Summary
Métodos para medir respostas cardiovasculares e simpáticas para manipulações do sistema nervoso central (SNC) são importantes para o avanço da neurociência. Este protocolo foi desenvolvido para auxiliar os cientistas com medição e quantificação agudas alterações na atividade do nervo simpático renal (RSNA) em ratos anestesiados (não-sobrevivência).
Abstract
Atividade do nervo simpático renal (RSNA) e pressão arterial média são parâmetros importantes em pesquisa cardiovascular e autonômica; no entanto, existem recursos limitados, direcionando os cientistas nas técnicas para medir e analisar essas variáveis. Este protocolo descreve os métodos de medição RSNA e pressão arterial média em ratos anestesiados. O protocolo inclui também as abordagens para acessar o cérebro durante as gravações do RSNA para manipulações do sistema nervoso central (SNC). A técnica de gravação RSNA é compatível com farmacológico, optogenetic, ou a estimulação elétrica do SNC. A abordagem é útil quando um investigador vai medir a curto prazo (min h) respostas autonômicas em experiências não-sobrevivência para correlacionar anatomicamente com núcleos de CNS. A abordagem não se destina a ser usado para obter gravações de crônica (sobrevivência) da RSNA em ratos. Descargas no RSNA, em média, retificado RSNA, e pressão arterial média pode ser quantificado e analisado ainda mais usando testes estatísticos paramétricos. Métodos para a obtenção de acesso venoso, pressão arterial média de gravação telemetrically e fixação de cérebro para futura análise histológica também são descritos no artigo.
Introduction
Pré-clínicas descobertas sobre controle autonômica do sistema cardiovascular informam estratégias para o gerenciamento de doenças como hipertensão, insuficiência cardíaca e doença renal crônica. Excesso de actividade do sistema nervoso simpático e reduzida vagal cardíaca Tom contribuem para a elevada pressão arterial (PA)1. Cronicamente elevada vazão simpático renal aumenta a secreção de catecolaminas e diminui o fluxo de sangue renal, com consequências deletérias para os sistemas cardiovascular/renal2,3. Para definir os caminhos neurobiológicos, levando à disfunção autonômica, estudos em roedores são importantes para determinar como os neurônios do sistema nervoso central (SNC) regulam parâmetros simpáticos. O propósito do presente protocolo é fornecer informações técnicas sobre a medição de atividade do nervo simpático renal (RSNA) e BP e delinear as técnicas para quantificar alterações simpáticas agudas em resposta a manipulações de CNS em ratos anestesiados.
Medições de RSNA (não-sobrevivência) agudas (Duração min h) são úteis quando os cientistas irão sondar o CNS farmacologicamente, eletricamente, ou optogenetically em ratos para determinar as funções dos núcleos específicos de anestesiados. Usando estes métodos, estruturas como o núcleo solitário, cinzenta periaquedutal, pedunculopontine tegmentum e medula ventrolateral rostral têm sido investigados para definir caminhos neurobiológicos regulando parâmetros simpático4, 5,6,7. Essa abordagem é importante para a identificação de alvos de CNS para ser investigado mais na crônicos modelos de disfunção autonômica8,9. Para completar estas experiências, o laboratório requer um ferro de soldar, microscópio cirúrgico, armação estereotáxica, amplificador de microeletrodos e monitor de áudio. Dependendo de fatores presentes no laboratório que contribuem para o ruído elétrico, área cirúrgica/gravação pode exigir um Faraday gaiola/aterramento cinta reduzir o ruído elétrico na gravação RSNA. Se as análises do cérebro vão exigir a fixação de tecido, uma capa de bomba e emanações de perfusão são necessários. Dados podem ser digitalizados e gravados usando vários dados/software fisiológica aquisição (conversor analógico-digital) unidades4,5, com opções de diferentes análises e compatibilidades para incorporar os sinais de telemetria .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os métodos descritos foram aprovados na Comissão de cuidados institucionais Animal na Universidade de Illinois em Chicago.
