Summary
Methoden zur Messung der sympathischer und Herz-Kreislauf-Antworten auf zentrale Nervensystem (ZNS) Manipulationen sind wichtig für die Förderung der Neurowissenschaften. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Wissenschaftler mit Messung und Quantifizierung der akute Veränderungen im renalen sympathischen Nerven-Aktivität (RSNA) bei anästhesierten Ratten (Überleben) zu unterstützen.
Abstract
Renalen sympathischen Nerven-Aktivität (RSNA) und arterielle Mitteldruck sind wichtige Parameter in der Herz-Kreislauf- und autonome Forschung; Allerdings gibt es begrenzte Ressourcen leiten Wissenschaftler in den Techniken für die Messung und Analyse dieser Variablen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Messung der RSNA und arterielle Mitteldruck bei anästhesierten Ratten. Das Protokoll enthält auch die Ansätze für den Zugriff auf das Gehirn während der RSNA Aufnahmen für Manipulationen des zentralen Nervensystems (ZNS). Die RSNA Aufnahmetechnik ist kompatibel mit pharmakologische, optogenetische oder elektrische Stimulation des ZNS. Der Ansatz ist nützlich, wenn ein Ermittler kurzfristige (min bis h) autonome Reaktionen in nicht überleben Experimente anatomisch korrelieren mit CNS Kerne gemessen wird. Der Ansatz soll nicht verwendet werden, um chronische (Überleben) Aufnahmen der RSNA in Ratten zu erhalten. Entladungen in RSNA, gemittelt korrigiert RSNA und arterielle Mitteldruck kann quantifiziert und weiter über parametrische statistische Tests analysiert. Verfahren für den Erhalt der venösen Zugang, arterielle Mitteldruck telemetrisch aufnehmen und Gehirn Fixierung für künftige histologische Analysen sind auch in dem Artikel beschrieben.
Introduction
Prä-klinischen Entdeckungen über autonome Kontrolle des Herz-Kreislauf-Systems informieren Sie Strategien für die Verwaltung von Erkrankungen wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz und Niereninsuffizienz. Überaktivität des sympathischen Nervensystems und reduzierte kardiale vagotonus tragen zu erhöhter Blutdruck (BP)1. Chronisch erhöhten renalen sympathischen Abfluss Katecholamin-Sekretion erhöht und verringert renale Durchblutung mit schädlichen Folgen für das Herz-Kreislauf-/ renal Systeme2,3. Um die neurobiologischen Wege zu einer autonomen Dysfunktion zu definieren, sind Studien an Nagern wichtig für die Bestimmung, wie Neuronen des zentralen Nervensystems (ZNS) sympathischen Parameter regulieren. Der Zweck dieses Protokolls ist es, technische Auskunft über Messung der renalen sympathischen Nerven Aktivität (RSNA) und BP und die Techniken zur Quantifizierung der akuten sympathischer Änderungen als Reaktion auf CNS Manipulationen bei anästhesierten Ratten zu skizzieren.
Akute (Überleben) RSNA Messungen (dauerhafte min bis h) sind nützlich, wenn Wissenschaftler die CNS, pharmakologisch, elektrisch Sonde werden, oder Optogenetically in Ratten betäubt, die die Funktionen von bestimmten Kernen zu bestimmen. Mit diesen Methoden, Strukturen wie der einsame Kern, Periaquäduktales grau, wurden Pedunculopontine Tegmentum und rostral ventrolateralen Medulla untersucht um neurobiologische Wege Regulierung der sympathischen Parameter4zu definieren, 5,6,7. Dieser Ansatz ist wichtig für die Identifizierung von CNS Zielen zu untersuchenden in chronischen Modelle der autonomen Dysfunktion8,9weiter. Um diese Experimente zu vervollständigen, benötigt das Labor einen Lötkolben, Operationsmikroskop, stereotaktischen Rahmen, Mikroelektrode Verstärker und Audio-Monitor. Abhängig von den Faktoren im Labor vorhanden, die elektrische Störungen beitragen, erfordern chirurgische/Aufnahmebereich ein Faraday-Käfig/Erdung Riemen, elektrische Störungen in der RSNA Aufnahme zu reduzieren. Wenn Gehirn Analysen Gewebe Fixierung benötigen, eine Perfusion Pumpe und Dunst Haube sind erforderlich. Daten können digitalisiert und mit mehreren physiologischen Softwaredaten Erwerb (analog-Digital-Wandler) Einheiten4,5, mit verschiedenen Auswertungsmöglichkeiten und Kompatibilitäten für die Einbeziehung der telemetrischen Signale aufgezeichnet .
