Summary
Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.
Abstract
Elektroporasyon, DNA plazmidleri veya küçük RNA molekülleri hücre içine tanıtmak için bir temel viral gen transfection yaklaşımdır. Duyusal bir nöron dorsal kök gangliyon (DRGs) içinde iki şubeleri ile tek bir akson genişletir. Bir şube gider için periferik sinir (periferik Şube) ve diğer şube omurilik dorsal kök (Merkez Şube) yoluyla girer. Merkez Şube değil yeniden oluşturmaz, ancak sonrası sinir yaralanması, periferik şube sağlam yeniden oluşturur. Yüksek yeniden üretim kapasitesi nedeniyle, duyusal axon rejenerasyon yaygın bir modeli sistem olarak memeli axon rejenerasyon periferik sinir sistemi (PNS) ve merkezi sinir sistemi (MSS) eğitim için kullanılmıştır. Burada, biz olgun duyusal nöronlar içinde vivo elektroporasyon yoluyla Gen ifadesinin işlemek için daha önce kurulan yaklaşım iletişim kuralı tanımlamak. Transfection plazmidleri veya küçük RNA oligos (çift veya mikroRNA'lar) bağlı olarak, genler çıkarlarını veya mikroRNA'lar axon yenilenme içinde vivoYönetmelikte rolleri çalışmaya her iki kaybı ve kazanç-in-fonksiyonlu deneyler için yaklaşım sağlar. Buna ek olarak, gen ifade içinde vivo manipülasyon dağınık şekilde ve geçici bir nispeten kısa süreli sahası içinde kontrol edilebilir. Bu modeli sistem tarafından memeli axon rejenerasyon düzenlenmiş vivo içindeolan moleküler mekanizmaları araştırmak için eşsiz bir araç sağlar.
Introduction
Sinir sisteminde yaralanmaları sinirsel travma nedeni veya çeşitli nörodejeneratif hastalıklar genellikle motor, duyusal ve bilişsel işlevler hatalarına neden. Son zamanlarda, çok çaba fizyolojik functionsof yaralı nöronlar1,2,3geri yüklemek için yetişkin nöronlar rejeneratif güç yeniden kurulması için tahsis edilmiştir. Duyusal DRG nöronlarda sinir hücrelerinin ağrı, sıcaklık, dokunmatik veya vücut duruşu, beyin gibi farklı duyusal uyaranlara ifade bir küme vardır. Her bu nöronların sözde tek kutuplu ve çevre doğru uzanan bir dal ve doğru omurilik4başlık diğer dal ile bifurcates tek bir akson içerir. Onların aksonlar aktif yaralanma sonra yeniden oluşturmak için bilinen birkaç olgun memeli nöronlar DRGs yetişkin duyusal nöronlarda arasındadır. Dolayısıyla, duyusal aksonlar yaralanma yaygın olarak çok önemli bir model olarak aksonal yenilenme içinde vivomekanizmaları incelemek için istihdam edilmiştir.
Genellikle daha az zaman alıcı kurmak ve transjenik hayvanlar kullanmaktan daha esnek, in vivo gen transfection teknikleri, genlerin fonksiyonlarının eğitim ve yolları sinir sisteminde sinyal önemli roller oynayan edilmiştir. Ana teknikleri içine iki yaklaşımlar kategorize edilebilir: enstrüman ve virüs tabanlı5. Vivo Viral tabanlı gen teslim yetişkin nöronlar içinde kronolojik zamanmekansal manipülasyon kesin gen ifade6sağlayabilir. Ancak, emek yoğun işlemleri üretim ve arıtma istenilen gen içeren viral parçacıkların gibi viral tabanlı yöntemleri katılmaktadırlar. Buna ek olarak, birçok viral vektörler-ebil harekete geçirmek veri toplama, veri analizi ile engel ve muhtemelen deneysel sonuçlar yorumlanması saptırmak olan ana bilgisayarı bağışıklık sistemi. Gen vektörel çizimler veya küçük RNA oligos hücreleri7 dışında uzaydan akını ayrıcalıklı kılar geçici, hücre ve nükleer membran geçirgenliği artırmak için elektrikli bir darbe çoğalmasıyla, tipik araç tabanlı transfection yaklaşım kullanır . Vitro Elektroporasyon yaygın birçok hücre tipleri hedeflenen gen ifade değiştirmek için geçici ama son derece etkili bir strateji olarak kabul edilmektedir. Vivo Elektroporasyon sadece viral vektörler için karşılaştırıldığında düşük transfecting verimlilik ile geçici gen ekspresyonu için açar rağmen viral yaklaşımlar üzerinde çeşitli avantajları vardır. Örneğin, hemen hemen tüm doku ve hücreleri7,8,9için uygulanabilir. Buna ek olarak, belirli transkript karşı ilgi genleri veya küçük RNA oligos (Örneğin, çift, mikroRNA) kodlama ya plazmid olabilir doğrudan hedef dokusu içine enjekte ve sonra elektrikli darbeli, hangi yordamı daha az emek - yapmak ve zaman - tüketmek. Ayrıca, birden çok plazmit ve RNA oligos tek Elektroporasyon ile aynı anda transfecting mümkündür.
