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Neuroscience

Anesthetized चूहों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जोड़तोड़ के जवाब में गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि में तीव्र परिवर्तन को बढ़ाता है

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/58205
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biobehavioral Health Science, College of Nursing, University of Illinois at Chicago, 2Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin and Zablocki VA Medical Center

Summary

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) जोड़तोड़ करने के लिए सहानुभूति और हृदय प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए तरीके तंत्रिका विज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल को मापने और anesthetized चूहों (गैर अस्तित्व) में गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि (RSNA) में तीव्र परिवर्तन को बढ़ाता है के साथ वैज्ञानिकों की सहायता के लिए विकसित किया गया था ।

Abstract

गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि (RSNA) और मतलब धमनी दबाव हृदय और स्वायत्त अनुसंधान में महत्वपूर्ण मापदंडों रहे हैं; हालांकि, वहां सीमित संसाधनों को मापने और इन चर विश्लेषण के लिए तकनीकों में वैज्ञानिकों को निर्देशित कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल RSNA मापने के लिए तरीकों का वर्णन और anesthetized चूहों में धमनी का दबाव मतलब है । प्रोटोकॉल भी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) जोड़तोड़ के लिए RSNA रिकॉर्डिंग के दौरान मस्तिष्क तक पहुंचने के लिए दृष्टिकोण शामिल हैं । RSNA रिकॉर्डिंग तकनीक औषधीय, optogenetic, या सीएनएस के विद्युत उत्तेजना के साथ संगत है । दृष्टिकोण उपयोगी है जब एक अन्वेषक अल्पकालिक (h करने के लिए एच) स्वायत्त प्रतिक्रियाओं में गैर-अस्तित्व प्रयोगों के लिए anatomically सीएनएस नाभिक के साथ सहसंबंधित करने के लिए उपाय करेगा । दृष्टिकोण को चूहों में RSNA के जीर्ण (अस्तित्व) रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए इरादा नहीं है । RSNA में निर्वहन, औसत सुधारा RSNA, और मतलब धमनी दबाव quantified जा सकता है और आगे पैरामीट्रिक सांख्यिकीय परीक्षणों का उपयोग विश्लेषण । शिरापरक पहुंच प्राप्त करने के लिए तरीके, रिकॉर्डिंग मतलब धमनी दबाव telemetrically, और भविष्य ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए मस्तिष्क निर्धारण भी लेख में वर्णित हैं ।

Introduction

पूर्व नैदानिक हृदय प्रणाली के स्वायत्त नियंत्रण के बारे में खोजों ऐसे उच्च रक्तचाप, दिल की विफलता, और क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के रूप में विकारों के प्रबंधन के लिए रणनीतियों को सूचित । सहानुभूति तंत्रिका तंत्र और कम वागल हृदय टोन की गतिविधि पर उच्च रक्तचाप (बीपी)1के लिए योगदान । क्रोनिक ऊंचा गुर्दे सहानुभूति बहिर्वाह catecholamine स्राव को बढ़ाता है और गुर्दे की रक्त प्रवाह घटाता है, बचके परिणामों के साथ हृदय/गुर्दे सिस्टम2,3. neurobiological स्वायत्तता के लिए अग्रणी रास्ते को परिभाषित करने के लिए, कुतर में अध्ययन कैसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स सहानुभूति मापदंडों को विनियमित निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि (RSNA) और बीपी को मापने के बारे में तकनीकी जानकारी प्रदान करने के लिए और anesthetized चूहों में सीएनएस जोड़तोड़ के जवाब में तीव्र सहानुभूति परिवर्तन को बढ़ाता है के लिए तकनीक की रूपरेखा है ।

एक्यूट (गैर उत्तरजीविता) RSNA मापन (h करने के लिए स्थाई) उपयोगी होते है जब वैज्ञानिकों ने सीएनएस की जांच करेंगे, तो बिजली, या anesthetized चूहों में optogenetically विशिष्ट नाभिक के कार्यों का निर्धारण करने के लिए । इन तरीकों का उपयोग करना, इस तरह के एकांत नाभिक के रूप में संरचनाओं, periaqueductal ग्रे, pedunculopontine tegmentum, और rostral ventrolateral मज्जा सहानुभूति मानकों को विनियमित करने neurobiological रास्ते को परिभाषित करने के लिए जांच की गई है4, 5,6,7. इस दृष्टिकोण सीएनएस लक्ष्यों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण स्वायत्तता8,9के पुराने मॉडलों में आगे की जांच की है । इन प्रयोगों को पूरा करने के लिए प्रयोगशाला में एक टांका लोहे, सर्जिकल माइक्रोस्कोप, stereotaxic फ्रेम, microelectrode एम्पलीफायर, और ऑडियो मॉनिटर की आवश्यकता है । प्रयोगशाला में मौजूद कारकों पर निर्भर करता है कि विद्युत शोर में योगदान, शल्य/रिकॉर्डिंग क्षेत्र RSNA रिकॉर्डिंग में बिजली के शोर को कम करने के लिए एक फैराडे पिंजरे/ यदि मस्तिष्क विश्लेषण ऊतक निर्धारण की आवश्यकता होगी, एक छिड़काव पंप और धुएं डाकू की आवश्यकता है । डेटा डिजीटल और एकाधिक शारीरिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है/डाटा अधिग्रहण (एनालॉग डिजिटल कनवर्टर) इकाइयों4,5, विभिंन विश्लेषण विकल्प और telemetric संकेतों को शामिल करने के लिए compatibilities के साथ .