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Protocol
Alle beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care Committee an der University of Illinois at Chicago genehmigt.
1. Erstellen Sie Bipolar RSNA Elektroden
- Um die Elektrode zu erstellen, schneiden Sie zwei Stücke aus Edelstahldraht ca. 18 mm lang. Schneiden Sie ein Stück aus Polyethylen (PE-50) Schläuche ca. 15 mm lang. Füttern Sie beide Teile des Drahtes in den Schlauch, so dass das Kabel an beiden Enden.
- Entfernen Sie die Isolierung von den Enden der Drähte; Schneiden Sie die Drähte verlassen ca. 2-3 mm exponierten Draht. An einem Ende der crimp männlichen Stifte über die freiliegende Leitung. Löten Sie die Stifte fest an den Draht, sichern Sie die Stifte im Inneren ein Connector-Streifen und decken Sie die Verbindung mit Epoxy.
Hinweis: Ein alternativer Ansatz, der vermeidet Löten soll verbinden/Schnellspanner Krokodilklemmen zu verwenden. - Am entgegengesetzten Ende der Elektrode entfernen Sie die Isolierung von den Enden der Drähte, 2-3 mm exponierten Draht zu verlassen. Beugen Sie diesen Teil des Drahtes an kleinen "V" geformt Haken in den abisolierten Draht zu erstellen.
Hinweis: Dies ist der Teil der Elektrode, die in Kontakt mit der renalen sympathischen Nerven werden. Es ist wichtig, um dieses Ende zu verhindern, dass Flüssigkeiten in das Rohr zu versiegeln. Silikon oder Epoxy kann effektiv verwendet werden.
(2) verwalten Sie Anästhesie und bereiten chirurgische Seiten vor
- Verabreichen Sie an einem männlichen Sprague-Dawley Ratten (Alter 9-11 Wochen, mit einem Gewicht von 150-400 g) Narkose. Verwalten von Pentobarbital-Natrium 50 mg/kg über eine intraperitoneale Injektion (IP). Um eine stabile Ebene der Narkose während der Operation beurteilen, überprüfen Sie Zehe-Prise Reflex alle 15 min und wieder Dosis Anästhesie Bedarf.
Hinweis: Natrium Pentobarbital (Nembutal) wurde in früheren Studien zur eine nachhaltigere Ebene der Narkose zu erreichen ohne die Modulation der RSNA4,5,6. Dieses Protokoll ist für die Operation nicht überleben, so gibt es keine Erholung/postoperative Überwachung Periode. - Vorbereiten der Operationsstelle nach institutionellen Tierbetreuung Richtlinien (i.e., Rasieren, Bauch, Rücken und Kopf der Ratte; reinigen Sie die Haut mit 10 % Povidon-Jod-Lösung; gelten Auge Schmiermittel; und legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen). Pflegen Sie die Körpertemperatur auf 37 ° C, während der Experimente.
3. cannulate der Femoral Ader (für den intravenösen Zugang)
- Sterile Kochsalzlösung 0,9 % (um 20 Einheiten/mL zu erreichen) fügen Sie Heparin hinzu. Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit dem heparinisierten Kochsalzlösung durch eine 22G Nadel. Verbinden Sie 15 cm aus PE-50 Schlauch mit Nadel und füllen Schläuche mit der Lösung.
- Erstellen Sie mit der Ratte Rückenlage liegend einen 2 cm horizontaler Schnitt durch die leisten-Gegend. Mit Baumwoll-bestückte Applikatoren, sezieren Sie das Bindegewebe um die femorale Vene und Arterie freizulegen. Um den Schnitt offen zu halten, gelten entweder Einzel-Haken elastisch chirurgische Aufenthalte an das OP-Feld mit Seide befestigt mit Klebeband oder verwenden Sie kleine futterzange.
- Verwenden Sie hämostatika, um die Spitze einer 22 G Nadel in einem 90 ° Winkel als einen Katheter Einführhilfe10dienen zu biegen.
