成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション
Summary
エレクトロポレーションは、興味の遺伝子を細胞に提供する効果的なアプローチです。このアプローチは生体内で成体マウス後根神経節 (DRG) のニューロンに適用すると、軸索再生の生体を研究するためのモデルについて述べる。
Abstract
エレクトロポレーションは、DNA プラスミッドまたは小さな RNA 分子を細胞に導入する本質的な非ウイルス性遺伝子導入アプローチです。後根神経節 (Drg) の感覚ニューロンは、2 つの分岐の 1 つの軸索を拡張します。1 つの分岐は、周辺機器に行く神経 (末梢枝) と他の支店 (中央支部) 後根を介して脊髄に入る。神経損傷後末梢枝は中央支店、再生成しないに対し力強く再生されます。ため高い再生能力感覚軸索の再生は広く使用されてモデル システムとして末梢神経系 (PNS)、中枢神経系 (CNS) の両方で哺乳類の軸索の再生を研究します。ここでは、成熟したニューロンの生体内でエレクトロポレーションによる遺伝子発現を操作する以前に確立されたアプローチ プロトコルについて述べる。アプローチ芳司プラスミッドまたは小さな RNA oligos (Sirna またはマイクロ Rna) に基づき、遺伝子の利益または軸索再生の生体内の調節におけるマイクロ Rna の役割を検討する両方の損失と利得-の機能実験のためことができます。さらに、空間的そして一時的は比較的短時間で遺伝子発現の体内操作の制御ができます。このモデル系は、哺乳類の軸索の再生が規制生体内では分子メカニズム解明のためのユニークなツールを提供します。
Introduction
神経外傷による神経系の傷害または様々 な神経変性疾患は、通常、モーター、感覚と認知機能の欠陥になります。最近では、多くの努力は、負傷した生理機能ニューロン1,2,3を復元する大人ニューロンの再生力再建に専念してきました。DRG ニューロンは痛み、温度、タッチ、または脳への姿勢など、さまざまな感覚刺激を伝達する神経細胞のクラスターです。各これらのニューロンは擬似単極、周囲に向かって拡張 1 つの支店と4脊髄に向かって他の支店を分割単一の軸索が含まれています。Drg の大人の感覚ニューロンはいくつか成熟した哺乳類神経損傷後の軸索を積極的に再生する知られています。したがって、感覚軸索の損傷広範囲として採用されている重要なモデル軸索再生の生体内のメカニズムを研究します。
生体内で遺伝子トランスフェクション技術は、通常以下をセットアップする時間がかかり、トランスジェニック動物を使用するよりもより柔軟な遺伝子の機能を勉強し、中枢神経系における情報伝達システムに必須の役割を果たしています。主な技術は、2 つの方法に分類できます: 計測器およびウイルス ベース5。大人ニューロンの遺伝子デリバリー ウイルス ベースは生体内で遺伝子発現6の正確な時空間操作を提供できます。しかし、労働集約的なプロセスは生産目的の遺伝子を含んでいるウイルス粒子の精製など、ウイルス ベースの方法で関与しています。さらに、多くのウイルスのベクトルは、データ集録、データの解析を妨げる可能性があり、可能性の実験結果の解釈を誤解するホストの免疫システムをアクティブにでした。エレクトロポレーション、典型的な楽器ベースのトランスフェクション アプローチ遺伝子ベクターまたは7 細胞外スペースから小さな RNA oligos の流入を支持の一過性細胞および原子膜の透過性を高める電気パルスを使用して、.体外エレクトロポレーションは、さまざまなタイプのターゲット遺伝子発現を操作するための一時的な非常に効率的な戦略として認識されています。体内エレクトロポレーションは、効率が低い株ウイルスのベクトルと比較しての一時的な遺伝子発現に他ならない、ウイルスのアプローチに比べて様々 な利点があります。たとえば、ほとんどすべて組織・細胞7,8,9に適用できます。さらに、特定の成績に対してどちらかのプラスミド (例えばSirna、マイクロ Rna) の興味の遺伝子または小さな RNA oligos 標的組織に直接注入でき、電気的パルス、手順にして以下の労働 – と時間のかかります。また、複数のプラスミドと単一エレクトロポレーションと同時に RNA oligos の株は、可能です。
我々 が成体マウス感覚神経細胞における遺伝子発現を操作する生体内でエレクトロポレーション アプローチを確立が正常に適用され、1,パイオニア研究多数2,3 でこのようなアプローチを検証 ,8,10。ここでは、哺乳類の軸索の再生の将来の研究のためのこのアプローチの使用を容易にするために詳細なプロトコルを提案する.
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかの手術の手順には、特に注意が必要です。L4 と L5 drg コード (細胞体の位置) は、坐骨神経を支配を正しく識別され、遺伝子構造に注入する必要があります。そうでなければ、GFP 標識が休演いたします坐骨神経軸索で。腸骨稜は、L4 と L5 Drg を特定する有用な解剖学的ランドマークとして見なすことができます。L5 と L6 の椎間関節面は、ほとんどマウス腸骨稜12に近?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
(F q 受賞資金が供給された研究Z.) NIH (R01NS064288、R01NS085176、R01GM111514、R01EY027347)、クレイグ H. Neilsen 財団、BrightFocus 財団によって。
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
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