Summary
Методы измерения симпатической и сердечно-сосудистой ответы на манипуляции центральной нервной системы (ЦНС) имеют важное значение для продвижения нейронауки. Этот протокол был разработан для оказания помощи ученым с измерения и количественной оценки острого изменения почечной симпатической нервной активности (RSNA) в наркотизированных крыс (не выживание).
Abstract
Активность почек симпатических нервов (RSNA) и среднее артериальное давление являются важными параметрами в вегетативной и сердечно-сосудистых исследований; Однако существуют ограниченные ресурсы, направляя ученых в области методов измерения и анализа этих переменных. Этот протокол описывает методы для измерения RSNA и среднее артериальное давление на наркотизированных крысах. Протокол также включает в себя подходы для доступа в мозг во время записи RSNA для манипуляции центральной нервной системы (ЦНС). Техника записи RSNA совместим с фармакологическим, optogenetic, или электрическая стимуляция ЦНС. Этот подход полезен, когда следователь будет измерять краткосрочные (мин до h) вегетативных реакций в экспериментах-выживание анатомической коррелирует с ядер ЦНС. Этот подход не предназначен для быть использованы для получения хронический (выживание) записи RSNA в крыс. Сбросов в RSNA, среднем исправить RSNA, и среднее артериальное давление может быть количественно и проанализированы с использованием параметрических статистических тестов. В статье также описаны методы для получения венозного доступа, запись среднее артериальное давление телеметрической и фиксации мозга для будущих гистологический анализ.
Introduction
Доклинические открытий о автономный контроль сердечно-сосудистой системы стратегий для управления расстройств, таких как гипертония, сердечная недостаточность и хронической болезнью почек. Чрезмерная активность симпатической нервной системы и сокращение сердечной вагусной тон способствовать повышение артериального давления (ад)1. Хронически повышенным почечной симпатичная(ый) отток повышает секрецию катехоламинов и уменьшается почечного кровотока, пагубные последствия для сердечно-сосудистой/почечной системы2,3. Чтобы определить нейробиологических путей, ведущих к вегетативной дисфункции, исследования на грызунах имеют важное значение для определения, как нейроны центральной нервной системы (ЦНС) регулируют симпатичная(ый) параметров. Целью настоящего Протокола является предоставление технической информации об измерении деятельности почек симпатических нервов (RSNA) и BP и наметить методы количественной оценки острого симпатичная(ый) изменения в ответ на ЦНС манипуляции наркотизированных крыс.
Острый (не выживание) RSNA измерений (прочного мин h) полезны, когда ученые будут зонд ЦНС фармакологически, электрически, или optogenetically в наркоз крыс для определения функций конкретных ядер. С помощью этих методов, структуры, такие как одиночные ядра, periaqueductal Грей, pedunculopontine покрышки и Ростральные вентролатеральные продолговатого исследованы определить нейробиологических пути, регулирующие симпатичная(ый) параметры4, 5,6,7. Этот подход имеет важное значение для определения целей CNS должны расследоваться далее в хронический модели вегетативной дисфункции8,9. Для завершения этих экспериментов, Лаборатория требует паяльник, хирургический Микроскоп, Стереотаксическая рама, микроэлектродные усилитель и аудио монитора. В зависимости от факторов в лабораторных условиях, способствующих электрических шумов области хирургической/записи может потребоваться Фарадея клетка/заземления ремешок для уменьшения электрического шума в RSNA записи. Если анализ мозга будет требовать фиксации ткани, требуются перфузионного насоса и дыма капот. Данные могут быть оцифрованы и записаны с помощью нескольких физиологических данных программного обеспечения/приобретение (аналого цифровой преобразователь) единиц4,5, анализа различных вариантов и совместимость для включения телеметрических сигналов .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные были утверждены Комитетом институциональных животное уход в университете штата Иллинойс в Чикаго.
1. Создание биполярного RSNA электродов
- Чтобы создать электрода, вырежьте два кусочка нержавеющей стальной проволоки примерно 18 мм в длину. Вырежьте один кусок полиэтилена (PE-50) труб приблизительно 15 мм длиной. Кормите оба куска проволоки в НКТ, оставляя торчащий из обоих концах провода.
- Удалите изоляцию от концы проводов; Трим провода, оставляя 2-3 мм подвергаются проволоки. На одном конце Обжимные мужской контакты подвергаются проводам. Паять контакты надежно к проводу, обеспечить контакты внутри соединительная планка и охватывать связь с эпоксидной смолы.