- Visualisieren Sie die Gefäße unter die Lupe genommen. Trennen Sie vorsichtig die Vene und Arterie mit gebogenen Pinzette. Platz zwei 12 cm lange 5-0 Seide Naht unterhalb der Vene (eine distale und proximale); Legen Sie die Naht in der gleichen Weise unter der Arterie.
- Binden Sie die distalen (unteren) Naht um die Vene zu verdecken; die Ränder dieses Nahtmaterials um das OP-Feld mit Seide Band oder kleine futterzange zu sichern. Ziehen Sie die Vene straff, aber nicht mit so viel Kraft, dass das Schiff reißen wird. Positionieren Sie die Richtung senkrecht zur dominanten Hand des Operateurs.
- Verwenden Sie einen losen overhand halben Knoten in die proximale Naht, um kurz die Vene verdecken. Klemmen Sie mit zarten blutstillende Zangen sanft diese Naht um die Durchblutung zu verdecken. Halten Sie die 22G Nadel mit der gebogenen Spitze, in der nicht-dominanten Hand; umklammern Sie den Schlauch mit der Pinzette mit der dominanten Hand.
- Durchstechen Sie ein kleines Loch in die Vene mit Katheter Einführhilfe (Schritt 3.3) und legen Sie die PE-50-Schläuche (vorausgefüllt mit heparinisierten Kochsalzlösung) in das Gefäß; Verwenden Sie die verbogene Nadel, um die Öffnung in das Gefäß offen zu halten und um bei der Positionierung der Spitze des Katheters in die Behälter10.
- Lassen Sie die proximale Naht und spülen Sie sanft 0,2 mL heparinisierten Kochsalzlösung in die Vene; Wechseln Sie den Katheter. Überprüfen Sie die Rückkehr von Blut aus der Vene, die richtige Platzierung zu gewährleisten. Füllen Sie den proximalen Knoten und mit distalen Naht Krawatte, sichern Sie den Schlauch in die Vene.
- Verwenden Sie venösen Zugang in die Experimente, für die Verwaltung der ergänzenden Anästhesie oder Medikamente und zur Blutentnahme. Integrieren Sie einen 3-Wege-Connector, wenn regelmäßige intravenöse Infusionen und Blutentnahmen notwendig sein werden. Überprüfen Sie, dass schädliche Zehe-Prise Reflex alle 15 min um Anästhesie zu titrieren.
4. cannulate der Femoral Arterie zur Überwachung der arterielle Mitteldruck
- Visualisieren Sie die Arterie unter die Lupe genommen. Ähnlich wie bei der Methode verwendet für venöse Kanülierung, binden die distalen Naht (Schritt 3.4) zu verdecken die Arterie; Sichern Sie die Ränder dieses Nahtmaterials um das OP-Feld mit Seide Klebeband zu und positionieren Sie die Arterie senkrecht zur dominanten Hand des Operateurs.
- Arterieller Zugang, wenn ein Druck-Wandler/Infusion System verwenden
- Eine 500 mL 0,9 % Kochsalzlösung Tasche Wandler/Druckschläuche anschließen. Spülen Sie den Schlauch mit Kochsalzlösung, entfernen alle Luftblasen, und legen Sie den Beutel in einem Druck-Induktor Tasche, das System unter Druck zu setzen.
- Wie in Schritt 3.1 beschrieben, füllen Sie eine 1 mL Spritze mit dem heparinisierten Kochsalzlösung durch eine 22G Nadel und die Nadel (bündig tubing mit heparinisierten Kochsalzlösung) 15 cm aus PE-50 an.
- Verwenden Sie einen lockeren halben Knoten in die proximale Naht, um kurz die Arterie zu verdecken. Halten Sie den Katheter Einführhilfe (Schritt 3.3) in der nicht-dominanten Hand; halten Sie die distalen Spitze des PE-50 mit Schiff Kanülierung Zangen in die dominante Hand. Punktieren Sie ein Loch in die Arterie mit der gebogenen 22G Nadel und stecken Sie die Kanüle in das Schiff.
- Lassen Sie die proximale Naht vorsichtig bündig 0,2 mL heparinisierten Kochsalzlösung in die Arterie und Fortschritt der Katheter so weit wie möglich. Suchen Sie nach arteriellem Blut zurück zur richtigen Platzierung zu gewährleisten. Füllen Sie den proximalen Knoten und mit distalen Naht Krawatte, sichern Sie den Schlauch in der Arterie. Die arterielle Linie an den Druck-Wandler/Schläuche anschließen.