Biz bir vivo içinde adım yaklaşım gen ekspresyonu yetişkin fare duyusal sinir hücreleri içinde işlemek için kurulan ve başarıyla uygulanan ve böyle bir yaklaşım çok sayıda öncü çalışmalar1,2,3 doğrulanmış ,8,10. Burada, bu yaklaşım memeli axon rejenerasyon gelecekteki çalışmaları için kullanımını kolaylaştırmak için detaylı bir protokol mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Johns Hopkins kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış hayvan iletişim kuralı uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. malzeme ve Kimyasalları
-
Hayvanlar
- 6-hafta-yaşlı kadın CF1 fare deneyleri için 30-35 g ağırlığında kullanın.
Not: Grup yer alır (5 fareler kafesi başına) ile 1/4" Mısır koçanı yatak ve 2" kare nestlets iç içe geçme için ayrı ayrı havalandırılmış sterilize kafeslerde fareler vardı. Kafesleri kontrollü 12-h koyu döngüsünde muhafaza ve oda sıcaklığında 19.4 ° C ve 25 ° c arasında yapıldı. Fareler küresel kemirgen diyet ve otomatik su temin sistemi ile beslenen edildi.
- 6-hafta-yaşlı kadın CF1 fare deneyleri için 30-35 g ağırlığında kullanın.
-
Aletleri
- Verimli bir şekilde ameliyat yapmak için aşağıdaki cerrahi aletler kullanın: tek kullanımlık şırınga (27 G, 1.0 mL) mayi enjeksiyon için kürk kesme makinesi, stereo diseksiyon mikroskop, mikro-cerrahi forseps, mikro-cerrahi makas ve küçük kemik rongeurs ve steril dokuma olmayan sünger.
Not: Tüm aletler ve malzemeler ameliyattan önce autoclaved veya üretici tarafından önceden sterilize. Ameliyat sırasında aletler sterilizasyon korumak için %75 alkol ile püskürtülür.
- Verimli bir şekilde ameliyat yapmak için aşağıdaki cerrahi aletler kullanın: tek kullanımlık şırınga (27 G, 1.0 mL) mayi enjeksiyon için kürk kesme makinesi, stereo diseksiyon mikroskop, mikro-cerrahi forseps, mikro-cerrahi makas ve küçük kemik rongeurs ve steril dokuma olmayan sünger.
-
Anestezik çözümleri
- Anestezik çözüm #1 anestezi teşvik ve anestezi korumak için anestezi çözüm #2 DRG enjeksiyon önce kullanmak için kullanın.
- Anestezik çözüm #1 yapmak, ketamin ve 10 mg/mL ve 1.2 mg/mL nihai bir konsantrasyon, steril serum fizyolojik içinde xylazine sulandırmak.
- Anestezik çözüm #2 yapmak, 20 mg/mL nihai bir konsantrasyon, steril serum fizyolojik içinde avertin oranında seyreltin.
