Summary
Metoder för mätning av sympatiska och kardiovaskulära Svaren till centrala nervsystemet (CNS) manipulationer är viktiga för att främja neurovetenskap. Detta protokoll har utvecklats för att hjälpa forskare med att mäta och kvantifiera akuta förändringar i renal sympatisk nervaktivitet (RSNA) hos sövda råttor (icke-överlevnad).
Abstract
Nedsatt sympatisk nervaktivitet (RSNA) och genomsnittliga arteriella trycket är viktiga parametrar i hjärt- och autonoma forskning; Det finns dock begränsade resurser rikta forskare i tekniker för att mäta och analysera dessa variabler. Det här protokollet beskriver metoder för att mäta RSNA och genomsnittliga arteriella trycket hos sövda råttor. Protokollet innehåller också metoderna för åtkomst till hjärnan under RSNA inspelningar för centrala nervsystemet (CNS) manipulationer. RSNA inspelning tekniken är kompatibel med farmakologiska, optogenetic, eller elektrisk stimulering av centrala nervsystemet. Metoden är användbar när en utredare kommer att mäta kortsiktiga (min till h) autonoma svaren i icke-survival experiment att korrelera anatomiskt med CNS atomkärnor. Metoden är inte avsett att användas för att få kronisk (överlevnad) inspelningar av RSNA hos råttor. Utsläpp i RSNA, i genomsnitt rättas RSNA och genomsnittliga arteriella trycket kan kvantifieras och analyseras ytterligare med parametriska statistiska tester. Metoder för att få venös access, inspelning genomsnittliga arteriella trycket telemetrically och hjärnan fixering för framtida histologisk analys beskrivs också i artikeln.
Introduction
Prekliniska upptäckter om autonom kontroll av det kardiovaskulära systemet informera strategier för att hantera störningar såsom hypertoni, hjärtsvikt och kronisk njursjukdom. Överaktivitet av sympatiska nervsystemet och minskad vagala hjärt tonen bidra till förhöjt blodtryck (BP)1. Kroniskt förhöjda nedsatt sympatiska utflöde förbättrar katekolamin sekretion och minskar renalt blodflöde, med skadliga konsekvenser för hjärt-/ njurarna2,3. För att definiera den neurobiologiska vägar som leder till autonom dysfunktion, är studier på gnagare viktiga för att fastställa hur centrala nervsystemet (CNS) nervceller reglera sympatiska parametrar. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla teknisk information om att mäta njurfunktion sympatisk nervaktivitet (RSNA) och BP och att beskriva teknikerna för att kvantifiera akut sympatiska förändringar i svar till CNS manipulationer hos sövda råttor.
Akut (icke-överlevnad) RSNA mätningar (varaktig min h) är användbara när forskare kommer probe CNS farmakologiskt, elektriskt, eller optogenetically i sövda råttor att bestämma specifika kärnor funktioner. Med dessa metoder, strukturer såsom ensam kärnan, periaqueductal gray, har pedunculopontine tegmentum, och rostralt ventrolaterala medulla undersökts för att definiera neurobiologiska vägar reglera sympatiska parametrar4, 5,6,7. Denna strategi är viktig för att identifiera CNS mål att undersökas ytterligare i kronisk modeller av autonom dysfunktion8,9. För att slutföra dessa experiment, kräver laboratoriet en lödkolv, kirurgiska Mikroskop, stereotaxic ram, mikroelektrod förstärkare och ljud monitor. Beroende på vilka faktorer i laboratoriet som bidrar till elektriska störningar, kan området kirurgiska/inspelning kräva en Faradays bur/jordning rem att minska elektriskt brus i RSNA inspelningen. Om hjärnan analyser kommer att kräva vävnad fixering, krävs en perfusion pump och rök huva. Data kan digitaliseras och registreras med flera fysiologiska data programvara/förvärv (analog-digital converter) enheter4,5, med olika analysalternativ och kompatibla för att införliva telemetriska signaler .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder beskrivs godkändes av den institutionella djur eftervård kommittén vid University of Illinois at Chicago.
1. skapa bipolär RSNA elektroder
- För att skapa elektroden, skär två bitar av tråd av rostfritt stål varje ca 18 mm långa. Skär en bit av polyeten (PE-50) slang ca 15 mm lång. Foder båda bitar av tråd in slangen, lämnar tråden sticker ut från båda ändar.
- Ta bort isoleringen från ändarna på kablarna; trimma ledningarna lämnar 2-3 mm av exponerade tråd. I ena änden, crimp hane pins över exponerade kabeln. Löda stiften ordentligt till tråd, säkra stiften inuti en anslutningsremsa och täcker anslutningen med epoxi.