Hinweis: Der distale Abschnitt der Schläuche kann die Ratte Megalosauridae Sicherstellung die arterielle Linie mit Klebeband befestigt werden. Ein alternativer Ansatz zur Kanülierung des Schiffes wird durch Jespersen Et al.beschrieben.; 11 ihr Protokoll unterscheidet sich mithilfe von Retraktoren, um den Schnitt, Leim-eher zu verbreiten, als Naht zu sichern, die Schläuche und der Ansatz beinhaltet nicht die verbogene Nadel Einführhilfe.
- Arterieller Zugang wenn Telemetrie mit
- Überprüfen Sie den Druck-Sensor Katheter unter hoher Vergrößerung vor arterielle Kanülierung. Sicherzustellen, dass der Katheter frei von Luftblasen/Schmutz ist und verfügt über eine intakte Meniskus zwischen der Flüssigkeit gefüllten (proximalen) und Gel-gefüllte (distal) Komponenten. Füllen Sie vor jeder Implantation das Gel an der distalen Spitze des Katheters. Schalten Sie den Sender mit einem Magneten; Überwachen Sie BP während der Operation, perfekte Platzierung zu ertragen.
- Verwenden Sie einen losen overhand halben Knoten in die proximale Naht, um kurz die Femoral Arterie verdecken. Halten Sie den Katheter Einführhilfe (Schritt 3.3) in der nicht-dominanten Hand. Halten Sie die Spitze der Kanüle die Telemetrie-Einheit mit einer Pinzette Schiff Kanülierung vermeiden Gel von der Spitze verdrängen.
- Punktieren Sie ein Loch in die Arterie mit der gebogenen 22G Nadel und stecken Sie die Kanüle in die Arterie mit Schiff Kanülierung Pinzette um zu vermeiden, Gel von der Spitze verdrängen. Die Kanüle so weit wie möglich voranzutreiben. Mit der proximalen und distalen Naht, sichern Sie den Druck-Katheter.
- Verstauen Sie den Körper des Implantats Telemetrie in der Flanke angrenzend an den Schnitt, und schließen Sie diesen Einschnitt mit 4: 0-Nylon-Naht auf einer Nadel schneiden. Die Telemetrie-Geräte ausgeschaltet durch Magneten am Ende die Aufzeichnungsdauer um Batterie zu sparen.
5. Positionieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Operation Rahmen auf das Gehirn
- Sanft bewegen die Ratte in Bauchlage in der stereotaktischen Chirurgie-Rahmen.
- Positionieren Sie die Ratte zwischen den Ohr-Balken, und passen Sie den Schneidezahn-Balken, um die Höhe des Lambda und Bregma auszugleichen. Positionierung kann die Ratte Sorte, Gewicht und Standorte der CNS Ziele abhängen.
- Machen Sie einen 2 cm Rostrocaudal Skalpell Schnitt durch die Mittellinie der Kopfhaut. Mit Baumwoll-bestückte Applikatoren fest entfernen Sie Bindegewebe von der Oberfläche des Schädels. Der Schädel, bei der Visualisierung der Bregma, Lambda und Mittellinie Nähte zuweisen Sie Wasserstoffperoxid.
- Mit einem Atlas des Gehirns Ratte, Führer targeting12, Bohren Sie eine Grat Loch Osteotomie, Größe für Elektrode Zugang, durch den Schädel.
6. Isolieren der renalen sympathischen Nerven
- Verbinden Sie die Draht RSNA Elektrode (Schritte 1.1-1.3) 10 X Vorverstärker zu Mikroelektrode Verstärker.
- Isolieren Sie die renale Nerven durch retroperitoneale Schnitt vor oder nach die Ratte in der stereotaktischen Rahmen gesichert ist. Positionieren Sie die RSNA Elektroden, sobald die Ratte in der stereotaktischen Rahmen ist. Machen Sie ein Skalpell Schnitt reicht von 4 bis 5 cm unterhalb der Rippen in Richtung kaudalen, leicht seitlich an der Wirbelsäule. Blunt sezieren den Schnitt der paraspinalen Muskeln zu visualisieren.
- Mit einer Schere einen sehr oberflächlichen 1-2 cm Rostrocaudal Schnitt machen trifft das Fett des Muskels. Mit Baumwoll-bestückte Applikatoren, verteilen Sie das Fett weg von der Muskel, die Niere zu visualisieren. Es ist wichtig, nicht zu den peritonealen Raum zu betreten.