- Anestezik çözüm #1 anestezi teşvik ve anestezi korumak için anestezi çözüm #2 DRG enjeksiyon önce kullanmak için kullanın.
-
Plazmid DNA ve RNA Oligos
- Buna göre üreticinin iletişim kuralları takip ticari seti kullanarak plazmid hazırlayın. Plazmid DNA'lar 2.0 µg/µL konsantrasyon için steril deiyonize su oranında seyreltin.
- 0,005-0,01 son bir konsantrasyon ulaşmak için hızlı yeşil boya çözüm eklemek için DRG anahat daha iyi görselleştirme enjeksiyon sırasında % (v/v).
- Son bir konsantrasyon, 50 µM ulaşmak için üreticileri tarafından sağlanan karşılık gelen arabelleklerindeki siRNA veya mikroRNA oligos geçiyoruz.
-
Mikro-enjeksiyon pipet
- Micropipette çektirme kullanarak kapiller cam çekin ve bir açılış yaklaşık 50 µm dış çap oluşturmak için mikrocerrahi makasla çekti kapiller Cam Pipet ucu kesilmiş. O zaman yaklaşık 20-30 dk için temiz bir bankta UV ışık altında Cam Pipet sterilize.
- Steril Cam Pipet pipet kutusunda bir hücre içi mikroenjeksiyon bağlı bağlama sistemi dağıtmak. 30 psi basınç ve süresinin 8 ms mikroenjeksiyon sistem parametrelerini ayarlamak.
-
Elektroporasyon sistemi
- Elektrotlar kare dalga Elektroporasyon sistemine bağlanmak ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 15 ms bakliyat 35 V 950 ms aralıklarla vivo içinde adım için.
-
Perfüzyon ve çözüm sabitleme
- 1 x PBS bir konsantrasyon % 4 (w/v), paraformaldehyde (PFA) toz geçiyoruz. İngiltere'de yılın çözüm 4 ° C'de depolayın
2. deneysel prosedürler
-
L4 ve L5 DRGs cerrahi maruz
- Anestezik çözüm #1 daha önce (ketamin 100 mg/kg vücut ağırlığı ve xylazine 12 mg/kg vücut ağırlığı ile) hazırlanan bir mayi enjeksiyon kullanarak fare anestezi.
- Kürk kesme makinesi ile cerrahi alan tıraş.
Not: sol siyatik sinir ezmek için başka bir ameliyat olacağından, sol arka uyluk kürk aynı anda traş. - Isıtmalı battaniye (35,0 ° C) fareyi getirin ve rektal ısı sıcaklık probu ile izleyebilirsiniz.
- Anestezi sınamak için ayak ve kuyruk fare pinch ve davranışsal yanıt gözlemlemek.
- Corkboard fare dört ekstremitelerin teyp.
- Cerrahi alan iodophor çözüm ve sonra cilt kesmeden önce iodophor kaldırmak için %75 alkol ile silin.
- Oftalmik merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
- Kesi önce iliyak armalar her iki iyi marker kalemle işaretlemek. L5 DRGs konumlarını tanımlayan kolaylaştırmak için iliak armalar iki nokta bağlanma bir çizgi çizin.
- Mikro-makas ile düşük geri orta çizgi boyunca bir 3 cm kesi yapmak. Ayrıca, paraspinous kaslar, musculus multifidus ve musculus longissimus vur S1 spinöz işlemlere, L3 üzerinden gibi ayırmak ve L4-5 ve L5-6 faset eklemleri bulaşmasına neden.
- Bir mikro-rongeur L4-5 ve L5-6 faset eklemleri kaldırmak için kullanın. Ayrıca, sol nöral arch L4 ve L5 DRGs sırt tarafında ortaya çıkarmak için kaldırın.
-
DRG enjeksiyon
- Anestezik çözüm #2 (200 mg/kg vücut ağırlığı ile avertin) enjekte intraperitoneally anestezi DRG enjeksiyon önce korumak için.
- Plazmid DNA veya RNA oligos (DRG başına 1 µL) cam kapiller pipet yükleyin.
- Kapiller Cam Pipet Ucu dikkatle DRG yerleştirin.