Obs: Ett alternativt tillvägagångssätt som undviker lödning är att använda Anslut/snabbkoppling alligator klipp. - På den motsatta änden av elektroden, ta bort isoleringen från ändarna av ledningarna, lämnar 2-3 mm av exponerade tråd. Böja denna del av kablarna till skapa små ”V” formade krokar i den oisolerade tråden.
Obs: Detta är del av elektroden som kommer i kontakt med nedsatt sympatiska nerven. Det är viktigt att täta detta ändamål så att vätskor in slangen. Silikon eller epoxi kan effektivt användas.
2. administrera anestesi och förbereda kirurgiska platser
- Administrera anestesi till en mansperson Sprague Dawley råtta (ålder 9-11 veckor, väger 150-400 g). Administrera pentobarbital natrium 50 mg/kg via en intraperitoneal (IP) injektion. För att bedöma ett stabilt plan av anestesi under operation, kontrollera tå-nypa reflex varje 15 min och åter dos anestesi som behövs.
Obs: Pentobarbital natrium (Nembutal) användes i tidigare studier för att uppnå en hållbar planet av anestesi utan att störa moduleringen av RSNA4,5,6. Detta protokoll är för icke-survival kirurgi, så det finns ingen återhämtning/post-operative övervakningsperioden. - Förbereda den kirurgiska platsen enligt institutionella djurvård riktlinjer (dvs., raka råttans mage, rygg och huvud, rengöra huden med 10% povidon-jodlösning; tillämpa öga smörjmedel; och placera råtta på en värmedyna). Upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° C under experimenten.
3. cannulate Femoral ven (för intravenös åtkomst)
- Lägga till heparin 0.9% steril koksaltlösning (för att uppnå 20 enheter/mL). Fyll en 1 mL spruta med den hepariniserad saltlösning genom en 22G nål. Anslut 15 cm av PE-50 slangar till nål och fyll slangen med lösningen.
- Skapa en 2 cm horisontella snitt genom inguinal området med råtta ligga på rygg. Använda bomull spets applikatorer, dissekera bindväv för att exponera den femoral ven och artär. För att hålla snittet öppen, applicera antingen enkelkrok elastisk kirurgiska vistelser säkrade till operationsområdet med siden band eller använder små Peanger.
- Använd Peanger för att böja en 22G nålspetsen i 90° vinkel att fungera som en kateter introduktören10.
- Visualisera fartyg under mikroskopet. Försiktigt separera ven och artär med böjd pincett. Plats två 12 cm långa 5-0 silk sutur under venen (en distala och proximala); Placera suturen på samma sätt under artären.
- Knyta suturen distala (nederst) för att absorbera ven; säkra kanterna på detta sutur till operationsområdet med siden band eller små Peanger. Försiktigt dra venen spänd men inte med så mycket kraft att fartyget kommer att riva. Placera ven som är vinkelrät mot kirurgens dominerande hand.
- Använda en lös overhand halv Knut i proximala suturen att kort Täpp venen. Med känsliga hemostatiska pincett, försiktigt klämma denna sutur för att absorbera blodflödet. Håll 22G nålen med böjd spets i den icke-dominanta handen; Lås slangen med pincett med den dominerande handen.
- Punktera ett litet hål i venen med den kateter introduktören (steg 3.3) och infoga PE-50 slangen (förfylld med hepariniserad saltlösning) i fartyget. Använd den böjd nål att hålla öppningen i fartyget öppna och bistå i positionering av katetern i fartyget10.
- Frigöra proximala suturen och spola försiktigt 0,2 mL hepariniserad saltlösning in i venen; fram katetern. Kontrollera blod avkastningen från venen att säkerställa korrekt placering. Slutföra den proximala knuten och, med distala suturen slips, säkra slangen inuti venen.
- Använda venös access under experimenten för att administrera kompletterande anestesi eller mediciner och för blodinsamling av. Införliva en 3-vägs kontakt om regelbunden intravenösa infusioner och blodprovstagning blir nödvändigt. Kontrollera skadliga tå-nypa reflex varje 15 min titrera anestesi.
4. hål femoralartären för genomsnittlig artärtryck övervakning
- Visualisera artären under mikroskopet. Liknar metoden som används för venös kanylering, knyt distala suturen (steg 3,4) till Täpp artär; säkra kanterna på detta sutur till operationsområdet med siden band och placera artären som är vinkelrät mot kirurgens dominerande hand.