Примечание: Альтернативный подход, который избегает пайки является использование быстрого подключения/выпуска крокодил. - На противоположном конце электрода удалите изоляции от концы проводов, оставляя 2-3 мм подвергаются проволоки. Согните эту часть провода для создания небольших «V» формы крючков в неизолированных проводов.
Примечание: Это часть электрода, что будет в контакте с почечной симпатического нерва. Это важно для герметизации этого жидкости по предотвращению попадания труб. Можно использовать силиконовый или эпоксидной эффективно.
2. администрирования анестезии и подготовить хирургических сайтов
- Применять анестезию мужской Sprague-Dawley крыса (возраст 9-11 недель, весом 150-400 мкг). Администрировать Пентобарбитал натрия 50 мг/кг через внутрибрюшинной инъекции (IP). Для оценки стабильной плоскости анестезии во время операции, проверьте мыс щепотка рефлекс каждые 15 минут и повторно доза наркоза при необходимости.
Примечание: Пентобарбитал натрия (нембуталовым) был использован в ходе предыдущих исследований для достижения устойчивой плоскости анестезии без мешать с модуляцией RSNA4,5,6. Этот протокол предназначен для хирургии-выживание, поэтому без восстановления/после-operative период мониторинга. - Подготовка хирургической сайта согласно рекомендации институционального ухода за животными (т.е., брить живота, спины и головы крысы; очищения кожи с 10% раствор повидон йод; смазать глаза; и место крысы на грелку). Поддерживать температуру тела при 37 ° C в ходе экспериментов.
3. иглу бедренной вены (для внутривенного доступа)
- Добавление гепарина для стерильного 0,9% физиологического раствора (для достижения 20 единиц/мл). Залейте гепаринизированным физиологического раствора 1 мл шприц через иглой 22G. Подключите 15 см труб PE-50 иглы и заполнения трубки с решением.
- С крысы, лежа на спине создайте 2 см горизонтальный разрез через паховой области. Использование ватным наконечником аппликаторы, вскрыть соединительную ткань подвергать бедренной вены и артерии. Держать открытым разрез, либо применить эластичное сингл крючок хирургический остается прикрепленной к операционного поля с шелком или скотчем использовать небольшие hemostats.
- Используйте hemostats чтобы согнуть кончик иглой 22G под углом в 90° в качестве катетера интубатор10.
- Визуализируйте судов под микроскопом. Аккуратно отделить Вены и артерии, используя Изогнутый пинцет. Место два 12 см длиной 5-0 Шелковый шов под вен (один дистальный и один проксимальный); место шва аналогичным образом под артерии.
- Галстук дистального (внизу) швом чтобы загородить вен; Закрепите края этого шва до операционного поля с использованием шелковой ленты или небольших hemostats. Осторожно потяните Вену натянута, но не с так много сил, что судно будет слезоточивый. Расположите вен перпендикулярно хирурга доминирующей рукой.
- Используйте свободные сверху половину узел в проксимальных шовный материал для кратко загородить Вену. С деликатной гемостатический пинцет осторожно зажмите этот шов, чтобы загородить поток крови. Держите иглой 22G с изогнутой кончиком в руке недоминирующих; Пряжка труб с щипцами доминирующей рукой.
- Прокол небольшое отверстие в Вену с катетера интубатор (шаг 3.3) и вставьте трубы PE-50 (заранее наполненный гепаринизированным физиологического раствора) в судна; Используйте изогнутой иглой держать открытие в открытом судна и для оказания помощи в позиционировании кончик катетера в сосуд10.
- Отпустите проксимальной шовный материал и осторожно промойте 0,2 мл физиологического раствора гепаринизированным в Вену; продвигать катетер. Проверка возврата крови из Вены для обеспечения правильного размещения. Завершить проксимальной узел и с дистальной шовные галстук, безопасной трубы внутри Вены.
- Используйте венозного доступа в ходе экспериментов, для управления дополнительной анестезии или лекарства и для сбора крови. Включать 3-контактный разъем, если необходимо будет регулярно внутривенного вливания и забора крови. Проверьте вредных мыс щепотка рефлекс каждые 15 мин к Титруйте анестезии.
4. иглу бедренной артерии для мониторинга среднее артериальное давление
- Визуализируйте артерии под микроскопом. Подобный метод используется для катетеризации вен, галстук дистальной шовные (шаг 3.4), чтобы загородить артерия; Закрепите края этой Шовные хирургические поле с шелковой лентой и положение артерии перпендикулярно хирурга доминирующей рукой.
