde als das Verhältnis zwischen der Anzahl von tagged RNA Oligo Neuronen und die Anzahl der Tuj1-positiven Neuronen berechnet. Die mittlere Transfektion MiRNA ist 80,7 ± 4,3 % und die SiRNA 94,2 ± 0,3 % (Abbildung 1D). Bei der Anwendung der aktuellen in-Vivo Elektroporation Methode um Axon Regeneration zu studieren, war der Ischiasnerv abgeflacht und abgebildet. Jeder regenerierte Axon mit markanten Flugbahn und erkennbaren distalen Axon Ende kann von der Crush-Website angegeben durch die Naht Knoten (Abbildung 2) zurückverfolgt werden. Darüber hinaus wir elektroporiert der DRGs mit EGFP Plasmide und das Rückenmark von T7 zu L2 zusammen mit dorsalen Wurzeln L4 und L5 nach 7 Tagen geerntet. Wir verwendet eine etablierte Gewebe clearing-Protokoll — uDISCO um das Rückenmark11zu löschen. Die dorsale Spalte mit der Bezeichnung von EGFP Axone im Rückenmark wurden mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet und dann in der Längs- und der sagittalen Projektion von Bildern (Abbildung 3) erkennen. Alternativ können die konfokale Bilder mit Mikroskopie-Visualisierungs-Software zu rekonstruieren, ein 3D Bild (Film 1) verarbeitet werden.