1. criar eletrodos bipolares RSNA
- Para criar o eletrodo, corte dois pedaços de fio de aço inoxidável cada aproximadamente 18 mm de comprimento. Corte um pedaço de polietileno (PE-50) tubulação aproximadamente 15 mm de comprimento. Alimente os dois pedaços de arame para o tubo, deixando o fio salientes de ambos os lados.
- Remover o isolamento das extremidades dos fios; Apare os fios, deixando 2 a 3 mm do fio exposto. Em uma extremidade, cravar pinos machos sobre o fio exposto. Os pinos firmemente ao fio de solda, fixar os pinos dentro de uma faixa de conector e cobrir a conexão com epóxi.
Nota: Uma abordagem alternativa que evita a solda é usar conectar/liberação rápida de jacaré. - Na extremidade oposta do eletrodo, remova o isolamento das extremidades dos fios, deixando 2 a 3 mm do fio exposto. Dobre esta parte dos fios para criar o pequeno "V" em forma de ganchos no fio não isolado.
Nota: Esta é a parte do eletrodo que estará em contato com o nervo simpático renal. É importante selar este final para impedir a entrada da tubulação de fluidos. Silicone ou cola epoxy efetivamente pode ser usado.
2. administrar anestesia e preparação cirúrgicas Sites
- Administre anestesia para um rato de Sprague Dawley masculino (9-11 semanas, pesando 150-400 g de idade). Administrar o pentobarbital de sódio 50 mg/kg, através de uma injeção intraperitoneal de (IP). Para avaliar um avião estável de anestesia durante a cirurgia, verifica o reflexo do dedo do pé-pitada cada 15 min e re-dose de anestesia conforme necessário.
Nota: sódio Pentobarbital (Nembutal) foi usado em estudos anteriores para alcançar um plano sustentado de anestesia sem interferir com a modulação da RSNA4,5,6. Este protocolo não é para cirurgia não-sobrevivência, então não há nenhuma recuperação/post-operative período de monitoramento. - Preparar o local cirúrgico de acordo com as orientações institucionais cuidados com animais (i. e., raspar do rato abdômen, costas e cabeça; limpar a pele com solução de iodo-povidona a 10%; aplicar lubrificante do olho; e coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento). Manter a temperatura do corpo a 37 ° C durante os experimentos.
3. Canule a veia Femoral (para acesso por via venosa)
- Adicione heparina de solução salina estéril 0,9% (para atingir 20 unidades/mL). Encha uma seringa de 1 mL com a solução salina heparinizada através de uma agulha de 22g. Conecte a 15 cm de tubo de PE-50 para a agulha e o tubo de preenchimento com a solução.
- Com o rato em decúbito dorsal, crie-se uma incisão de 2 cm de horizontal a área inguinal. Usando aplicadores com ponta de algodão, disse o tecido conjuntivo para expor a veia femoral e artéria. Para manter a incisão aberta, ou aplicar elástico único gancho cirúrgica fica fixada ao campo cirúrgico com seda fita ou use hemostatos pequenos.
- Use hemostatos para dobrar a ponta de uma agulha 22g em um ângulo de 90° para servir como um cateter introdutor10.
- Visualize os vasos sob o microscópio. Delicadamente, separe a veia e artéria usando curvas fórceps. Lugar dois de 12 cm de comprimento de sutura de seda 5-0 abaixo da veia (um distal e proximal); Coloque a sutura da mesma maneira sob a artéria.
- Amarre a sutura distal (inferior) para obstruir a veia; Prenda as bordas desta sutura ao campo cirúrgico usando fita de seda ou hemostatos pequenos. Puxe cuidadosamente a veia esticada, mas não com tanta força que o navio vai desfazer. Posicione a veia perpendicular à mão dominante do cirurgião.
- Use um nó meia overhand solta na sutura proximal para brevemente occlude a veia. Com pinça hemostática delicada, suavemente fixe esta sutura para obstruir o fluxo sanguíneo. Segure a agulha 22g com a ponta dobrada na mão não dominante; fecho o tubo com a pinça, usando a mão dominante.