- Артериальной доступа при использовании датчика/инфузионные системы давления
- Подключение датчика давления/трубы в 500 мл 0,9% солевой мешок. Очистка труб с соленой, удаляя все пузыри и поместите мешок мешок индуктором давление давление в системе.
- Как описано в шаге 3.1, залейте гепаринизированным физиологического раствора 1 мл шприц через иглой 22G и соедините 15 см PE-50 иглы (флеш трубки с гепаринизированным физиологического раствора).
- Используйте потерять половину узел в проксимальных шовный материал для кратко загородить артерии. Держите катетера интубатор (шаг 3.3) в руке недоминирующих; Держите дистального наконечника PE-50 с судна катетеризации щипцами в доминирующей рукой. Проколоть отверстие в артерии с изогнутой иглой 22G и Вставьте канюлю судна.
- Релиз проксимальной шовный материал, нежно скрытой 0,2 мл физиологического раствора гепаринизированным в артерии и заранее катетер, насколько это возможно. Проверить наличие артериальной крови возврата для обеспечения правильного размещения. Завершить проксимальной узел и с дистальной шовные галстук, безопасной трубы внутри артерии. Соедините артериального давления датчика/трубы.
Примечание: Дистальная часть трубы можно приклеенный к крыса задних конечностей для обеспечения артериальной линии. Альтернативный подход к судну катетеризации характеризуется Йесперсен и др.; 11 их протокол отличается с помощью ретракторы распространить разрез, клей довольно чем шва для защиты труб и подход не включают в себя интубатор изогнутой иглой.
- Артериальной доступа при использовании телеметрии
- Проверьте давление зондирования катетера под большим увеличением до артериальной катетеризации. Убедитесь, что катетер пузыри/мусора и имеет нетронутыми мениска между заполненные жидкостью (проксимальной) и гель заполнены (дистальной части) компонентов. Перед каждой имплантации пополните геля на дистального наконечника катетера. Включите передатчик с помощью магнита; контроль BP во время операции, чтобы выдержать совершенный размещения.
- Используйте свободные сверху половину узел в проксимальных шовный материал для кратко загородить бедренной артерии. Держите катетера интубатор (шаг 3.3) в руке недоминирующих. Держите кончик канюля телеметрия единицу с судна катетеризации корнцанг чтобы избежать, вытесняя гель от кончика.
- Проколоть отверстие в артерии с изогнутой иглой 22G и Вставьте канюлю в артерии, используя судно катетеризации щипцы во избежание вытесняя гель от кончика. Заранее канюля, насколько это возможно. Используя проксимальном и дистальном шовные связей, Закрепите катетер давления.
- Уложить тела имплантата телеметрии внутри прилегающих к разрез фланка и закройте этот разрез с помощью швом нейлона 4-0 на игле резки. Отключите устройства телеметрии, магнит в конце периода записи для экономии батареи.
5. позиция крыса в кадре стереотаксической хирургии для доступа к мозг
- Аккуратно переместите крыса в лежачем положении в рамках стереотаксической хирургии.
- Позиции крысы между брусьями уха и настроить панель резцов для выравнивания высоты лямбда и bregma. Позиционирование может зависеть от крысы штамм, вес и расположения целей ЦНС.
- Сделайте надрез скальпелем rostrocaudal 2 см через midline волосистой части головы. Использование ватным наконечником аппликаторы, твердо удалите соединительной ткани с поверхности черепа. Применить пероксида водорода с черепом для оказания помощи в визуализации bregma, лямбда и срединной линии швов.
- Пользуясь атласом мозга крысы руководство таргетинга12, сверлить остеотомия отверстие Берр, размера для доступа электрода, через череп.
6. изоляция почечной симпатического нервов
- Подключите провод RSNA электрода (шаги 1.1-1.3) к 10 X предварительного усилителя и микроэлектродные усилителя.
- Изолировать почечной нервов через ретроперитонеальный разрез до, или после, крыса обеспечивается в стереотаксической рамы. Положение электродов RSNA после крыса в стереотаксической рамы. Сделайте скальпель разрез простирается от 4-5 см ниже ребер в хвостовой направлении, немного сбоку позвоночника. Блант вскрыть разрез для визуализации paraspinal мышц.
- Используйте ножницы, чтобы сделать разрез rostrocaudal очень поверхностно 1-2 см, где жир встречает мышцы. Использование ватным наконечником аппликаторы, распространение жира от мышцы, чтобы визуализировать почки. Важно, чтобы не ввести перитонеального пространства.