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Protocol

सभी वर्णित तरीकों शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. द्विध्रुवी RSNA इलेक्ट्रोड बनाएं

  1. इलेक्ट्रोड बनाने के लिए, प्रत्येक लगभग 18 मिमी लंबे स्टेनलेस स्टील के तार के दो टुकड़े काट. पॉलीथीन का एक टुकड़ा (पीई-५०) टयूबिंग लगभग 15 मिमी लंबी कटौती । दोनों सिरों से फैला तार छोड़ने, टयूबिंग में तार के दोनों टुकड़ों फ़ीड ।
  2. तारों के सिरों से इंसुलेशन निकालें; तारों को उजागर तार के 2-3 mm जा ट्रिम कर दीजिए । एक छोर पर, उजागर तार पर पुरुष पिंस समेटना । मिलाप पिन सुरक्षित रूप से तार करने के लिए, एक संबंधक पट्टी के अंदर पिन सुरक्षित, और epoxy के साथ संबंध को कवर.
    नोट: एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि टांका लगाने से बचने के लिए त्वरित कनेक्ट/
  3. इलेक्ट्रोड के विपरीत छोर पर, तारों के सिरों से इन्सुलेशन निकालें, उजागर तार के 2-3 मिमी जा. तारों के इस हिस्से मोड़ छोटे "वी" आकार uninsulat तार में हुक बनाने के लिए ।
    नोट: यह इलेक्ट्रोड है कि गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका के साथ संपर्क में हो जाएगा का हिस्सा है । यह इस छोर सील करने के लिए तरल पदार्थ ट्यूबिंग में प्रवेश करने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । सिलिकॉन या epoxy प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. संज्ञाहरण प्रशासन और शल्य साइटों को तैयार

  1. एक पुरुष Sprague Dawley चूहा (उंर 9-11 सप्ताह, 150-400 g वजन) को संज्ञाहरण प्रशासन । प्रशासन pentobarbital सोडियम ५० मिलीग्राम/kg एक intraperitoneal (IP) इंजेक्शन के माध्यम से । सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण के एक स्थिर विमान का आकलन करने के लिए, जरूरत के रूप में पैर की अंगुली चुटकी पलटा हर 15 मिनट और पुनः खुराक संज्ञाहरण की जाँच करें.
    नोट: Pentobarbital सोडियम (Nembutal) RSNA4,5,6के मॉडुलन के साथ हस्तक्षेप किए बिना संज्ञाहरण के एक निरंतर विमान को प्राप्त करने के लिए पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था. इस प्रोटोकॉल गैर जीवन रक्षा सर्जरी के लिए है, इसलिए कोई वसूली है/
  2. संस्थागत पशु देखभाल दिशा निर्देशों के अनुसार शल्य साइट तैयार (यानी, चूहे के पेट, पीठ, और सिर दाढ़ी; 10% povidone-आयोडीन समाधान के साथ त्वचा शुद्ध; नेत्र स्नेहक लागू होते हैं, और एक हीटिंग पैड पर चूहा जगह) । प्रयोगों के दौरान ३७ डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखें ।

3. Cannulate ऊरु नस (नसों में प्रवेश के लिए)

  1. जोड़ें हेपरिन करने के लिए ०.९% बाँझ खारा (प्राप्त करने के लिए 20 इकाइयों/ एक 22G सुई के माध्यम से heparinized खारा के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें । सुई के लिए पीई-५० टयूबिंग के 15 सेमी कनेक्ट और समाधान के साथ टयूबिंग भरें ।
  2. चूहे आद लापरवाह के साथ, वंक्षण क्षेत्र के माध्यम से एक 2 सेमी क्षैतिज चीरा बनाएँ । कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग करना, संयोजी ऊतक काटना ऊरु नस और धमनी का पर्दाफाश करने के लिए । चीरा खुला पकड़ करने के लिए, या तो एकल हुक लोचदार सर्जिकल रेशम टेप के साथ सर्जिकल क्षेत्र के लिए सुरक्षित रहता है या छोटे hemostats का उपयोग करें ।
  3. एक ९० ° कोण पर एक 22G सुई की नोक मोड़ करने के लिए एक कैथेटर प्रचार10के रूप में सेवा hemostats का प्रयोग करें ।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत जहाजों कल्पना । धीरे से नस और धमनी घुमावदार संदंश का उपयोग कर अलग । (एक बाहर और एक समीपस्थ) नस के नीचे २ १२ सेमी लंबे 5-0 रेशम सीवन प्लेस; सीवन को धमनी के नीचे उसी तरीके से लगाएं ।
    1. बाहर (नीचे) सीवन टाई करने के लिए नस बंद करना; या तो सिल्क टेप या छोटे hemostats का उपयोग कर सर्जिकल क्षेत्र के लिए इस सीवन के किनारों को सुरक्षित करें । धीरे से नस खींचा लेकिन इतना बल के साथ नहीं है कि पोत आंसू होगा । सर्जन प्रमुख हाथ को सीधा नस की स्थिति ।
  5. समीपस्थ सीवन में एक ढीला हाथ आधी गाँठ का उपयोग करने के लिए संक्षेप में नस बंद करना । नाजुक hemostatic संदंश के साथ, धीरे बंद करना रक्त प्रवाह के लिए इस टांका दबाना । गैर-प्रमुख हाथ में तुला टिप के साथ 22G सुई पकड़ो; संदंश के साथ टयूबिंग अकवार प्रमुख हाथ का उपयोग कर ।
  6. कैथेटर प्रचार (चरण ३.३) के साथ नस में एक छोटा सा छेद पंचर और पोत में पीई-५० टयूबिंग (heparinized खारा के साथ पहले से भरा) डालें; खुले जहाज में खोलने के लिए और स्थिति में मदद करने के लिए बर्तन में कैथेटर की नोक10रखने के लिए तुला सुई का प्रयोग करें ।
    1. समीपस्थ सीवन जारी है और धीरे नस में heparinized खारा के ०.२ मिलीलीटर फ्लश; कैथेटर अग्रिम । नस से रक्त वापसी की जांच करने के लिए उचित स्थान सुनिश्चित करें । समीपस्थ गांठ पूरा करें और, बाहर सीवन टाई के साथ, नस के अंदर टयूबिंग सुरक्षित ।
  7. पूरक संज्ञाहरण या दवाओं और रक्त संग्रह के लिए प्रशासन के लिए प्रयोगों के दौरान शिरापरक पहुँच का उपयोग करें । नियमित नसों में सुई लेनी और रक्त नमूने आवश्यक हो जाएगा अगर एक 3 तरह संबंधक शामिल । हानिकारक पैर की अंगुली-चुटकी पलटा अनुमापन संज्ञाहरण के लिए हर 15 मिनट की जाँच करें ।