- Arteriell tillgång om du använder tryck givare/infusion
- Anslut tryck givare/slangen till en 500 mL 0,9% saltlösning väska. Spola slangen med koksaltlösning, avlägsna alla luftbubblor, och placera väskan inuti en trycket inducerare väska att trycksätta systemet.
- Som beskrivs i steg 3.1, fylla en 1 mL spruta med den hepariniserad saltlösning genom en 22G nål och ansluta 15 cm PE-50 till nålen (spola slangar med hepariniserad saltlösning).
- Använda en lös halv Knut i proximala suturen att kort Täpp artären. Håll den kateter introduktören (steg 3.3) i den icke-dominanta handen; Håll den distala spetsen av PE-50 med fartyget kanylering tången i dominerande handen. Punktera ett hål i artären med böjd 22G nålen och för in kanylen i fartyget.
- Släpp den proximala suturen, försiktigt spola 0,2 mL hepariniserad koksaltlösning i artär och advance katetern så långt som möjligt. Kontrollera om arteriellt blod tillbaka till säkerställa lämplig placering. Slutföra den proximala knuten och, med distala suturen slips, säkra slangen inuti artär. Anslut den arteriella linjen till trycket givaren/slangen.
Obs: Den distala delen av slangen kan tejpas till råttans bakbenet att säkra den arteriella linjen. En alternativ strategi för fartyget kanylering beskrivs av Jespersen et al.; 11 sina protokoll skiljer sig genom att använda upprullningsdon för att sprida snittet, lim-snarare än sutur-att säkra slangen, och metoden omfattar inte den böjda nål introduktören.
- Arteriell tillgång om använder telemetri
- Inspektera tryck avkänning katetern i hög förstoring innan arteriell kanylering. Kontrollera att katetern är bubblor/smuts och har en intakt menisk mellan den vätskefyllda (proximala) och gel-fylld (distala) komponenter. Före varje implantation, fylla på gelen på katetern distala spets. Slå på sändaren använder en magnet; övervaka BP under operationen att uthärda perfekt placering.
- Använda en lös overhand halv Knut i proximala suturen att kort Täpp femoralartären. Håll den kateter introduktören (steg 3.3) i den icke-dominanta handen. Håll spetsen av kanylen av telemetri enheten med fartyget kanylering pincett att undvika undantränger gel från spets.
- Punktera ett hål i artären med böjd 22G nålen och sätt in kanylen i artären med fartyget kanylering pincett för att undvika undantränger gel från spets. Förväg kanylen så långt som möjligt. Använder de proximala och distala suturen band, säkra trycket katetern.
- Stoppa kroppen av telemetri implantat inuti flanken intill snittet och Stäng detta snitt med 4-0 nylon sutur på en skärande nål. Inaktivera telemetri enheterna genom magnet vid slutet av perioden inspelning att spara på batteriet.
5. Placera råtta i ramen Stereotaxic kirurgi tillgång till hjärnan
- Flytta försiktigt råtta in i liggande läge i ramen stereotaxic kirurgi.
- Placera råtta mellan örat barer och justera framtand baren för att utjämna höjden av lambda och bregma. Placering kan bero på råtta stam, vikt och platser av CNS mål.
- Gör en 2 cm rostrocaudal skalpell snitt genom mittlinjen i hårbotten. Använda bomull spets applikatorer, bestämt att ta bort bindväv från skallen ytan. Gälla skallen att hjälpa att visualisera de bregma, lambda och mittlinjen suturer väteperoxid.
- Med hjälp av en kartbok av råtthjärna att vägleda inriktning12, borra ett burr hål osteotomi, dimensionerad för elektrod åtkomst, genom skallen.
6. isolera nedsatt sympatiska nerver
- Anslut RSNA tråden (steg 1.1-1.3) till en 10 X förförstärkare och mikroelektrod förstärkare.
- Isolera nedsatt nerverna genom en retroperitoneal snitt före eller efter, råtta är säkrad i ramen stereotaxic. Placera elektroderna RSNA När råttan är i ramen stereotaxic. Göra en skalpell snitt som sträcker sig från 4-5 cm nedanför revbenen i kaudala riktning, något laterala till ryggraden. Blunt dissekera snittet att visualisera paraspinal musklerna.
- Använda sax för att göra en mycket ytlig 1-2 cm rostrocaudal snitt där fettet möter muskeln. Använda bomull spets applikatorer, sprids fettet från muskeln att visualisera njuren. Det är viktigt att inte ange peritoneal utrymme.