- Furar um pequeno buraco na veia com o introdutor de cateter (passo 3.3) e inserir os tubos de PE-50 (previamente preenchido com soro fisiológico heparinizado) do navio; Utilize a agulha torta para manter a abertura no vaso aberto e para auxiliar no posicionamento da ponta do cateter no navio10.
- Liberar a sutura proximal e lave delicadamente 0,2 mL de soro fisiológico heparinizado no interior da veia; Avance o cateter. Verifica o retorno do sangue da veia para assegurar a colocação adequada. Completar o nó proximal e, com gravata distal sutura, fixe o tubo dentro da veia.
- Use acesso venoso durante as experiências para administrar medicamentos ou anestesia suplementar e para coleta de sangue. Incorpore um conector de 3 vias se infusões intravenosas regulares e amostra de sangue será necessários. Verificar nocivas do dedo do pé-pitada reflex cada 15 min para dosear a anestesia.
4. Canule a artéria Femoral para monitorização da Pressão Arterial média
- Visualize a artéria sob o microscópio. Semelhante ao método utilizado para punção venosa, amarre a sutura distal (passo 3.4) para ocluir a artéria; Prenda as bordas desta sutura ao campo cirúrgico com fita de seda e posicionar a artéria perpendicular à mão dominante do cirurgião.
- Acesso arterial se usando um sistema de infusão/transdutor de pressão
- Conecte a transdutor de pressão/tubulação para um saco de solução salina 0,9% 500 mL. Lavar o tubo com soro fisiológico, removendo todas as bolhas e coloque o saco dentro de um saco de indutor de pressão para pressurizar o sistema.
- Conforme descrito no passo 3.1, encher uma seringa de 1 mL com a solução salina heparinizada através de uma agulha 22g e conectar a agulha (flush de tubos com soro fisiológico heparinizado) 15 cm de PE-50.
- Use um nó meia solta na sutura proximal para brevemente ocluir a artéria. Segure o introdutor de cateter (passo 3.3) na mão não dominante; Segure a ponta distal do PE-50 com fórceps de canulação de vasos na mão dominante. Perfure um buraco na artéria com a agulha 22g torta e inserir a cânula no vaso.
- Libere a sutura proximal, suavemente nivelada 0,2 mL de soro fisiológico heparinizado na artéria e avançar o cateter na medida do possível. Verificar se há retorno para assegurar a colocação adequada do sangue arterial. Completar o nó proximal e, com gravata distal sutura, fixe o tubo dentro da artéria. Conecte a linha arterial para a transdutor de pressão/tubulação.
Nota: A porção distal do tubo pode ser colada membro posterior de ratos para fixar a linha arterial. Uma abordagem alternativa para canulação do navio é descrita por Jespersen et al.; 11 que o protocolo deles difere usando afastadores para espalhar a incisão, cola em vez de sutura-para fixar o tubo e a abordagem não inclui o introdutor de agulhas tortas.
- Acesso arterial se usando telemetria
- Inspeccione o cateter de sensoriamento de pressão sob a ampliação elevada antes de canulação arterial. Certifique-se de que o cateter está livre de bolhas/detritos e tem um menisco intacto entre os cheios de líquido (proximal) e preenchida com gel de componentes (distais). Antes de cada implantação, reabasteça o gel na ponta distal do cateter. Ligue o transmissor usando um ímã; BP de monitor durante a cirurgia, para suportar a colocação perfeita.
- Use um nó meia overhand solta na sutura proximal para brevemente ocluir a artéria femoral. Segure o introdutor de cateter (passo 3.3) na mão não dominante. Segure a ponta da cânula da unidade de telemetria com fórceps de canulação do navio para evitar deslocando o gel da ponta.
- Perfure um buraco na artéria com a agulha 22g torta e inserir a cânula na artéria usando fórceps de canulação do navio para evitar deslocando o gel da ponta. Avança a cânula na medida do possível. Usando os laços de sutura proximal e distal, fixe o cateter de pressão.