4. मतलब धमनी दबाव निगरानी के लिए ऊरु धमनी Cannulate

  1. माइक्रोस्कोप के तहत धमनी की कल्पना । शिरापरक cannulation के लिए इस्तेमाल विधि के समान, बाहर सीवन टाई (चरण ३.४) धमनी बंद करना करने के लिए; इस सीवन के किनारों को रेशम टेप के साथ सर्जिकल क्षेत्र के लिए सुरक्षित और सर्जन के प्रमुख हाथ को सीधा धमनी की स्थिति ।
  2. धमनी का उपयोग अगर एक दबाव transducer/
    1. दबाव transducer/टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए एक ५०० मिलीलीटर ०.९% खारा बैग । खारा के साथ टयूबिंग फ्लश, सभी बुलबुले को हटाने, और एक दबाव उत्प्रेरण बैग के अंदर बैग जगह प्रणाली दबाव ।
    2. चरण ३.१ में वर्णित के रूप में, एक 22G सुई के माध्यम से heparinized खारा के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज को भरने और सुई (heparinized खारा के साथ फ्लश ट्यूबिंग) के लिए पीई-५० के 15 सेमी कनेक्ट ।
    3. समीपस्थ सीवन में एक ढीला आधी गाँठ का उपयोग करने के लिए संक्षेप में धमनी बंद करना । कैथेटर प्रचार (चरण ३.३) गैर-प्रमुख हाथ में पकड़ो; प्रमुख हाथ में पोत cannulation संदंश के साथ पीई-५० के बाहर की नोक पकड़ो । तुला 22G सुई के साथ धमनी में एक छेद पंचर और पोत में प्रवेशनी डालें ।
    4. समीपस्थ सीवन जारी, धीरे धमनी में heparinized खारा के ०.२ मिलीलीटर फ्लश और जहां तक संभव हो कैथेटर अग्रिम । धमनी रक्त वापसी के लिए जांच करने के लिए उचित स्थान सुनिश्चित करें । समीपस्थ गांठ पूरा करें और, बाहर सीवन टाई के साथ, धमनी के अंदर टयूबिंग सुरक्षित । दबाव transducer/टयूबिंग के लिए धमनी लाइन कनेक्ट ।
      नोट: टयूबिंग के बाहर भाग चूहे की hindlimb को टेप करने के लिए धमनी लाइन सुरक्षित किया जा सकता है । पोत cannulation के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण Jespersen एट अलद्वारा वर्णित है.; 11 उनके प्रोटोकॉल retractor का उपयोग करने के लिए चीरा, गोंद प्रसार के बजाय सीवन-ट्यूबिंग सुरक्षित करने के लिए अलग है, और दृष्टिकोण तुला सुई शामिल नहीं है ।
  3. धमनी का उपयोग अगर टेलीमेट्री का प्रयोग
    1. धमनी cannulation से पहले उच्च आवर्धन के तहत दबाव संवेदन कैथेटर का निरीक्षण । कैथेटर बुलबुले के मलबे से मुक्त है और तरल पदार्थ से भरा (समीपस्थ) और जेल से भरा (बाहर) घटकों के बीच एक बरकरार meniscus है कि यह सुनिश्चित करें । प्रत्येक आरोपण से पहले, कैथेटर के बाहर की नोक पर जेल फिर से भरना । एक चुंबक का उपयोग कर ट्रांसमीटर पर बारी; सर्जरी के दौरान बीपी की निगरानी करने के लिए सही स्थान सहना ।
    2. ऊरु धमनी को संक्षेप में बंद करना करने के लिए समीपस्थ सीवन में एक ढीला हाथ आधी गाँठ का प्रयोग करें । कैथेटर प्रचार (चरण ३.३) गैर-प्रमुख हाथ में पकड़ो । टेलीमेट्री इकाई के प्रवेशनी की नोक को पोत cannulation संदंश के साथ टिप से जेल की जगह से बचने के लिए पकड़ो ।
    3. तुला 22G सुई के साथ धमनी में एक छेद पंचर और प्रवेशनी पोत cannulation संदंश का उपयोग करने के लिए टिप से जेल से बचने के लिए धमनी में डालें । जहां तक संभव हो प्रवेशनी को आगे बढ़ाएं । समीपस्थ और बाहर टांका संबंधों का उपयोग कर, दबाव कैथेटर सुरक्षित ।
    4. चीरा के बगल में पार्श्व के अंदर टेलीमेट्री प्रत्यारोपण के शरीर टक, और एक काटने सुई पर 4-0 नायलॉन सीवन का उपयोग कर इस चीरा बंद करो । बैटरी जीवन के संरक्षण के लिए रिकॉर्डिंग अवधि के समापन पर चुंबक द्वारा बंद टेलीमेट्री उपकरणों बारी है ।