- Verwenden Sie Retraktoren, um sanft die Niere von der paraspinalen Muskulatur visualisieren die Nierenarterie und Bauchaorta zu trennen. Dehnen Sie die Gefäße übermäßig zur Vermeidung von Schäden der Nieren Nerven nicht. Verwenden Sie ein 2 "x 2" Gaze Wattepad in Kochsalzlösung getränkt, um die Niere vor Verletzungen zu schützen.
- Identifizieren Sie unter hoher Vergrößerung die renale Nerven in der Schnitt-Tasche. Das Nervenbündel sind am leichtesten sichtbar im rechten Winkel von der Aorta und der Nierenarterien gebildet. Die renale Nerven verfolgen der Nierenarterien aus der Aorta zu den Nieren.
- Wählen Sie ein Segment der Nervenbündel, die auf die Aufnahme-Elektrode platziert werden. Die Nervenfasern aus dem umliegenden Gewebe/Behälter mit Mikro-sezieren einer Pinzette sanft zu sezieren.
- Sichern Sie die Draht RSNA Elektrode in einer Halterung (z.B.., eine Krokodilklemme an einem Stativ befestigt). Senken Sie die Elektrode auf die Ebene des Segments Nerven. Verwenden Sie einen Nerv-Haken, heben Sie vorsichtig das Segment des renalen Nerven auf die Elektrode ohne Dehnung des Nervs.
Hinweis: Der Nerv sollte in beiden "V-förmige" Haken in den abisolierten Draht, parallel zu den Nerv liegen. Die elektrodenleitungen dürfen nicht andere Gewebe, Blut oder Lymphflüssigkeit berühren. - Füllen Sie den Schnitt mit Mineralöl zu verhindern, dass die freiliegende renalen sympathische Nerven immer trocken. Verwenden Sie einen Erdung-Clip mit einem Ende auf der Haut des Schnittes und die andere an der Faraday-Käfig.
- Richten Sie das Signal an den Verstärker mit hoch - und Tiefpass-Filter (10 Hz und 3 kHz). Passen Sie den Gewinn bis zu 10 K. Include ein Audio-Monitor das Bersten Muster der RSNA beurteilen. Sampling-Raten zwischen 2.000-10.000 Hz4,5,6,7,8zu verwenden. Verwenden Sie eine höhere Sampling-Rate, wenn eine CNS Manipulation die Hypothese ist, um schnelle/kurze sympathische Reaktionen zu verursachen.
7. Daten
- Beurteilen Sie die Qualität der RSNA Aufnahme von evozieren die Baroreflex eine Bolus-Injektion von 1 mL Kochsalzlösung oder 10 µg/mL Phenylephrin (in 0,1 mL) intravenös. Wie in Abbildung 1dargestellt, sollte die Infusion BP zu erhöhen und RSNA hemmen. Zunahme der arterielle Mitteldruck von 60-80 MmHg ist ausreichend für die renale Sympathoinhibition4,13,14.
- Passen Sie die Position der Elektroden, das Signal bei Bedarf zu verbessern. Neupositionierung ist erforderlich, wenn der Nerv nicht in Kontakt mit beiden Haken an der Elektrode ist oder Gewebe, Blut oder Lymphe Flüssigkeit in Kontakt mit den Kabeln ist.
Hinweis: Die Notwendigkeit einer Neupositionierung basiert auf der auditiven Eigenschaften der Nerv Abflüsse.- Wenn die platzt der RSNA nicht zyklisch mit dem Herzzyklus auftreten und gibt es Störungen in der Aufnahme, dann positionieren Sie sorgfältig die Elektrode.
- Verbessern Sie Atembewegungen können auch Einfluss auf die Qualität der RSNA Aufnahme, das Signal durch sanft Verschieben der Elektrode in eine Position, wo die Muskelbewegungen nicht die Elektrode während der Atmung stören.
- Sobald ein klares Signal erhalten, sichern Sie die RSNA Elektrode im Ort durch Aberkennung der Mineralöl und Anwendung einer Silica-Gels zur Deckung die Nerv/Elektrode-Verbindung in der Schnitt-Tasche. Bewegen Sie die Ratte nicht, bevor das Gel vollständig abgebunden hat.