Figure 1
Abbildung 1 : Immunohistochemistry DRG Cryo-Abschnitts nach der Elektroporation von eindringmittel getaggt unspezifische MicroRNA oder SiRNA in Vivo. (A) Vertreter Cryo-Teil der DRG Gewebe injiziert und elektroporiert mit fluoreszent-Tags (Dy547) nicht-Zielorganismen MicroRNAs. Linkes Bild: das Bild der das Fluoreszenzsignal (rote Farbe) von eindringmittel-Tags (Dy547) nicht-Zielorganismen MicroRNAs. Mittleres Bild: Immuno-Färbung (grüne Farbe) des Tuj1 mit einer Alexa488 Fluorophor auf den sekundären Antikörper. Bild rechts: das zusammengefügte Bild der vorangegangenen zwei Kanäle. Maßstabsleiste = 100 µm.(B) Vertreter Cryo-Abschnitt der DRG Gewebe injiziert und elektroporiert mit fluoreszent markiert (Cy3) Nichtziel-SiRNAs. Linkes Bild: das Bild der das Fluoreszenzsignal (rote Farbe) von eindringmittel markiert (Cy3) Nichtziel-SiRNAs. Mittleres Bild: Immuno-Färbung (grüne Farbe) des Tuj1 mit einer Alexa488 Fluorophor auf den sekundären Antikörper. Bild rechts: das zusammengefügte Bild der vorangegangenen zwei Kanäle. Die Skala bar stellt 100 µm. (C) die Neuron-Dichte eines intakten DRG-Cryo-Sektion ist 809.6 ± 14,2 Zellen/mm2 (N = 6) und ein injizierten DRG Cryo-Bereich ist 801.6 ± 27,4 Zellen/mm2 (N = 6), bedeuten ± SEM, Student t-test, NS: keine Bedeutung. Drei Mäuse wurden durchgeführt in Vivo DRG Elektroporation auf dem linken L4 und L5 DRGs mit tagged SiRNA. Sowohl Links und rechts L4 und L5 DRGs sind nach 48 h geerntet und verarbeitet durch Cryo-Abschnitt und Immunohistochemistry. Jede DRG hat in ungefähr 60 Scheiben geschnitten wurde und die Dicke der Scheibe beträgt 10 μm. Drei Scheiben von jeder DRG ausgewählt von 200 μm und gemittelt. (D) die Transfektion bei tagged MiRNA ist 80,7 ± 4,3 % (N = 4) und tagged SiRNA 94,2 ± 0,3 % (N = 6), bedeuten ± SEM Drei Mäuse wurden durchgeführt in Vivo DRG Elektroporation auf dem linken L4 und L5 DRGs mit tagged SiRNA und zwei Mäuse mit tagged MiRNA. Die DRGs sind nach 48 h geerntet und verarbeitet durch Cryo-Abschnitt und Immunohistochemistry. Jede DRG hat in ungefähr 60 Scheiben geschnitten wurde und die Dicke der Scheibe beträgt 10 μm. Drei Scheiben von jeder DRG ausgewählt von 200 μm und gemittelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Ectopically ausgedrückt EGFP zeigt regeneriert neuronalen Axone im Ischiasnerv nach Niederschlagung Verletzungen. Die Axone in einem abgeflachten Ischiasnerv litt quetschverletzung sind mit EGFP (grüne Fluoreszenz) transportiert von den Somas Axone beschriftet. Die rote Linie zeigt die Position des vernichtenden Verletzung Aufstellungsort, die ursprünglich chirurgisch durch eine Box-Knoten gekennzeichnet war. Die weiße Pfeilspitze, Pfeil und Sterne zeigen drei markanten Axon endet, die von der Crush-Website zu erweitern. Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Projektion von Bildern von EGFP exprimierenden Axone im Rückenmark nach in-Vivo Elektroporation von DRGs. (A) längs Projektion der EGFP beschriftet Axone innerhalb der dorsalen Spalte und die dorsalen Wurzeln L4/L5. INSET Bilder A1 und A2 zeigen vergrößerte Ansichten aus zwei rechteckigen Flächen, die im Bedienfeld "(A) gekennzeichnet. A1 stellt eine detaillierte Ansicht der Axone in der dorsalen Spalte. A2 zeigt eine detaillierte Ansicht der Axone im Einlaufbereich Dorsal Root (DREZ). Maßstabsleiste = 200 µm. (B) sagittale Projektion der EGFP beschriftet Axone innerhalb der dorsalen Spalte. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Movie 1: 3D-Rekonstruktion von EGFP exprimierenden Axone im Rückenmark nach in-Vivo Elektroporation von DRGs. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Mehrere chirurgische Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die L4 und L5 DRGs (Lage des Somas), die den Ischiasnerv zu beherrschen, müssen korrekt erkannt und mit Genkonstrukte injiziert werden. Andernfalls werden die GFP-Kennzeichnung fehlt im Ischiasnerv Axone. Der Beckenkamm Wappen können als nützliche anatomischen Landmarken, L4 und L5 DRGs ermitteln angesehen werden. Bei den meisten Mäusen ist die Facette gemeinsame zwischen L5 und L6 Wirbeln proximate Beckenkamm Wappen12. Alternativ kann L3 DRG statt L5, vor allem für Assays wie Immunohistochemistry oder western-Blot13, gewählt werden, wie chirurgische Exposition von L5 DRG in der Regel große Schwierigkeiten aufgrund einer tiefen Lage und reiche Blutversorgung trifft. Die ganze Operation sollte auch schädliche DRG umgebenden Strukturen, einschließlich das Rückenmark und die Nervenwurzel vermeiden. Der zweite wichtige operative Schritt erwähnenswert ist die Injektion. Der Farbstoff schnell grün mischte mit Genkonstrukte zu visualisieren die Lösung aus der Nadel ausgeworfen und diffundieren in die DRG-Lösung. Eine erfolgreiche Injektion sollte eine klare Runde Form DRG von fluoreszierenden Farbstoff skizziert zeigen. Wenn die Lösung mit fluoreszierender Farbstoff aus der DRG während der Injektion Austritt, kann eine hin- und Herbewegung Feinabstimmung auf das Ausmaß an der Spitze des Mikro-Nadel komplette Injektion alle Lösung in die DRG-Kapsel sicherstellen. Vermeiden Sie durchbohrt die DRG an mehr als drei verschiedenen Standorten. Weitere, leichte Blutungen ist in der Regel unvermeidlich nach DRG-Injektion, da DRGs eng mit Rete Venosum13gekapselt sind. Es ist wichtig, damit nicht Blut, die Isolierung von der Oberfläche der DRG von Elektroden während der Elektroporation Blutung zu stoppen. Erfolgreiche Elektroporation richtet sich nach aktuellen elektrische Transduktion und PBS-Lösung kann auf die Elektrode eingesetzt werden. Zu guter Letzt die Website auf den Ischiasnerv wo ist gebrochen mit Zange sollte markiert werden mit Mikro-Nähen, weil Verletzung Aufstellungsort unsichtbar unter die Lupe genommen ist und als Ausgangspunkt der Axon Regeneration für die Bildanalyse später angegeben werden muss. Wenn die Epineural Naht Knoten am Standort Crush nach tierischen Perfusion und Dissektion ablöst, ist es wichtig, Re-label die gleichen Website mit einer Naht sofort auf den Nerv PFA-behoben wenn die Crush-induzierte Einzug noch erkennbar ist.