5. मस्तिष्क तक पहुंचने के लिए Stereotaxic सर्जरी फ्रेम में चूहे की स्थिति

  1. धीरे stereotaxic सर्जरी फ्रेम में प्रवण स्थिति में चूहे ले जाएं ।
  2. कान सलाखों के बीच चूहे की स्थिति, और लैंब्डा और bregma की ऊंचाई बराबर करने के लिए incisor बार समायोजित करें । पोजिशनिंग चूहे तनाव, वजन पर निर्भर हो सकता है, और सीएनएस लक्ष्यों के स्थानों ।
  3. एक 2 सेमी rostrocaudal खोपड़ी के midline के माध्यम से स्केलपेल चीरा बनाओ । कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग, मजबूती से खोपड़ी की सतह से संयोजी ऊतक को हटा दें । खोपड़ी के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड लागू bregma, लैंब्डा, और midline टांके visualizing में सहायता करने के लिए ।
  4. 12लक्ष्यीकरण गाइड करने के लिए चूहे मस्तिष्क के एक एटलस का उपयोग करना, एक गड़गड़ाहट छेद osteotomy ड्रिल, इलेक्ट्रोड का उपयोग के लिए आकार, खोपड़ी के माध्यम से.

6. गुर्दे सहानुभूति नसों को अलग

  1. एक 10x पूर्व एम्पलीफायर और microelectrode एम्पलीफायर के लिए तार RSNA इलेक्ट्रोड (कदम 1.1-1.3) कनेक्ट.
  2. एक retroperitoneal चीरा के माध्यम से गुर्दे की नसों को अलग करने से पहले, या उसके बाद, चूहे stereotaxic फ्रेम में सुरक्षित है । RSNA इलेक्ट्रोड की स्थिति एक बार चूहे stereotaxic फ्रेम में है । caudal दिशा में पसलियों के नीचे 4-5 सेमी से विस्तार एक स्केलपेल चीरा बनाओ, थोड़ा रीढ़ के लिए पार्श्व । कुंद काटना चीरा paraspinal मांसपेशियों की कल्पना करने के लिए ।
  3. एक बहुत ही सतही 1-2 सेमी rostrocaudal चीरा जहां वसा मांसपेशियों को मिलता है बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें । कपास की इत्तला दी applicators का प्रयोग, वसा दूर मांसपेशियों को गुर्दे की कल्पना करने के लिए फैल गया । यह पेरिटोनियल अंतरिक्ष में प्रवेश नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. गुर्दे की धमनी और उदर महाधमनी की कल्पना करने के लिए paraspinal की मांसपेशियों से गुर्दे को धीरे से अलग करने के लिए रिट्रैक्टर्स का प्रयोग करें । वाहिकाओं को अधिक से अधिक गुर्दे नसों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए खिंचाव नहीं है । चोट से गुर्दे की रक्षा के लिए खारा में लथपथ एक 2 "x 2" कपास धुंध पैड का प्रयोग करें ।
  5. उच्च आवर्धन के तहत, चीरा जेब में गुर्दे नसों की पहचान । तंत्रिका बंडलों सबसे आसानी से महाधमनी और गुर्दे की धमनी द्वारा गठित सही कोण में दिखाई दे रहे हैं । गुर्दे नसों बारीकी से गुर्दे के लिए महाधमनी से गुर्दे की धमनी का पालन करें ।
  6. तंत्रिका बंडल कि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर रखा जाएगा के एक खंड का चयन करें । धीरे सूक्ष्म विदारक चिमटी का उपयोग आसपास के ऊतकों से तंत्रिका तंतुओं काटना/
  7. एक धारक में तार RSNA इलेक्ट्रोड सुरक्षित (उदाहरणके लिए, एक मगरमच्छ एक समर्थन स्टैंड से जुड़ी क्लिप) । तंत्रिका खंड के स्तर के लिए इलेक्ट्रोड कम. धीरे तंत्रिका खींच के बिना इलेक्ट्रोड पर गुर्दे की तंत्रिका के खंड लिफ्ट करने के लिए एक तंत्रिका हुक का प्रयोग करें ।
    नोट: तंत्रिका दोनों "वी" आकार अछूता तार में हुक, तंत्रिका के समानांतर अंदर आराम करना चाहिए । इलेक्ट्रोड तारों किसी भी अन्य ऊतक, रक्त, या लसीका द्रव स्पर्श नहीं करना चाहिए.
  8. खनिज तेल के साथ चीरा सूख बनने से उजागर गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका को रोकने के लिए भरें । चीरा की त्वचा पर एक छोर और फैराडे पिंजरे से जुड़े अन्य के साथ एक जमीनी क्लिप का प्रयोग करें ।
  9. उच्च और कम पास फ़िल्टरिंग का उपयोग एम्पलीफायरों के लिए संकेत प्रत्यक्ष (10 हर्ट्ज और 3 kHz). लाभ को समायोजित 10 K. RSNA के फोड़ पैटर्न का आकलन करने के लिए एक ऑडियो मॉनिटर शामिल करें । 2000-10000 हर्ट्ज4,5,6,7,8के बीच लेकर नमूना दरों का प्रयोग करें । एक वृद्धि की नमूना दर का प्रयोग करें जब एक सीएनएस हेरफेर तेजी से/