- Используйте ретракторы аккуратно отделить от paraspinal мышцы, чтобы визуализировать брюшной аорты и почечных артерий почек. Не растягивается судов чрезмерно, чтобы избежать повреждения почек нервы. Используйте 2 "x 2" хлопок марлевую прокладку пропитанной физиологического раствора для защиты почек от травмы.
- Под большим увеличением определите почечной нервы в кармане разрез. Нервные пучки наиболее легко видны в правый угол, образованный аорты и почечных артерий. Почечная нервы внимательно следить за почечной артерии из аорты на почки.
- Выберите сегмент нерва расслоение, которые будут размещены на запись электрода. Аккуратно вскрыть нервных волокон от окружающих тканей/судна с помощью микро Рассекающий пинцета.
- Безопасный провода RSNA электрода в держателе (например., Аллигатор клип прилагается к поддержке стенд). Нижняя электрода до уровня сегмента нерва. Используйте нерва крюк, чтобы аккуратно поднимите сегмент почечной нерва на электрода без растяжения нерва.
Примечание: Нерва должна лежать внутри как «V» формы крючков в неизолированного провода, параллельно нерва. Электрод провода не должны коснуться ткани, крови и лимфатической жидкости. - Заполните разрез с минеральным маслом для предотвращения подвергаются почечной симпатических нервов стать сухой. Используйте зажим заземления с одного конца на коже разрез и придает клетку Фарадея.
- Направляйте сигнал для усилителя с помощью высоких и низких частот фильтрации (10 Гц и 3 кГц). Отрегулируйте коэффициент усиления до 10 K. включить аудио монитора для оценки разрывной шаблон RSNA. Используйте частоту выборки колеблется от 2000-10000 Гц4,5,6,,78. Используйте повышенной дискретизации, когда манипуляции ЦНС предположить, чтобы вызвать быстрое/краткая симпатичная(ый) ответы.
7. запись данных
- Оценить качество записи RSNA, вызвав барорефлекторной с болюсным инъекции 1 мл физиологического раствора или 10 мкг/мл фенилэфрин (в 0,1 мл) внутривенно. Как показано на рисунке 1, настой следует увеличить BP и подавляют RSNA. Увеличение среднее артериальное давление 60-80 мм рт.ст достаточен для почечной sympathoinhibition4,,1314.
- Отрегулируйте положение электродов для улучшения сигнала при необходимости. Репозиционирования не требуется, если нерв не соприкасается с обеих крючки на электроде или любой ткани, крови или лимфы жидкость находится в контакте с провода.
Примечание: Необходимость переориентации основана на слуховой характеристики нервных сбросов.- Если очередей RSNA не происходят циклически с сердечного цикла и если есть любое вмешательство в записи, затем тщательно перемещать электрод.
- Как дыхательных движений может также повлиять на качество записи RSNA, улучшить сигнал, нежно перемещение электрода в позиции, где движения мышц не нарушить электрода во время дыхания.
- Получив четкий сигнал, безопасный RSNA электрода в месте путем снятия минерального масла и применения силикагель для покрытия подключение к нерва/электрод в кармане разрез. Не перемещайте крыса, прежде чем гель полностью.
- Выполнять протоколы манипуляции ЦНС при непрерывно записи RSNA и среднее артериальное давление. Если microinjector/генератор используется для манипуляции ствола мозга, логический сигнал от этого устройства может быть введено в RSNA/BP записи в документ сроков ЦНС манипуляций.
- Когда эксперимент завершится, определите уровень шума путем дробления проксимальнее электроды записи между силикагеля и спинальной мышечной нерва. Запись по крайней мере 30 s этого «нулевой» значения для RSNA4,5,6. В качестве альтернативного подхода для количественного определения шума администрировать блокатор Ганглиозный короткого действия, например, атропин, hexamethonium, chlorisondamine или pentolinium тартрат8,,1516, 17.
- Осторожно удалите RSNA электрода и никаких следов силикагель с электродами провода. Сохраните электрод для повторного использования. Выключить телеметрия передатчика и удалить его, стараясь не повредить наконечник катетера.
8. эвтаназии (Transcardiac перфузии)
- Определите места ЦНС манипуляции путем инъекций красителей или флуорохромов, создавая электролитический поражения, или путем обнаружения c-fos выражения.