- Yavaş yavaş DNA plazmid 1.0 µL çözümü enjekte veya RNA oligos hücre içi mikroenjeksiyon kullanarak DRG içine sistemleri (30 psi, 8 ms) dağıtmak.
Not: Enjeksiyon süresi 5 dakikadan daha az sürmelidir.
-
Elektroporasyon
- PBS elektrotlar ipuçları üzerinde bırakın.
- Kare pamuk steril gazlı bez ile kanama kadar temiz.
- Hedef DRG elektrotlar ile hafifçe çimdik ve Elektroporasyon sistemi ile 5 kare elektrik darbeleri uygulayın.
- Sırasıyla 5-0 naylon sütür ile kas ve deri katmanları kapatın.
- Tamamen sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine geldi kadar Isıtmalı battaniye (35,0 ° C) fare altında yakın ilgi koyun. Tam anesteziden kurtarıldı sonra fare ev kafese geri dönün.
Not: Bu yaklaşık 60 dk 37 ° C battaniye anestezi tamamen kurtarmak fare için alır. Bir hap (200 mg) ibuprofen (0.2 mg/ml) 1000 ml suya ameliyat sonrası ağrı gidermek için günlük beslenmesi için geçiyoruz.
-
Siyatik Sinir Crush
- (Bağlı olarak deneysel tasarım) iki ya da üç gün sonra DRG Elektroporasyon fare (400 mg/kg vücut ağırlığı avertin ile) intraperitoneally anestezik çözüm #2 ile anestezi.
- Corkboard fare dört ekstremitelerin teyp.
- 1 cm kesi 0.5 cm orta çizgi sol tarafında yapmak. Kaslar gluteus maksimus kas ve piriformis kas, gibi boyuna kesilmiş. Büyük siyatik deliği ve..... .siyatik çentiği arasında siyatik sinir parçası ortaya çıkarmak.
- Ezmek için 12 s ve mark 10-0 naylon epineural dikiş ezmek sitesiyle mikrocerrahi forseps ile sinir. Bir düğüm ezmek yer işaretlemek dural membran üzerinde yapın.
- 5-0 naylon sütür ile kas ve deri katmanları kapatın.
- Tamamen sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine geldi kadar Isıtmalı battaniye (35,0 ° C) fare ile yakın ilgi koyun. Tam anesteziden kurtarıldı sonra fare ev kafese geri dönün.
Not: Bu yaklaşık 60 dk 37 ° C battaniye anestezi tamamen kurtarmak fare için alır. Bir hap (200 mg) ibuprofen (0.2 mg/ml) 1000 ml suya ameliyat sonrası ağrı gidermek için günlük beslenmesi için geçiyoruz.
-
Fare perfüzyon, DRG ve siyatik sinir hasat
- İki ya da üç gün sonra siyatik sinir (bağlı olarak deneysel tasarım) ezmek, fare intraperitoneally ile anestezik çözüm #2 anestezi.
- PBS buz gibi %4 paraformaldehyde (PFA) (pH 7.5) ardından fare transcardially PBS (pH 7,4) ile sıvı.
- Perfüzyon sonra bile sinir kökleri ve siyatik sinir önce diz DRGs mikro-makas ve mikro-forseps diseksiyon mikroskop altında dikkatlice ayırın. Siyatik sinir doğrudan İngiltere'de yılın gecede 4 ° C'de % 4 yer
-
Görüntüleme ve floresan etiketli duyusal aksonlar ölçme
- Ekli doku ve membran üzerinde sabit siyatik sinir mikro-makas ve mikro-forseps dikkatle diseksiyon mikroskop altında kapalı şerit. Sonra %4 alışverişi PFA PBS ve yıkama ile sinir üç kez.
- Siyatik sinir bir slaytta yer ve düz tut. Sinir etrafında antifade çözüm 80 µL ekleyin, sonra bir coverslip üzerinde yatıyordu. Basınç ile tamamen bağlı doku düzleştirin.
- flattened doku mozaik Alım ve görüntü işleme için suç ortağı ile donatılmış ters epifluorescent mikroskop yerleştirin.