7. रिकॉर्ड डेटा

  1. RSNA रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता का आकलन एक बोल्स इंजेक्शन के साथ baroreflex के 1 मिलीलीटर खारा या 10 µ g/एमएल phenylephrine (०.१ मिलीलीटर) नसों में । के रूप में चित्रा 1में सचित्र, अर्क बीपी बढ़ाने और RSNA रोकना चाहिए । 60-80 mmHg का मतलब धमनी दबाव में वृद्धि गुर्दे sympathoinhibition के लिए पर्याप्त है4,13,14.
  2. यदि आवश्यक हो तो संकेत में सुधार करने के लिए इलेक्ट्रोड की स्थिति को समायोजित करें । यदि तंत्रिका इलेक्ट्रोड पर दोनों हुक के साथ संपर्क में नहीं है या यदि किसी भी ऊतक, रक्त, या लसीका द्रव तारों के साथ संपर्क में है की स्थिति की आवश्यकता है ।
    नोट: स्थिति की आवश्यकता के लिए तंत्रिका फर्ज के श्रवण विशेषताओं पर आधारित है ।
    1. यदि RSNA के फटने हृदय चक्र के साथ चक्रीय नहीं होने वाली हैं, और अगर रिकॉर्डिंग में कोई हस्तक्षेप है, तो ध्यान से इलेक्ट्रोड की स्थिति ।
    2. श्वसन आंदोलनों के रूप में भी RSNA रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, धीरे से एक स्थिति है जहां मांसपेशियों आंदोलनों इलेक्ट्रोड सांस लेने के दौरान बाधित नहीं करते में इलेक्ट्रोड चलती द्वारा संकेत में सुधार.
  3. एक बार एक स्पष्ट संकेत प्राप्त किया है, जगह में खनिज तेल वापस लेने और चीरा जेब में तंत्रिका/इलेक्ट्रोड कनेक्शन को कवर करने के लिए एक सिलिका जेल लगाने के द्वारा RSNA इलेक्ट्रोड सुरक्षित । जेल को पूरी तरह से सेट करने से पहले चूहे को मूव न करें ।
  4. लगातार RSNA रिकॉर्डिंग और धमनी दबाव मतलब है, जबकि सीएनएस हेरफेर प्रोटोकॉल प्रदर्शन. एक microinjector/लैबोरेटरी brainstem जोड़तोड़ के लिए प्रयोग किया जाता है, तो इस उपकरण से एक तर्क संकेत सीएनएस जोड़तोड़ के समय दस्तावेज़ के लिए RSNA/बीपी रिकॉर्डिंग में पेश किया जा सकता है ।
  5. जब प्रयोग पूरा हो गया है, सिलिका जेल और रीढ़ की मांसपेशी के बीच रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को तंत्रिका समीपस्थ कुचल द्वारा शोर स्तर निर्धारित करते हैं । RSNA4,5,6के लिए इस "शूंय" मान के कम से 30 s रिकॉर्ड करें । शोर को बढ़ाता है के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, एक लघु अभिनय ganglionic अवरोधक जैसे atropine, hexamethonium, chlorisondamine, या pentolinium tartrate8,15,16, प्रशासन 17. शी.
  6. ध्यान से RSNA इलेक्ट्रोड को हटाने और तार इलेक्ट्रोड से सिलिका जेल के किसी भी निशान को दूर. पुनः उपयोग के लिए इलेक्ट्रोड सहेजें । टेलीमेट्री ट्रांसमीटर बंद करें और इसे दूर, देखभाल कैथेटर की नोक को नुकसान नहीं ले ।

8. इच्छामृत्यु (Transcardiac छिड़काव)