- CNS-Manipulation-Protokolle während der Aufnahme kontinuierlich RSNA durchführen und arterielle Mitteldruck. Wenn ein Microinjector/Pulser für Hirnstamm Manipulationen verwendet wird, kann ein Logiksignal von diesem Gerät in der RSNA/BP Aufnahmen dokumentieren das Timing der CNS Manipulationen eingeführt werden.
- Wenn das Experiment beendet ist, bestimmen des Geräuschpegels durch Zerkleinern Nervus proximal zu den Aufnahme-Elektroden zwischen der Silica-Gel und die spinale Muskel. Datensatz mindestens 30 s von diesem "Nullwert" RSNA4,5,6. Als ein alternativer Ansatz zur Quantifizierung Lärm verwalten Sie einen kurzwirksames ganglionic Blocker wie Atropin, Hexamethonium, Chlorisondamine oder Pentolinium Tartrat8,15,16, 17.
- Sorgfältig die RSNA Elektrode und entfernen Sie alle Spuren von Silica-Gel aus Draht-Elektroden. Speichern Sie die Elektrode zur Wiederverwendung. Schalten Sie den telemetriesender und entfernen Sie es, dabei nicht an die Spitze des Katheters beschädigen.
(8) Sterbehilfe (Transcardiac Perfusion)
- Identifizieren Sie die Standorte der CNS Manipulationen durch die Injektion von Farbstoffen oder Fluorochromes, elektrolytische Läsionen zu schaffen oder durch den Nachweis von c-fos Expression.
- Wenn Gehirn Analysen Fixierung benötigen, bereiten Sie die Ratte Transcardiac Perfusion. Bewerten des Zehe-Prise Reflexes um sicherzustellen, dass die Ratte tief narkotisierten bleibt. Bei Bedarf bereitzustellen Sie zusätzliche Anästhesie. Führen Sie Transcardiac Perfusion Paraformaldehyd Fixativ in einer Dampfhaube.
Achtung: Avid Haut/Augen reizt. - Die Perfusion Pumpe und Prime mit normalen Kochsalzlösung 0,9 % stecken Sie Schlauch.
- Ein ca. 5-6 cm seitlichen Einschnitt durch die Haut und Bauchdecke direkt unterhalb des Brustkorbs und die Brusthöhle zu öffnen. Trennen Sie die Leber vorsichtig von der Membran. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran mit gebogenen stumpfe Schere. Injizieren Sie 0,1 mL Heparin direkt in den linken Ventrikel.
- Führen Sie eine Perfusion Nadel in den linken Ventrikel (eine Magensonde Nadel Edelstahl eignet sich gut für diesen Schritt) von entweder Punktion ins Herz oder durch einen kleinen Schnitt Schneiden mit einer scharfen Schere und vorbei an der Magensonde Nadel durch, so dass die Spitze durch sichtbar ist die Wand der Aorta (aber sollte nicht erreichen der Aortenbogen). Verwenden Sie einen chirurgische oder elektrischen Clip, um die Nadel im Ort zu sichern.
- Verwalten Sie mit Hilfe einer Infusionspumpe, normale Kochsalzlösung 0,9 % (Raumtemperatur). Sofort legen Sie einen 2-3 mm Einschnitt in den rechten Vorhof erstelle ich ein Ventil für die Kochsalzlösung spülen an. Schneiden Sie nicht die absteigende Aorta. Bis die Leber ändert sich die Farbe von rot/braun bis gelblich, eine Infusion von ca. 400 mL Kochsalzlösung spülen weiter über 2-3 min.
- Stoppen Sie die Pumpe. Wechseln Sie die Perfusat in das Fixiermittel (zB., 10 % Formalin oder 4 % Paraformaldehyd); 400 mL Infusion über ca. 2-3 min. das Gehirn zu entfernen und die Probe in Fixativ Lösung über Nacht bei 4 ° C zu lagern, bevor Sie das Gewebe auf 30 % Saccharose (30 mL von Saccharose in 100 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung aufgelöst) übertragen, für mindestens 3 Tage oder bis das Gehirn sinkt , für Cryoprotection vor Cryogenetic18-Schnitt.
9. Daten analysieren
- Vollweg-korrigieren die rohen RSNA, Absolute Werte zu erhalten. Vollweg-korrigieren ein 10 s-Segment der rohen Rauschsignal. Es ist wichtig, keine Studien, die von einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis betroffen waren. In Studien quantifizieren RSNA angewendet Ermittler apriorische Kriterien wie die Signal zu Rausch-Verhältnis 2:1 und 6:117,19,20überschreiten.