Not: Uyarma ve emisyon uzunlukları 488 vardır nm ve 509 nm. Birden çok çakışan görüntü el ile alabilir ve ImageJ mozaik eklentisi ile birlikte kullanarak görüntüleri dikiş mümkündür. - Ne zaman rejenere aksonlar uzunluğu ölçme, Bütün identifiable fluorescently etiketli akson (10-0 epineural dikiş ile işaretlenmiş) ezmek sitesinden siyatik sinir distal akson uçları izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitotoksisite geçerli protokol ve in vivo DRG Elektroporasyon transfection oranı yüksek, biz enjekte doğrulamak için ve electroporated mikroRNA fluorescently öğesini veya siRNA L4 ve L5 DRGs ölçmek için. Müstakil DRGs soguk kesit ve immünhistokimya (Şekil 1A-B) yoluyla işlendi. Enjeksiyon ve Elektroporasyon sonra hücre sağkalım oranı tahmin ederken, bozulmamış DRGs L4 ve L5 hasat ve cryo-kesit ve immünhistokimya yoluyla işlenen. Tuj1 boyama ile yansıyan nöron yoğunlukları Elektroporasyon nöronal hücre ölümü (Şekil 1C) teşvik değil gösteren olduğu gibi DRGs, nöron yoğunlukları karşılaştırıldığında önemli bir fark yoktu. Transfection oranı olarak etiketlenmiş RNA oligo nöronların sayısı ve Tuj1 pozitif nöronların sayısı arasındaki oran hesaplanır. Demek transfection miRNA 80.7 ± % 4.3 ve siRNA 94.2 ± %0,3 (Şekil 1D) oranıdır. Axon yenilenme eğitim için geçerli vivo içinde Elektroporasyon yöntemi uygularken, siyatik sinir basık ve görüntüsü. Kendine özgü yörünge ve tanınabilir distal axon uçlu rejenere her axon dikiş düğüm (Şekil 2) tarafından belirtilen ezmek sitesinden takip edilebilir. Buna ek olarak, biz electroporated EGFP Plasmid'ler ile DRGs ve omurilik T7 üzerinden L2 için L4 ve L5 dorsal kökleri ile birlikte 7 gün sonra hasat. İletişim kuralı takas köklü bir doku kullanılan — omurilik11temizlemek için uDISCO. Spinal kord EGFP etiketli dorsal sütun aksonlar confocal mikroskop görüntüsü ve hem boyuna ve sagittal mermi imge (Şekil 3) tespit edildi. Alternatif olarak, confocal görüntüleri 3D görüntü (Film 1) birleştirmeye mikroskobu görselleştirme yazılımı ile işlenebilir.
Resim 1 : İmmünhistokimya, DRG cryo-bölümün fluorescently öğesini non-spesifik mikroRNA veya siRNA vivo içindeElektroporasyon sonra. (A)temsilcisi cryo-DRG dokusu enjekte ve bölümü (Dy547) hedef sigara mikroRNA'lar fluorescently tagged ile electroporated. Sol görüntü: görüntü (Dy547) hedef sigara mikroRNA'lar fluorescently öğesini floresan sinyal (kırmızı renk). Orta görüntü: IMMUNO-boyama (yeşil renkli), Tuj1 bir Alexa488 fluorophore üzerinde ikincil antikor ile. Doğru görüntü: önceki iki kanal birleştirilen görüntüyü. Ölçek çubuğu 100 µm.()B=) enjekte DRG doku ve electroporated (Cy3) hedef olmayan çift fluorescently tagged ile temsilcisi cryo-bölüm. Sol görüntü: görüntü fluorescently öğesini (Cy3) hedef olmayan çift floresan sinyal (kırmızı renk). Orta görüntü: IMMUNO-boyama (yeşil renkli), Tuj1 bir Alexa488 fluorophore üzerinde ikincil antikor ile. Doğru görüntü: önceki iki kanal birleştirilen görüntüyü. 