Unter Transfection Techniken hat Elektroporation eine höhere Rate der Transfektion. Laut unserer Studie ist die Transfektion der DRG-Neuron für Micro-RNAs oder SiRNAs nach in-Vivo Elektroporation nahezu 90 %. Noch wichtiger ist, ist in Vivo Elektroporation weit weniger zeitaufwändig als Virus-basierte Methoden, die Virus-Verpackung der gewünschten Genkonstrukte erfordern. Soweit wir wissen, obwohl die Lipofectamine-basierte in-Vivo Transfektion weniger Toxizität als Elektroporation hat, die Lipofectamine funktioniert nicht auf DRG-Neuronen besonders, weder in Vivo oder in Vitro. Bemerkenswert, die aktuelle Methode hat mehrere technische Einschränkungen. Erstens ist die Dauer der Wirksamkeit der SiRNA zerschlugen die Gen-of-Interest kürzer als die Virus-basierte Bereitstellung von Plasmiden. Daher muss die ganze Prozedur von Elektroporation, Tieropfer in 4 – 6 Tage14fertig gestellt. Darüber hinaus erfordert die Operation unter dem Mikroskop Praxis und einige manuelle Geschicklichkeit. Für einen Anfänger ist die Dauer der Operation oft länger als erwartet. Die Narkose Dosis verwaltet, die Maus muss sorgfältig kontrolliert werden, um unerwünschte Sterblichkeit zu verhindern. Schließlich verursacht Abflachung der Ischiasnerv Überlappung der Axone, bei der Durchführung von Epifluorescent Bildgebung. Imaging die Abplattung Nerven mit einem konfokalen Mikroskop ist eine Alternative.

Die DRG sensorischen Neuronen haben anatomisch, zwei axonale Verzweigungen - die peripheren absteigenden Ast und die aufsteigenden zentrale Ast Projektion in der dorsalen Spalte des Rückenmarks10. Die aktuelle Methode zeigt auch die unverwechselbare Kennzeichnung der dorsalen Spalte des Rückenmarks. So kann eine ähnliche Methodik als Modell verwendet werden, um sensorische Axon Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks zu untersuchen. In Kombination mit Gewebe-Clearing Techniken11, konventionelle konfokale Mikroskopie oder Licht-Blatt Mikroskopie auf der geräumten Rückenmark Probe einsetzbar, rekonstruierte 3D-Bilder von sensorischen Axonen innerhalb der dorsalen Spalte des Rückenmarks zu bauen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Studie wurde gefördert (F-q ausgezeichnet. Z.) von NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Craig H. Neilsen Foundation und der BrightFocus-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square wave electroporation system BTX Harvard Apparatus 45-0052 For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0524 For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III Parker Instrumentation 1096 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller NARISHIGE PC-10
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. 1902328
Stereo Dissection Microscope Leica M80
Microsurgery Rongeur F.S.T 16221-14
Microsurgery Forceps FST by DUMONT, Switzerland 11255-20 Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary World Precision Instruments, Inc. TW100-4 10 cm, standard wall
Tape Fisherbrand 15-901-30 For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402 Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC003 Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 Dharmacon CP-004500-01-05 Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit Invitrogen Purelink K210016 GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye Millipore-Sigma F7252 For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine Putney, Inc NDC 26637-731-51 Anesthesia induction
Xylazine AnaSed NDC 59399-110-20 Anesthesia induction
Acetaminophen McNeil Consumer Healthcare NDC 50580-449-36 Post-surgical pain relief

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ausgabe 139 Elektroporation Neurowissenschaften Dorsal Root Ganglion DRG in Vivo Genmanipulation sensorischen Neuron Axon Regeneration periphere Nervenverletzung nicht-viralen Transfektion
Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: <em>In Vivo</em> Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion
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Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Q.… More

Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Q. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (139), e58171, doi:10.3791/58171 (2018).

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