- Berechnen Sie der Mittelwert korrigiert RSNA für nicht-überlappende Segmente (µV) und subtrahieren die Lärm-Schätzung (µV). Abhängig von den Zielen des Experiments Ermittler können wählen Sie Intervalle z. B. 10 s (Abbildung 1) oder 1 S. berechnen bedeutet mit Wellenform Analysemöglichkeiten in der physiologischen Software oder Export der Daten in Tabellen zur Berechnung des Durchschnitts für ausgewählten Zeitabständen.
- Um über verschiedene Tiere zu normalisieren, drücken Sie aus, Werte für weitere Analysen wie die prozentuale gegenüber dem Ausgangswert Veränderung. Verwenden Sie parametrische Statistiken, um die gruppenvergleiche durchzuführen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine Probe RSNA und BP-Aufnahme aus einer Ratte Nembutal betäubt. Eine intravenöse Injektion von Phenylephrin wurde verwendet, um eine Zunahme der mittleren arteriellen Druckes induzieren und zu evozieren die Baroreflex und transiente Sympathoinhibition4,6. Quantifizierung der RSNA war die rohe RSNA gleichgerichtet und gemittelt für 10 s-Segmente nicht überlappende; die Lärm-Schätzung wurde von jedem Segment abgezogen.
Abbildung 1: RSNA und BP in Reaktion auf Phenylephrin Injektion IV. Die rohen RSNA (A) war Vollweg-korrigiert (B); zerkleinerte "Null" behoben RSNA ist im Einschub Cgezeigt. Nicht-überlappende 10 s Durchschnitte (minus Rauschen) wurden berechnet (D). Um die Baroreflex hervorrufen, wurde intravenös (beim Pfeil) 0,1 mL Phenylephrin (1 µg/mL) injiziert. Die Bolus-Infusion löste einen abrupten Anstieg der BP und vorübergehende Hemmung der RSNA. Diese Zahl wurde von Fink AM, Dean C, Klavier Herr, Carley DW angepasst. Die Pedunculopontine Tegmentum steuert renalen sympathischen Nerven-Aktivität und Kardiorespiratorische Aktivitäten bei Ratten Nembutal betäubt. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wichtige Schritte zur Messung der RSNA gehören: (1) Vermeidung von dehnen der Nierenarterie und Nerven, wenn die Niere die Trennung von der paraspinalen Muskulatur und beim Platzieren der Nerv-Segment auf den Aufnahme-Elektroden (2) sorgfältig seziert die renale Nervenfasern aus dem umliegenden Gewebe/Schiff (3) zu gewährleisten, die die Elektrode Leitungen sind frei von Gewebe, Blut oder Lymphflüssigkeit und die Nerven vor dem Austrocknen durch die Anwendung von Mineralöl auf die renale Nerven und Silica-Gel auf die Nerv-Elektroden-Einheit (4) zu verhindern. Für die Fehlersuche ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Aufnahmesystem ausreichend geerdet ist. Um ein klares Signal der RSNA zu erhalten, kann die Position der Elektrode sorgfältig eingestellt werden, während der Visualisierung und hören das Rohsignal RSNA, vor dem Einbetten in Silica-Gel. Erfolgreicher Abschluss der Operation resultiert ein RSNA-Signal, das durch CNS Manipulationen für die Experimente mehrstündigen moduliert werden kann.
Bei der Interpretation der Ergebnisse sollten die Ermittler den Einfluss der Anästhesie auf arterielle Mitteldruck und RSNA. Dieses Protokoll verwendet Barbiturat-Narkose (Pentobarbital-Natrium), die mittleren arteriellen Druck reduzieren und autonome Reaktionen21ändern kann. Je nach dem Experiment kann Ziele, anderen injizierbaren Formulierungen oder Inhalation Anästhesie (via Nase-Kegel oder Tracheostoma) verwendeten22sein. Forscher sollten die Alternativen wie Urethan23 und Alpha-Chloralose24. Diese Agenten haben weniger Auswirkungen auf die Herz-Kreislauf-Reflexe Abstumpfung aber mögliche gesundheitliche Gefahren auf die Ermittler darstellen können.