  1. रंजक या fluorochromes इंजेक्ट करके, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों को बनाने, या सी-फोस अभिव्यक्ति का पता लगाने के द्वारा सीएनएस जोड़तोड़ के स्थानों की पहचान करें ।
  2. यदि मस्तिष्क विश्लेषण निर्धारण की आवश्यकता होगी, transcardiac छिड़काव के लिए चूहे तैयार करते हैं. यह सुनिश्चित करने के लिए पाँव-चुटकी पलटा का आकलन करें कि चूहे का गहरा anesthetized रहता है. पूरक संज्ञाहरण अगर जरूरत प्रदान करते हैं । एक धुएं डाकू में paraformaldehyde निर्धारण के transcardiac छिड़काव प्रदर्शन ।
    चेतावनी: Avid त्वचा/
  3. छिड़काव पंप और ०.९% सामांय खारा के साथ प्रधानमंत्री में टयूबिंग डालें ।
  4. रिब पिंजरे के नीचे तुरंत त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से एक 5-6 सेमी पार्श्व चीरा बनाओ और छाती गुहा खुला । सावधानी से जिगर डायाफ्राम से अलग । डायाफ्राम घुमावदार कुंद कैंची का उपयोग कर में एक छोटा सा चीरा बनाओ । बाएँ निलय में सीधे हेपरिन के ०.१ मिलीलीटर सुई.
  5. बाईं निलय में एक छिड़काव सुई दर्रा (एक स्टेनलेस स्टील gavage सुई इस कदम के लिए अच्छी तरह से काम करता है) या तो यह दिल में puncturing द्वारा या तेज कैंची का उपयोग कर एक छोटा सा चीरा काटने और के माध्यम से gavage सुई गुजर रहा द्वारा तो टिप के माध्यम से दिखाई दे रहा है महाधमनी की दीवार (लेकिन करता है महाधमनी आर्क तक नहीं पहुंच चाहिए) । जगह में सुई सुरक्षित करने के लिए एक शल्य चिकित्सा या बिजली क्लिप का उपयोग करें ।
  6. एक अर्क पंप का प्रयोग, ०.९% सामांय खारा (कमरे के तापमान) प्रशासन । तुरंत सही atrium में एक 2-3 mm चीरा बनाने के लिए खारा कुल्ला के लिए एक दुकान बनाने के लिए । अवरोही महाधमनी में न काटें । जारी रखें खारा कुल्ला जब तक जिगर लाल/ब्राउन से पीला पीला, 2-3 मिनट से अधिक लगभग ४०० मिलीलीटर की एक अर्क से रंग बदलता है ।
  7. पंप बंद करो । perfusate को निर्धारण के लिए स्विच करें (उदा., 10% formalin या 4% paraformaldehyde); 2-3 मिनट से अधिक ४०० मिलीलीटर डिफ्यूज । मस्तिष्क को हटायें और एक दिन में नमूने की दुकान 4 ° c पर रातोंरात हल करने के लिए ऊतक स्थानांतरित करने से पहले 30% सुक्रोज (सुक्रोज की १०० मिलीलीटर में भंग ०.१ मीटर फॉस्फेट-बफर खारा) के लिए कम से 3 दिनों के लिए या जब तक मस्तिष्क डूब , cryoprotection के लिए cryogenetic से पहले18।

9. डेटा का विश्लेषण करें

  1. पूर्ण लहर कच्चे RSNA निरपेक्ष मूल्यों को प्राप्त करने के लिए सुधार । पूर्ण लहर एक 10 एस कच्चे शोर संकेत के खंड को सुधारने । यह किसी भी अध्ययन है कि एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात से प्रभावित थे बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है । RSNA को बढ़ाता अध्ययन में, जांचकर्ताओं के लिए 6:117,19,20से अधिक करने के लिए शोर अनुपात के लिए संकेत की आवश्यकता के रूप में एक प्राथमिकताओं मानदंड लागू किया ।
  2. गैर-ओवरलैपिंग सेगमेंट (µV) के लिए माध्य सुधारा RSNA परिकलित करें और नॉइज़ अनुमान (µV) घटाना. प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, जांचकर्ताओं के अंतराल जैसे 10 s (चित्रा 1) या 1 एस का चयन कर सकते हैं । शारीरिक सॉफ्टवेयर में तरंग विश्लेषण विकल्प का उपयोग कर या के लिए औसत की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात द्वारा अर्थ की गणना चयनित समय अंतराल ।
  3. विभिन्न जानवरों के पार सामान्य करने के लिए, आधारभूत से प्रतिशत परिवर्तन के रूप में आगे विश्लेषण के लिए एक्सप्रेस मान. समूह तुलना संचालित करने के लिए पैरामीट्रिक आँकड़ों का उपयोग करें.

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Representative Results

चित्रा 1 एक Nembutal-anesthetized चूहा से एक नमूना RSNA और बीपी रिकॉर्डिंग दिखाता है । phenylephrine के एक नसों में इंजेक्शन का मतलब है धमनी दबाव में वृद्धि पैदा करने के लिए और baroreflex और क्षणिक sympathoinhibition4,6पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । RSNA यों तो, कच्चे RSNA सुधारा और गैर अतिव्यापी 10 एस क्षेत्रों के लिए औसत था; शोर का अनुमान प्रत्येक सेगमेंट से घटाया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: phenylephrine इंजेक्शन IV के जवाब में RSNA और बीपी । कच्चा RSNA (क) भरा हुआ था-तरंग सुधारा (ख); सुधारा क्रश्ड "जीरो" RSNA इनसेट सीमें दिखाया गया है । गैर-ओवरलैपिंग 10 s औसत (ऋण शोर) की गणना की गई (D). baroreflex पैदा करने के लिए, phenylephrine (1 µ g/एमएल) की ०.१ मिलीलीटर नसों में इंजेक्ट किया गया था (तीर पर) । बोल्स अर्क बीपी और RSNA के क्षणिक अवरोध में अचानक वृद्धि हुई । यह आंकड़ा फिंक, डीन सी, पियानो श्री, Carley DW से अनुकूलित किया गया था । pedunculopontine tegmentum गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि और Nembutal-anesthetized चूहों में cardiorespiratory गतिविधियों को नियंत्रित करता है । PLoS एक. २०१७; 12 (11): e01879564. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