- Если анализ мозга будет требовать фиксации, подготовиться крыса transcardiac перфузии. Оцените мыс щепотка рефлекс для обеспечения глубоко наркотизированных крыс. Обеспечивают дополнительное Обезболивание при необходимости. Выполните transcardiac перфузии параформальдегида фиксатором зонта.
Предупреждение: Жадный кожи глаз раздражитель. - Вставьте трубки в перфузионный насос и премьер с 0.9% нормальное saline.
- Сделать 5-6 см боковой разрез через кожу и брюшной стенки непосредственно под грудной клеткой и открыть грудной полости. Осторожно отделите печени от диафрагмы. Сделайте небольшой надрез в диафрагмы, изогнутые тупыми ножницами. Inject 0,1 мл гепарина непосредственно в левого желудочка.
- Передать перфузии иглы в левого желудочка (иголка калийную нержавеющей стали хорошо работает для этого шага), либо проколов в сердце или путем разрезания небольшой разрез с помощью острых ножниц и передавая затравки иглы через, так через виден кончик стенки аорты (но не должны доходить до аорты). Для защиты иглы в месте используйте хирургические или электрические клип.
- Инфузионный насос, управлять физиологический 0,9% (комнатной температуры). Немедленно создайте 2-3 мм разрез в правое предсердие создать выход для солевые полоскания. Не режьте нисходящей аорты. Продолжать солевые полоскания до печени меняет цвет от красно коричневого до бледно-желтого цвета, настой приблизительно 400 мл более 2-3 мин.
- Остановите насос. Переключение perfusate с фиксатором (например., 10% формалина или 4% параформальдегида); наполнить 400 мл более 2-3 мин удалить мозга и хранить образца в фиксирующие растворе на ночь при 4 ° C перед передачей ткани на 30%-ая сахароза (30 мл растворяют в 100 мл физиологического раствора фосфатного буфера 0,1 М сахарозы), по крайней мере 3 дней или до тех пор, пока мозг раковины , для криозащиты перед cryogenetic, секционирование18.
9. анализ данных
- Многоволновой исправить сырья RSNA для получения абсолютного значения. Многоволновой исправить 10 s сегмент сырье шумового сигнала. Важно исключить какие-либо исследования, которые были затронуты низкое соотношение сигнал шум. В исследованиях количественной RSNA следователи априорные критерии таких требующих сигнал шум соотношение превышает 2:1 до 6:117,19,20.
- Вычислите среднее значение исправлено RSNA для non перекроя сегментов (МКВ) и вычесть оценку шума (МКВ). В зависимости от целей эксперимента, следователи могут выбрать интервалы например 10 s (рис. 1) или 1 s. Calculate значит с помощью опции анализа осциллограмм в физиологической программного обеспечения или экспорта данных в электронные таблицы для расчета средних показателей для выбранные временные интервалы.
- Нормализовать через различных животных, выражают значения для дальнейшего анализа как изменить процент от базового плана. Используйте параметрические статистические данные для проведения сравнений группы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 иллюстрирует пример RSNA и BP запись с крысу под наркозом нембуталовым. Внутривенные инъекции фенилэфрина был использован чтобы вызвать увеличение среднее артериальное давление и вызывают барорефлекторной и переходных sympathoinhibition4,6. Для количественного определения RSNA, сырье RSNA было исправлено и в среднем для non перекроя 10 s сегментов; шум смета была вычтена из каждого сегмента.
Рисунок 1: RSNA и BP в ответ на фенилэфрин инъекция IV. Сырые RSNA (A) было исправлено полный волны (B); исправить щебня «ноль» RSNA показано на врезные C. Non перекроя 10 средние s (минус шум) были рассчитаны (D). Чтобы вызвать барорефлекторной, 0,1 мл фенилэфрина (1 мкг/мл) вводили внутривенно (на стрелку). Болюс настой вызвало резкое увеличение BP и переходных ингибирование RSNA. Эта цифра была адаптирована из Fink AM, декан C, Мистер фортепиано, Карли DW. Покрышки pedunculopontine контролирует активность почек симпатических нервов и кардиореспираторной деятельности под наркозом нембуталовым крыс. PLoS один. 2017; 12 (11): e01879564. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги для измерения RSNA включают в себя: (1) избегая растяжением почечной артерии и нервы при разделении почки от paraspinal мышц и при размещении сегмента нерва на запись электродов, (2) аккуратно вскрывали почечной нервных волокон от окружающих тканей/судна (3) обеспечение того, чтобы провода электрода свободны от ткани, крови, или лимфатической жидкости и (4) предупреждение нерв от высыхания, применяя минеральное масло почечной нерва и силикагель к блоку нерв электрода. Для устранения неполадок, важно обеспечить что система записи должным образом заземлен. Чтобы получить четкий сигнал RSNA, положение электрода может быть скорректирована тщательно визуализации и слушая необработанный сигнал RSNA, до внедрения в силикагель. Успешное завершение операции приводит к RSNA сигнал, который может быть модулированные ЦНС манипуляции для экспериментов, длится несколько часов.