Zusätzlich zu den in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sind alternative Ansätze von anderen Labors für die Erfassung und die Herstellung von Elektroden eingesetzt worden. RSNA kann mit Edelstahl4,9, silberne25oder Platin26 Draht aufgezeichnet werden. Neben der Aufhebung der freigelegten Nerv-Segment auf der Elektrode Draht, haben Wissenschaftler erfolgreich monophasisch erfasst, RSNA an den zentralen Enden der renalen sympathischen Nerven26geschnitten. Flexibilität unterscheidet sich basierend auf die Zugfestigkeit des Drahtes (gemessen mit kPSI Einheiten). Höheren kPSI Draht ist eher spröde, aber behält seine Form; niedrige kPSI Draht ist flexibler und weniger wahrscheinlich zu brechen, wenn wiederholt gebogen. Für RSNA Aufnahmen ist es wichtig, einen Draht zu wählen, der leicht gebogen und bei Aufnahmen neu positioniert. Der Draht sollte nicht allzu flexibel, so dass es schwierig, Haken, um position unter den Nerv zu erstellen, aber nicht zu steif sein. Letzteres erhöht das Risiko von Strecken und die Nerven zu beschädigen. Unser Labor wird Draht aus nichtrostendem Stahl mit 155-185 kPSI verwendet.
Viele Ansätze für die Analyse der RSNA stehen zur Verfügung. Anstatt die Durchschnittswerte für 10 s Aufzeichnung Segmente Quantifizierung und Berechnung der Unterschiede als die Prozent Änderung, RSNA ermittelt werden, durch Quantifizierung platzen Frequenz4,26,27. Dieser Ansatz kann bevorzugt sein, wenn die Ausgangswerte und Größen der RSNA Antworten unter Ratten in einer Studie15,26unterscheiden. Ein weiterer Ansatz beinhaltet die Berichtigung und die Integration des RSNA Signals; die RSNA Amplitude (gemessen in mV) wird über einen ausgewählten Zeitraum hinweg summiert (zB., 20 ms)15,26. Integrator wendet einen Filter Low-Phase und bietet die durchschnittliche Entladung Amplitude während Aktivitätsspitzen überschreiten die Zeitkonstante (zB., > 20 s)15,27. Integrierte Signale eignen sich für die Prüfung der Amplitude und Phase der RSNA, aber dieser Ansatz liefert keine Informationen über oszillierenden Änderungen. Frequenz-Domäne und Zeit Domäne-Methoden wurden angewendet, wenn Forscher RSNA Schwingungen untersuchen. Der Ansatz häufig für RSNA ist die schnelle Fourier-Transformation (FFT), die ein Signal in die sinusförmigen Schwingungen kategorisiert, jeweils mit einer eindeutigen Amplitude und Phase20,26. FFT ist ein sinnvoller Ansatz für die Prüfung der nieder- und hochfrequente platzt in der RSNA und für das Studium Atem- und Herzstillstand Modulation des Signals RSNA.
Die Methoden in diesem Protokoll sind wichtig für den Umgang mit Hypothesen über die funktionale Bedeutung von CNS-Kernen. Renalen sympathische Nerven direkte neuronale Kommunikation zwischen dem ZNS und Nieren und akute Veränderungen im RSNA stellen daher eine wichtige Variable in der Herz-Kreislauf-Forschung. CNS-Mechanismen, die Regulierung der sympathischen Abfluss zu definieren ist ein Schwerpunktbereich Forschung, wenn man bedenkt, dass renale Sympathoexcitation trägt zur Pathophysiologie und klinische Präsentation vieler Krankheiten (zB., chronische Nierenerkrankungen, Herz Ausfall, Herzrhythmusstörungen, Diabetes Mellitus und Obstruktive Schlafapnoe)28,29. Indirekte Maßnahmen der sympathischen Nerven-Aktivität (zB., BP, Herzfrequenz-Variabilität, Katecholamin-Ebenen) eignen sich nicht immer für die Studien über die funktionale Bedeutung von CNS-Kernen. Daher stellt die direkte Messung der RSNA und arterielle Mitteldruck bei anästhesierten Ratten eine wertvolle Methode zur funktional, anatomisch Definition der Quellen der aberranten sympathischen Nierenfunktion.
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Disclosures
Anne M. Fink ist Mitglied des Kundenbeirats für Data Sciences International.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute for Nursing Research (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
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