RSNA को मापने के लिए महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: (1) गुर्दे की धमनी और नसों की खींच से बचने जब paraspinal मांसपेशी से गुर्दे को अलग करने और जब रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड पर तंत्रिका खंड रखने, (2) सावधानी से गुर्दे तंत्रिका तंतुओं विदारक आसपास के ऊतकों/पोत से, (3) इलेक्ट्रोड तारों ऊतक, रक्त, या लसीका द्रव से मुक्त हैं कि यह सुनिश्चित करने, और (4) तंत्रिका-इलेक्ट्रोड इकाई के लिए गुर्दे तंत्रिका और सिलिका जेल के लिए खनिज तेल लगाने से बाहर सुखाने से तंत्रिका को रोकने. समस्या निवारण के लिए यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि रिकॉर्डिंग प्रणाली पर्याप्त रूप से जमीनी है । एक स्पष्ट RSNA संकेत प्राप्त करने के लिए, इलेक्ट्रोड की स्थिति ध्यान से जबकि visualizing और कच्चे RSNA संकेत सुन, सिलिका जेल में embedding करने से पहले समायोजित किया जा सकता है । कई घंटे तक चलने वाले प्रयोगों के लिए सीएनएस जोड़तोड़ द्वारा संग्राहक जा सकता है कि एक RSNA संकेत में सर्जरी के परिणाम के सफल समापन ।

जब परिणामों की व्याख्या, जांचकर्ताओं मतलब धमनी दबाव और RSNA पर संज्ञाहरण के प्रभाव पर विचार करना चाहिए । इस प्रोटोकॉल barbiturate संज्ञाहरण (pentobarbital सोडियम) है, जो मतलब है धमनी दबाव को कम करने और स्वायत्त प्रतिक्रियाओं को संशोधित कर सकते है21का उपयोग करता है । प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है, अंय इंजेक्शन योगों या साँस लेना संज्ञाहरण (नाक शंकु या tracheostomy के माध्यम से)22इस्तेमाल किया जा सकता है । शोधकर्ताओं urethane23 और अल्फा-chloralose24जैसे विकल्पों पर विचार कर सकते हैं । इन एजेंटों हृदय सजगता कुंद पर कम प्रभाव पड़ता है, लेकिन जांचकर्ता के लिए संभावित स्वास्थ्य खतरों पैदा कर सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों के अलावा, वैकल्पिक तरीकों रिकॉर्डिंग और निर्माण इलेक्ट्रोड के लिए अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा नियोजित किया गया है. RSNA स्टेनलेस स्टील4,9, सिल्वर25, या प्लैटिनम26 वायर का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है । इलेक्ट्रोड तार पर उजागर तंत्रिका खंड उठाने के अलावा, वैज्ञानिकों ने सफलतापूर्वक काट गुर्दे सहानुभूति नसों के केंद्रीय सिरों पर monophasic RSNA दर्ज की गई26. लचीलापन तार की तंयता ताकत के आधार पर अलग है (kPSI इकाइयों के साथ मापा) । उच्च kPSI तार अधिक भंगुर है, लेकिन अपने आकार बरकरार रखती है; कम kPSI तार और अधिक लचीला है और कम करने के लिए जब तुला, दोहराव से तोड़ने की संभावना है । RSNA रिकॉर्डिंग के लिए, यह एक तार है कि आसानी से आमादा किया जा सकता है और रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिति का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । तार भी लचीला नहीं होना चाहिए, यह मुश्किल बनाने के लिए तंत्रिका के तहत स्थिति को हुक, लेकिन बहुत कड़ा नहीं है । बाद में खिंचाव और नसों को नुकसान पहुंचाने का खतरा बढ़ जाता है । हमारी प्रयोगशाला 155-185 kPSI के साथ स्टेनलेस स्टील वायर का उपयोग करता है ।

RSNA विश्लेषण के लिए कई दृष्टिकोण उपलब्ध हैं । बल्कि 10 एस रिकॉर्डिंग क्षेत्रों के लिए औसत को बढ़ाता है और प्रतिशत परिवर्तन के रूप में मतभेदों की गणना से, RSNA फट आवृत्ति4,26,27को बढ़ाता द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण पसंद किया जा सकता है जब आधारभूत स्तर और RSNA प्रतिक्रियाओं का परिमाण एक अध्ययन में चूहों के बीच अलग15,26। एक अंय दृष्टिकोण सुधार और RSNA संकेत के एकीकरण शामिल है; RSNA आयाम (एमवी में मापा) समय का एक चयनित अंतराल पर अभिव्यक्त किया है (जैसे, 20 ms)15,26. एक घालमेल एक कम चरण फिल्टर लागू होता है और समय स्थिर (जैसे, > 20 एस)15,27से अधिक गतिविधि के फटने के दौरान औसत निर्वहन आयाम प्रदान करता है । एकीकृत संकेतों आयाम और RSNA के चरण की जांच के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन इस दृष्टिकोण थरथरानवाला परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है. जब शोधकर्ताओं RSNA दोलनों की जांच आवृत्ति डोमेन और समय डोमेन विधियों लागू किया गया है । RSNA के लिए अक्सर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण तेजी से रूपान्तर रूपांतरण (FFT) है, जो अपनी sinusoidal दोलनों, एक अलग आयाम और20चरण,26के साथ प्रत्येक में एक संकेत वर्गीकृत है । FFT RSNA में कम और उच्च आवृत्ति फटने की जांच के लिए और RSNA संकेत के श्वसन और हृदय मॉडुलन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है ।