809.6 ± 14,2 hücreler/mm2 ölçektir bar temsil 100 µm. (C) bir bozulmamış DRG cryo-bölüm nöron yoğunluğu (N = 6) ve bir enjekte DRG cryo-801.6 ± 27,4 hücreler/mm2 bölümdür (N = 6), yani ± SEM, öğrenci t-testi, NS: yok önemi. Üç fare sol L4 ve L5 DRGs gerçekleştirilen vivo içinde DRG Elektroporasyon ile etiketlenmiş siRNA vardı. Hem sağ ve sol L4 ve L5 DRGs 48 saat sonra hasat ve cryo-bölüm ve immünhistokimya işlenir. Her DRG yaklaşık 60 dilimler halinde kesitli ve dilim kalınlığı 10 mikron olduğunu. Her DRG üç dilim 200 mikron tarafından seçilir ve ortalama olarak. (D) etiketli miRNA transfection oranı olduğunu 80.7 ± % 4.3 (N = 4) ve etiketli siRNA 94.2 ± %0,3 (N = 6), yani ± SEM Üç fareler etiketli siRNA ve etiketli miRNA ile iki fare ile sol L4 ve L5 DRGs gerçekleştirilen vivo içinde DRG Elektroporasyon vardı. DRGs 48 saat sonra hasat ve cryo-bölüm ve immünhistokimya işlenir. Her DRG yaklaşık 60 dilimler halinde kesitli ve dilim kalınlığı 10 mikron olduğunu. Her DRG üç dilim 200 mikron tarafından seçilir ve ortalama olarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Ectopically ifade EGFP görüntüler yeniden nöronal aksonlar siyatik sinir yaralanma kırma sonra. Crush yaralanma acı bir düzleştirilmiş siyatik sinir aksonlar aksonlar için somas taşınan EGFP (yeşil floresan) ile etiketlenir. Kırmızı çizgi aslında Cerrahi dikiş bir düğüm tarafından işaretlenmiş kırma yaralanma site konumunu belirtir. Beyaz ok ucu, ok ve yıldız tüm bunların ezmek sitesinden genişletmek üç farklı axon ucu gösterir. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : EGFP ifade aksonlar DRGs in vivo Elektroporasyon sonra spinal kord projeksiyon görüntüleri. (A)boyuna projeksiyon EGFP etiketli aksonlar dorsal sütun ve L4/L5 dorsal kök içinde. İç metin görüntüler A1 ve A2 Masası'nda (A) işaretli iki dikdörtgen alanı büyütülmüş görünümlerini göstermek. A1 aksonlar dorsal sütunundaki ayrıntılı bir görünümünü gösterir. A2 aksonlar dorsal kök giriş bölgesi (DREZ) ayrıntılı bir görünüm sergiler. Ölçek çubuğu 200 µm. (B) Sagittal projeksiyon dorsal sütun içinde EGFP etiketli aksonlar =. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: EGFP ifade aksonlar spinal kord 3D imar DRGs in vivo Elektroporasyon sonra. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli cerrahi adımları özellikle dikkat gerektirir. L4 ve L5 DRGs (somas konumunu), siyatik sinir hakim, doğru tespit ve gen yapıları ile enjekte gerekir. Aksi durumda, GFP etiketleme yok olur siyatik sinir aksonlar içinde. İliyak armalar L4 ve L5 DRGs kesin olarak belirlemek için yararlı anatomik simge görüntülenir. Farelerin çoğunda, L5 ve L6 omurları arasında eklem yüzünü iliyak armalar12' ye yakın eder. Cerrahi teshir edilmesi L5 DRG genellikle bir derin konum ve zengin kan akımı nedeniyle büyük zorluklar karşılar gibi alternatif olarak, L3 DRG L5 yerine, özellikle immünhistokimya veya western blot13, gibi deneyleri için seçilebilir. Ayrıca, tüm cerrahi zararlı DRG yapıları, omurilik ve sinir kökü gibi çevreleyen kaçınmanız gerekir. Kayda değer ikinci önemli operasyonel enjeksiyon adımıdır. Hızlı yeşil boya gen yapıların iğneden atılır çözüm görselleştirmek ve DRG yaygın çözüm ile karışık oldu. Başarılı bir enjeksiyon floresan boya tarafından özetlenen bir açık yuvarlak şekil DRG göstermelidir. Floresan boya çözümle DRG enjekte ederken sızıntıları, bir geri ve ileri mikro-iğne ucu derinliği üzerinde ince ayar tüm çözüm tam enjeksiyon