- Dobre o corpo do implante telemetria dentro o flanco adjacente para a incisão e fechar esta incisão usando sutura de nylon 4-0 em uma agulha de corte. Desliga os dispositivos de telemetria pelo ímã na conclusão do período de gravação para conservar a vida da bateria.
5. Posicione o rato no quadro de cirurgia estereotáxica para acessar o cérebro
- Mova o rato na posição de bruços, no quadro de cirurgia estereotáxica.
- Posicione o rato entre as barras da orelha e ajustar a barra de incisivo para igualar a altura do lambda e bregma. Posicionamento pode depender da cepa de rato, peso e locais de destinos de CNS.
- Faça uma incisão de bisturi rostrocaudal cm 2 através da linha mediana do couro cabeludo. Usando aplicadores com ponta de algodão, firmemente remova tecido conjuntivo da superfície do crânio. Aplica o peróxido de hidrogênio no crânio para ajudar a visualizar o bregma, lambda e suturas de linha média.
- Usando um atlas do cérebro de ratos para orientar o direcionamento12, perfurar uma osteotomia de buraco de rebarba, dimensionada para acesso do eletrodo, através do crânio.
6. isolando os nervos simpáticos renais
- Conecte o eletrodo RSNA fio (passos 1.1-1.3) um microeléctrodo e 10 X pré-amplificador.
- Isole os nervos renais através de uma incisão retroperitoneal antes, ou depois, o rato é garantido na armação estereotáxica. Posicione os eletrodos RSNA uma vez que o rato está no quadro estereotáxica. Fazer uma incisão de bisturi estendendo de 4-5 cm abaixo das costelas na direção caudal, ligeiramente lateral à espinha. Blunt dissecar a incisão para visualizar os músculos paraspinal.
- Use uma tesoura para fazer uma incisão de rostrocaudal muito superficial 1-2 cm, onde a gordura se encontra com o músculo. Usando aplicadores com ponta de algodão, espalhe a gordura longe do músculo para visualizar os rins. É importante não entrar no espaço peritoneal.
- Use retractores para separar o rim suavemente os músculos do paraspinal para visualizar a artéria renal e aorta abdominal. Não estique os vasos excessivamente para evitar danificar os nervos renais. Use uma 2 "x 2" algodão gaze embebida em soro fisiológico para proteger o rim de uma lesão.
- Sob a ampliação elevada, identifica os nervos renais no bolso da incisão. Os feixes nervosos são mais facilmente visíveis no ângulo formado pela aorta e a artéria renal direita. Os nervos renais seguem de perto a artéria renal da aorta para os rins.
- Selecione um segmento do feixe de nervos que será colocado sobre o eléctrodo de gravação. Delicadamente, disse as fibras nervosas do tecido circundante/recipiente usando uma pinça microdissecando.
- Fixar o eletrodo RSNA de fio em um suporte (ex., um agrafo ligado a uma coluna de suporte). Baixe o eletrodo ao nível do segmento do nervo. Use um gancho de nervo para o segmento do nervo renal para o eletrodo, levante suavemente sem esticar o nervo.
Nota: O nervo deve descansar dentro os dois "V" em forma de ganchos no fio não isolado, paralelo ao nervo. Os fios do eléctrodo não devem tocar qualquer outro tecido, sangue ou fluido linfático. - Preencha a incisão com óleo mineral para evitar o nervo simpático renal exposto se tornar seco. Use um grampo de aterramento com uma extremidade na pele da incisão e o outro anexado para a gaiola de Faraday.
- Direcionar o sinal para os amplificadores usando passa-alto e baixo-filtragem (10 Hz e 3 kHz). Ajuste o ganho até 10 K. incluir um monitor áudio para avaliar o padrão de rebentamento da RSNA. Use as taxas de amostragem que varia entre 2.000-10.000 Hz4,5,6,7,8. Use uma taxa de amostragem maior quando uma manipulação do CNS é a hipótese de causar rápida/breve respostas simpáticas.