इस प्रोटोकॉल में तरीकों सीएनएस नाभिक के कार्यात्मक महत्व के बारे में परिकल्पनाओं को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । गुर्दे सहानुभूति तंत्रिकाओं सीएनएस और गुर्दे के बीच प्रत्यक्ष तंत्रिका संचार, और इसलिए, RSNA में तीव्र परिवर्तन हृदय अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण चर का प्रतिनिधित्व करते हैं । सहानुभूति बहिर्वाह विनियमित सीएनएस तंत्र परिभाषित एक प्राथमिकता अनुसंधान क्षेत्र है, कि गुर्दे sympathoexcitation pathophysiology और कई रोगों के नैदानिक प्रस्तुति के लिए योगदान पर विचार (जैसे, क्रोनिक गुर्दे की बीमारी, दिल विफलता, अतालता, मधुमेह, और प्रतिरोधी स्लीप एपनिया)28,29. सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि के अप्रत्यक्ष उपाय (जैसे, बीपी, हृदय की दर परिवर्तनशीलता, catecholamine स्तर) सीएनएस नाभिक के कार्यात्मक महत्व पर अध्ययन के लिए हमेशा उपयुक्त नहीं हैं । इसलिए, RSNA के प्रत्यक्ष माप और मतलब anesthetized चूहों में धमनी दबाव कार्यात्मक, anatomically ंयायपालिका गुर्दे सहानुभूति समारोह के सूत्रों को परिभाषित करने के लिए एक मूल्यवान विधि का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Disclosures

ऐनी एम फिंक डेटा विज्ञान इंटरनेशनल के लिए ग्राहक सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल इंस्टिट्यूट फॉर नर्सिंग रिसर्च (K99/R00NR014369) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel wire A-M Systems; Sequim, WA 791000 RSNA electrode
Polyethylene (PE-50) tubing VWR; Radnor, PA 63019-048 RSNA electrode; vessel cannulation
Miniature pin connector A-M Systems; Sequim, WA 520200 RSNA electrode
Crimping tool Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL M22520 RSNA electrode
Connector strip Amphenol; Clinton Township, MI 221-2653 RSNA electrode
J-B Kwik Epoxy J-B Weld, Sulphur Springs, TX 8270 RSNA electrode
Silicone Permatex; Hartford, CT 2222 RSNA electrode
Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) KV Veterinary Supply; David City, NE P03466 Venous line patency
Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) ACE Surgical Supply; Brockton, MA 950-6312 Testing renal sympathoinhibition
Single-hook elastic surgical stays Harvard Apparatus; Holliston, MA 72-2595 Incision
Silk surgical tape 3M, Minneapolis, MN 1538-0 Secure surgical stays
Needles, 20 G Sigma-Aldrich; St. Louis, MO Z192554-100EA Vessel cannulation
Dumont #7 curved forceps Fine Science Tools; Foster City, CA 11274-20 Vessel cannulation
5-0 silk suture ties Braintree Scientific; Braintree, MA SUT-S 106 Vessel cannulation
Delicate hemostatic forceps Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD RS-7117 Vessel cannulation and RSNA surgery
Crile Hemostatic forceps Fine Science Tools; Foster City, CA 13004-14 Needle bending
Telemetry transmitter Data Sciences International; Minneapolis, MN PA-10 Mean arterial pressure monitoring (telemetry)
Re-gel syringe Data Sciences International; Minneapolis, MN 276-0038-001 Transmitter reuse (telemetry)
Disposable pressure transducer Transpac; San Clemente, CA MI-1224 Mean arterial pressure monitoring
Clear-Cuff pressure infuser MILA International Inc.; Florence, KY 2281339 Mean arterial pressure monitoring
Vessel cannulation forceps Fine Science Tools; Foster City, CA 00574-11 Catheter insertion
Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA S661GX Secure telemetry transmitter
Telemetry receiver Data Sciences International; Minneapolis, MN RPC-1 Mean arterial pressure monitoring (telemetry)
LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) AD Instruments; Colorado Springs, CO ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) 3 options for software/acquisition hardware
SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) DataWave Technologies, Loveland, CO N/A
Spike 2 (software), Micro1401-3 Cambridge Electronic Design Ltd., London UK 1401-3
Micro-drill Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD RS-6300 CNS surgery
Stereotaxic surgery frame Stoelting; Wood Dale, IL 51600 CNS surgery
Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier A-M Systems; Sequim, WA 1800-2 RSNA recording
Retractors Fine Science Tools; Foster City, CA 17009-07 RSNA surgery
Micro-dissecting tweezers Fine Science Tools; Foster City, CA 11251-10 RSNA surgery
Micro-hook Fine Science Tools; Foster City, CA 10064-14 RSNA surgery
Mineral oil Fisher Scientific; Waltham, MA 8042-47-5 RSNA surgery
Audio monitor A-M Systems; Sequim, WA 3300 RSNA surgery
Silica gel Wacker, Munchen; Germany RT601A-B RSNA surgery
Electrical clips Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland EB0283-000 Grounding or securing perfusion needle
Bonn scissors, straight/sharp points Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD RS-5840 Perfusion
Gavage needle Harvard Apparatus; Holliston, MA 75-0286 Perfusion
Masterflex perfusion pump Cole-Parmer; Vernon Hills, IL 7524-10 Perfusion
Masterflex platinum-cured silicone tubing Cole-Parmer; Vernon Hills, IL 96410-15 Perfusion
Formalin (10% buffered solution; 4 L) Sigma-Aldrich; St. Louis, MO HT501128 Perfusion
Sucrose Sigma-Aldrich; St. Louis, MO S0389 Cryoprotection

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References

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Fink, A. M., Dean, C. Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats. J. Vis. Exp. (139), e58205, doi:10.3791/58205 (2018).

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