DRG kapsül içine sağlayabilirsiniz. Üçten fazla farklı sitelerdeki DRG impaling kaçının. DRGs sıkıca rete venosum13ile kapsüllenmiş olarak daha fazla, hafif kanama DRG enjeksiyon sonra genellikle kaçınılmazdır. Elektrotlar DRG yüzeyinden Elektroporasyon sırasında yalıtım kan olacak böylece kanamayı durdurmak önemlidir. Başarılı Elektroporasyon elektrik geçerli iletim üzerinde bağlıdır ve PBS çözüm elektrot üzerinde uygulanabilir. Son olarak, site yaralanma sitesi mikroskop altında görünmez bu yüzden ve daha sonra axon rejenerasyon görüntü analizi için başlangıç noktası olarak gösterilir gerekiyor çünkü siyatik sinir üzerindeki ile ezilmiş nerede forseps mikro dikiş ile işaretlenmiş olmalıdır. Epineural dikiş düğüm ezmek sitesinde hayvan perfüzyon ve diseksiyonu sonrası düşerse, ezmek kaynaklı girinti hala tanımlanabilir olduğunda PFA-sabit sinir olarak anında dikiş ile aynı sitede yeniden etiketlemek için önemlidir.
Transfection teknikleri arasında Elektroporasyon daha yüksek transfection oranı vardır. Bizim araştırmaya göre transfection DRG nöron mikroRNA'lar veya çift vivo içinde Elektroporasyon sonra % 90 yakın oranıdır. Daha da önemlisi, in vivo Elektroporasyon istenilen gen yapıları, virüs ambalaj gerektiren virüs tabanlı yöntemler çok daha az zaman alır. Biliyoruz, lipofectamine tabanlı vivo içinde transfection daha az toksisite Elektroporasyon daha olsa bile kadarıyla lipofectamine DRG nöronlar üzerinde çalışmıyor özellikle, ne içinde vivo ne de vitro. Önemli, geçerli metodoloji birkaç teknik sınırlamalar vardır. İlk olarak, faiz gen knocking için siRNA etkinlik süresi plazmid virüs alan teslim kısadır. Bu nedenle, Elektroporasyon üzerinden tüm prosedürü hayvan kurban için 4-6 gün14' te bitmiş olması gerekir. Ayrıca, mikroskop altında gerçekleştirilen cerrahi uygulama ve biraz el becerisi gerektirir. Bir acemi için ameliyat süresi genellikle beklenenden daha uzun olur. Fare idare anestezik doz istenmeyen ölüm önlemek için dikkatli bir şekilde kontrol edilebilir olmalı. Son olarak, siyatik sinir düzleştirme aksonlar epifluorescent görüntüleme iletken zaman örtüşen neden olur. Confocal mikroskopla düzleştirilmemiş sinirler Imaging alternatif bir seçenektir.
Anatomik olarak, DRG duyusal sinir hücreleri iki aksonal kola - periferik azalan şube ve spinal kord10dorsal sütuna projelendirme artan Merkez şube var. Geçerli metodolojisi de kendine özgü omurilik dorsal sütunun etiketleme gösterir. Böylece, benzer bir metodoloji duyusal axon yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra Medulla Spinalis Yaralanmalarında araştırmak için bir model olarak kullanılabilir. Doku Temizleme teknikleri11ile birlikte, geleneksel confocal mikroskopi veya ışık sayfalık mikroskobu temizlenen omurilik örnek üzerinde duyusal aksonlar omurilik dorsal sütun içinde 3 boyutlu görüntüleri yeniden inşa etmek için istihdam edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma finanse edildi (F-Q için verilmiştir. Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Craig H. Neilsen Vakfı ve BrightFocus Vakfı tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
References
- Saijilafu,, et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