7. registro de dados
- Avalie a qualidade da gravação RSNA por evocando o barorreflexo com uma injeção em bolus de 1 mL de solução salina ou 10 fenilefrina µ g/mL (em 0,1 mL) por via intravenosa. Conforme ilustrado na Figura 1, a infusão deve aumentar BP e inibir a RSNA. Um aumento na pressão arterial média de 60-80 mmHg é suficiente para sympathoinhibition renal4,13,14.
- Ajuste a posição dos eléctrodos para melhorar o sinal, se necessário. Reposicionamento é necessária se o nervo não está em contacto com os dois ganchos no eléctrodo ou se qualquer tecido, sangue ou linfa líquido está em contato com os fios.
Nota: A necessidade de reposicionamento baseia-se nas características das descargas nervo auditivas.- Se as explosões de RSNA não estão ocorrendo ciclicamente com o ciclo cardíaco e se há qualquer interferência na gravação, então cuidadosamente reposicionar o eletrodo.
- Como movimentos respiratórios também podem afetar a qualidade da gravação RSNA, melhorar o sinal movendo suavemente o eletrodo em uma posição onde os movimentos musculares não perturbem o eletrodo durante a respiração.
- Uma vez obtido um sinal claro, seguro o eletrodo RSNA no lugar retirada de óleo mineral e aplicando um gel de silicone para cobrir a conexão do nervo/eletrodo no bolso da incisão. Não mova o rato antes que o gel tem definido completamente.
- Realizar protocolos de manipulação CNS enquanto grava continuamente RSNA e pressão arterial média. Se um gerador de impulsos/microinjector é usado para manipulações de tronco cerebral, um sinal de lógica deste dispositivo pode ser introduzido em gravações RSNA/BP para documentar o timing de manipulações de CNS.
- Quando o experimento é completo, determine o nível de ruído por esmagamento do nervo proximal aos eletrodos gravação entre o gel de silicone e o músculo da coluna vertebral. Recorde de pelo menos 30 s deste valor '' zero para RSNA4,5,6. Como uma abordagem alternativa para o ruído de quantificação, administrar um bloqueador ganglionar de curta duração tais como atropina, hexametônio, chlorisondamine ou pentolinium tartarato8,15,16, 17.
- Retire o eletrodo da RSNA cuidadosamente e remover vestígios de sílica gel de eletrodos do fio. Salve o eletrodo para reutilização. Desligar o transmissor de telemetria e removê-lo, tomando cuidado para não danificar a ponta do cateter.
8. eutanásia (perfusão Transcardiac)
- Identifica os locais das manipulações do CNS, através da injeção de corantes ou fluorochromes, criando lesões eletrolíticos, ou através da detecção da expressão de c-fos.
- Se as análises do cérebro exigirá a fixação, prepare o rato para perfusão transcardiac. Avalie o reflexo de dedo-pinch para garantir que o rato permanece profundamente anestesiado. Fornece anestesia suplementar, se necessário. Execute transcardiac perfusão de fixador de paraformaldeído em uma coifa.
Atenção: Irritante de pele/olhos ávidos. - Inserir tubo da bomba de perfusão e prime com salina 0,9%.
- Fazer uma incisão lateral de 5-6cm através da pele e a parede abdominal, imediatamente abaixo da caixa torácica e abrir a cavidade torácica. Separe com cuidado o fígado do diafragma. Faça uma pequena incisão no diafragma com uma tesoura sem corte curvada. Injete 0,1 mL de heparina diretamente no ventrículo esquerdo.
- Passar uma agulha de perfusão para o ventrículo esquerdo (uma agulha de gavagem aço inoxidável funciona bem para essa etapa) ou punção-lo para o coração ou pelo corte de uma pequena incisão com uma tesoura afiada e passando a gavagem agulha através de então a ponta é visível através da parede da aorta (mas não deve atingir o arco aórtico). Use um clipe de cirúrgico ou elétrico para fixar a agulha no lugar.