При интерпретации результатов, следователи должны рассматривать влияние анестезии на среднее артериальное давление и RSNA. Этот протокол использует барбитурат анестезии (Пентобарбитал натрия), который может уменьшить среднее артериальное давление и изменять вегетативных реакций21. В зависимости от эксперимента цели, другие инъекционные составы или ингаляционного наркоза (через нос конус или трахеостомические) может быть использоваться22. Исследователи могут рассмотреть альтернативы, такие как уретана23 и альфа chloralose24. Эти агенты имеют меньшее влияние на сердечно-сосудистые рефлексы притупления, но могут представлять потенциальные опасности для здоровья к следователю.
Помимо методов, описанных в настоящем Протоколе альтернативные подходы были заняты другими лабораториями для записи и изготовления электродов. RSNA могут быть записаны с использованием нержавеющей стали4,9, серебряные25или провод платины26 . В дополнение к отмене подвергается нерв сегмента на электродной проволоки, ученые успешно записали монофазные RSNA в центральном концах вырезать почечной симпатического нервов26. Гибкость отличается по прочности проволоки (измеряется с kPSI единиц). Выше kPSI проволока является более хрупким, но сохраняет свою форму; низкая kPSI проволока является более гибким и меньше шансов на перерыв при изгибе, многократно. Для RSNA записи важно выбрать провод, который может быть легко изогнутых и перемещать во время записи. Провода не должны быть слишком гибким, что делает его трудно создать крючки в положение под нерва, но не слишком жесткой. Последний увеличивает риск растяжения и повреждения нервов. Наша лаборатория использует нержавеющей стальной проволоки с 155-185 kPSI.
Многие подходы для RSNA анализа доступны. Вместо того, чтобы количественной оценки средние 10 s запись сегментов и расчета различия как процент изменения, RSNA может определяться количественной всплеска частоты4,,2627. Этот подход может оказаться предпочтительным, когда базовые уровни и величины RSNA ответы отличаются среди крыс в исследовании15,26. Другой подход включает в себя исправление и интеграция RSNA сигнала; амплитуда RSNA (измеряется в МВ) суммируется за выбранный интервал времени (например., 20 мс)15,26. Интегратор применяет фильтр низкого фаза и обеспечивает средний разряд амплитуды во время всплесков активности, превышающей постоянная времени (например., s > 20)15,27. Интегрированный сигналы полезны для изучения амплитуда и фаза RSNA, но этот подход не предоставляет информацию о колебательные изменения. Были применены методы домена домен и время частота когда исследователей изучить RSNA колебания. Подход, часто используемые для RSNA является быстрого преобразования Фурье (БПФ), который относит сигнал синусоидальных колебаний, каждый с собственный амплитуда и фаза20,26. БПФ является полезным подходом для изучения низко - и высокочастотные очередей в RSNA и для изучения дыхательной и сердечной модуляции сигнала RSNA.
Методы в этом протоколе имеют важное значение для решения гипотезы о функциональной значимости ядер ЦНС. Почечная симпатического нервов прямой нейронные связи между ЦНС и почек, и поэтому, острые изменения в RSNA представляют важной переменной в сердечно-сосудистых исследований. Определение ЦНС механизмы, регулирующие симпатичная(ый) оттока является приоритетной областью исследований, учитывая, что почечной sympathoexcitation способствует патофизиологии и клинической картины многих заболеваний (например., хронические заболевания почек, сердца недостаточность, аритмии, сахарный диабет и обструктивного апноэ сна)28,29. Косвенные меры активности симпатического нерва (например., BP, вариабельность сердечного ритма, уровня катехоламинов) не всегда подходят для исследования на функциональной значимости ядер ЦНС. Таким образом прямое измерение RSNA и среднее артериальное давление на наркотизированных крысах представляет собой ценный метод функционально, анатомически определения источников аберрантных симпатичная(ый) функции почек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Энн м. Fink является членом Консультативного Совета клиента для данных международных наук.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальный Институт сестринского исследований (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