- Usando uma bomba de infusão, administre salina 0,9% (temperatura ambiente). Crie imediatamente uma incisão de 2-3 mm na aurícula direita para criar uma saída para o enxágue de salina. Não corte a aorta descendente. Continue a lavagem salina até a fígado muda de cor de vermelho/marrom a amarelo pálido, uma infusão de cerca de 400 mL mais 2-3 min.
- Pare a bomba. Alternar o perfusato para o fixador (EG., 10% de formalina ou 4% paraformaldeído); infundir 400ml mais 2-3 min. remover o cérebro e armazenar a amostra em solução fixador durante a noite a 4 ° C antes de transferir o tecido para 30% de sacarose (30 mL de sacarose dissolvida em 100 mL de solução salina de tampão fosfato 0,1 M) pelo menos 3 dias ou até que o cérebro afunda , para cryoprotection antes de cryogenetic18de seccionamento.
9. analisar os dados
- Onda completa retificar a RSNA cru para obter valores absolutos. Onda completa rectificar um segmento s 10 do sinal ruído bruto. É importante excluir quaisquer estudos que foram afetados por uma baixa relação sinal-ruído. Em estudos quantificando RSNA, investigadores aplicados critérios a priori como exigindo sinal para rácios de ruído exceder 2:1 a 6:117,19,20.
- Calcule a média retificada RSNA para segmentos não-sobreposição (MV) e subtrair a estimativa do ruído (MV). Dependendo dos objectivos da experiência, os investigadores podem selecionar intervalos como 10 s (Figura 1) ou 1 s. Calculate significa usando as opções de análise de forma de onda no software fisiológico ou exportar os dados em planilhas para calcular médias para intervalos de tempo selecionado.
- Para normalizar através de diferentes animais, expressar valores para posterior análise, como a variação percentual da linha de base. Use a estatística paramétrica para realizar comparações de grupo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 ilustra a gravação RSNA e BP uma amostra de um rato de Nembutal-anestesiados. Uma injeção intravenosa de fenilefrina foi usada para induzir um aumento na pressão arterial média e evocar o barorreflexo e transiente sympathoinhibition4,6. Para quantificar o RSNA, a RSNA cru foi retificado e em média para disjunto 10 segmentos s; a estimativa de ruído foi subtraída de cada segmento.
Figura 1: RSNA e BP em resposta à injeção de fenilefrina IV. A RSNA cru (A) foi onda completa corrigida (B); rectificado esmagado "zero" RSNA é mostrado em baixo-relevo C. Calcularam-se non-sobreposição 10 s médias (menos barulho) (D). Para evocar o barorreflexo, 0,1 mL de fenilefrina (1 µ g/mL) foi injetado por via intravenosa (na seta). A infusão em bolus provocou um aumento abrupto da BP e inibição transitória da RSNA. Esta figura foi adaptada do Fink AM, Dean C, Piano senhor Cardoso DW. O tegmentum pedunculopontine controla a atividade do nervo simpático renal e atividades cardiorrespiratórias em ratos anestesiados de Nembutal. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passos críticos para medir RSNA incluem: (1) evitando o alongamento da artéria renal e nervos ao separar o rim do músculo paraspinal e quando colocar os eléctrodos de gravação do segmento do nervo, (2) cuidadosamente dissecando as fibras nervosas renais do tecido circundante/vaso, (3) garantindo que o eletrodo fios estão livres do tecido, sangue ou fluido linfático e (4), impedindo o nervo da secagem aplicando óleo mineral para o nervo renal e sílica gel para a unidade de nervo-eletrodo. Para solução de problemas, é importante assegurar que o sistema de gravação é aterrado adequadamente. Para obter um sinal claro da RSNA, a posição do eletrodo pode ser ajustada cuidadosamente enquanto visualizar e ouvir o sinal bruto RSNA, antes da incorporação em gel de sílica. Conclusão bem-sucedida da cirurgia resulta em um sinal RSNA que pode ser modulado por manipulações de CNS para os experimentos que dura várias horas.
Ao interpretar os resultados, os investigadores devem considerar a influência da anestesia na pressão arterial média e RSNA. Este protocolo usa anestesia barbitúricos (pentobarbital de sódio), que pode reduzir a pressão arterial média e modificar respostas autonômicas21. Dependendo do experimento tem como objetivo, outras formulações injetáveis ou anestesia por inalação (via nariz cone ou traqueostomia) pode ser usado22. Pesquisadores podem considerar as alternativas tais como uretano23 e alfa-chloralose24. Esses agentes tem menos impacto no embotamento reflexos cardiovasculares mas podem representar riscos de saúde potenciais para o investigador.
Além dos métodos descritos no presente protocolo, abordagens alternativas têm sido empregadas por outros laboratórios para gravação e fabricação de eletrodos. RSNA pode ser gravado usando o aço inoxidável4,9, prata25ou fio de platina26 . Além do segmento de nervo exposto para o fio eléctrodo de levantamento, os cientistas registraram com êxito monofásico que RSNA nas extremidades centrais de corta os nervos simpáticos renais26. Flexibilidade é diferente com base na resistência à tração do fio (medido com unidades kPSI). Maior kPSI fio é mais frágil, mas mantém sua forma; fio de baixo kPSI é mais flexível e menos propensos a quebrar quando dobrada, repetidamente. Para as gravações do RSNA, é importante selecionar um fio que pode ser facilmente dobrado e reposicionado durante as gravações. O fio não deve ser muito flexível, tornando-se difícil criar ganchos debaixo do nervo, mas não muito duro. O último aumenta o risco de alongamento e danificar os nervos. Nosso laboratório usa fio de aço inoxidável com 155-185 kPSI.
Muitas abordagens para a análise da RSNA estão disponíveis. Ao invés de quantificar as médias de 10 segmentos de gravação de s e calcular as diferenças como a porcentagem mudança, RSNA pode ser determinada através da quantificação explosão frequência4,26,27. Esta abordagem pode ser preferida quando o basais e magnitudes das respostas RSNA diferem entre ratos em um estudo de15,26. Outra abordagem envolve a retificação e a integração do sinal do RSNA; a amplitude da RSNA (medida em mV) é somada ao longo de um determinado intervalo de tempo (ex., 20 ms)15,26. Um integrador aplica um filtro de baixa-fase e fornece a amplitude de descarga média durante picos de atividade superior a constante de tempo (ex., > 20 s)15,,27. Integrado de sinais são úteis para examinar a amplitude e a fase da RSNA, mas esta abordagem não fornece informações sobre alterações oscilatórias. Métodos de domínio de tempo e domínio de frequência foram aplicados quando pesquisadores examinar oscilações RSNA. A abordagem frequentemente usada para RSNA é a rápida transformação Fourier (FFT), que categoriza um sinal em suas oscilações sinusoidais, cada um com uma distinta amplitude e fase20,26. FFT é uma abordagem útil para examinar as explosões de baixa e alta-frequência na RSNA e para estudar a modulação respiratória e cardíaca do sinal RSNA.
Os métodos neste protocolo são importantes para abordar hipóteses sobre o significado funcional dos núcleos de CNS. Nervos simpáticos renais direto comunicação neural entre o CNS e o rim, e portanto, as alterações agudas no RSNA representam uma variável importante na investigação cardiovascular. A definição de mecanismos CNS regulando o efluxo simpático é uma área de pesquisa prioritária, Considerando que sympathoexcitation renal contribui para a fisiopatologia e apresentação clínica de muitas doenças (ex., doença renal crônica, coração falha, arritmias, diabetes mellitus e apneia obstrutiva do sono)28,29. Medidas indiretas da atividade do nervo simpático (EG., BP, variabilidade da frequência cardíaca, níveis de catecolamina) nem sempre são adequados para os estudos sobre o significado funcional dos núcleos de CNS. Portanto, a medida direta da RSNA e pressão arterial média em ratos anestesiados representa um valioso método para funcionalmente, anatomicamente, definindo as fontes da função simpática renal aberrante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anne M. Fink é um membro do Conselho Consultivo do cliente para dados internacionais de Ciências.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de investigação de enfermagem (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