- Använd upprullningsdon försiktigt separera njuren från paraspinal musklerna att visualisera Njurartären och bukaorta. Stretcha inte fartygen överdrivet för att undvika att skada nedsatt nerverna. Använda en 2 ”x 2” gasväv bomullstuss indränkt i saltlösning för att skydda njuren från skada.
- I hög förstoring, identifiera nedsatt nerverna i snitt fickan. Nerv buntarna är mest lätt synliga i rätt vinkel bildas av aorta och nedsatt artär. Nedsatt nerverna följa noga Tumblety från aorta till njurarna.
- Välj ett segment av nerv bunt som kommer att placeras på inspelning elektroden. Försiktigt dissekera nervfibrerna från omgivande vävnad/fartyget med hjälp av mikro-dissekera pincett.
- Säkra RSNA tråden i en hållare (t.ex., en krokodilklämman kopplade till stöd ställning). Lägre elektroden till nivån för segmentet nerv. Använd en nerv krok att försiktigt lyfta segmentet av nedsatt nerv på elektroden utan stretching nerven.
Obs: Nerven bör vila inne båda ”V” formade krokar i oisolerade tråd, parallell till nerv. Elektroden kablarna får inte röra någon annan vävnad, blod eller lymfa vätska. - Fyll snitt med mineralolja att förhindra den exponerade nedsatt sympatiska nerven blir torr. Använda ett jordning klipp med ena änden på huden på snittet och den andra knuten till Faraday bur.
- Rikta signalen till förstärkarna med hög - och låg-pass filtrera (10 Hz och 3 kHz). Justera känsligheten upp till 10 K. inkludera en audio monitor att bedöma sprängtryck mönstret av RSNA. Använd samplingsfrekvenser mellan 2 000-10 000 Hz4,5,6,7,8. Använd en ökad samplingsfrekvens när en CNS-manipulation är hypotesen för att orsaka snabb och kort sympatiska svar.
7. registrera Data
- Bedöma kvaliteten på RSNA inspelningen genom att frammana baroreflex en bolus injektion med 1 mL koksaltlösning eller 10 µg/mL fenylefrin (i 0,1 mL) intravenöst. Som illustreras i figur 1, öka BP infusionen och hämmar RSNA. En ökning av genomsnittligt arteriellt tryck på 60-80 mmHg räcker för nedsatt sympathoinhibition4,13,14.
- Justera positionen för elektroderna att förbättra signalen vid behov. Ompositionering krävs om nerven inte är i kontakt med båda hakarna på elektroden eller om någon vävnad, blod eller lymfa vätska är i kontakt med trådarna.
Obs: Behovet av ompositionering är baserad på auditiva egenskaperna hos nerv utsläppen.- Om utbrott av RSNA inte inträffar cykliskt med hjärt cykel, och om det finns störningar i inspelningen, sedan försiktigt flytta elektroden.
- Som respiratoriska rörelser kan också påverka kvaliteten på RSNA inspelningen, förbättra signalen genom att försiktigt flytta elektroden in i en position där muskelrörelserna inte stör elektroden vid andning.
- När en tydlig signal erhålls, säkra RSNA elektroden på plats genom att återkalla mineralolja och tillämpa en kiselgel för att täcka nerv/elektrod anslutningen i snitt fickan. Flytta inte råttan innan gelen har satt helt.
- Utföra CNS protokoll manipulation under kontinuerligt inspelning RSNA och menar artärtryck. Om en microinjector/pulser används för hjärnstammen manipulationer, kan en logik signal från denna enhet införas i RSNA/BP inspelningarna att dokumentera timingen av CNS manipulationer.
- När experimentet är klar, bestämma ljudnivån genom att krossa den proximala inspelning elektroderna mellan kiselgel och spinal muskel nerven. Post på minst 30 s ”noll” värdet för RSNA4,5,6. Som ett alternativ för kvantifiera buller, administrera en kortverkande ganglieblockerande blockerare såsom atropin, hexamethonium, chlorisondamine eller pentolinium tartrat8,15,16, 17.
- Försiktigt bort RSNA elektroden och avlägsna eventuella spår av kiselgel från trådelektroder. Spara elektroden för återanvändning. Inaktivera telemetri sändaren och ta bort den, utan för att skada spetsen av katetern.
8. dödshjälp (Transcardiac Perfusion)
- Identifiera platser av CNS manipulationer genom att injicera färgämnen eller fluorokromer, skapa elektrolytisk lesioner, eller genom att upptäcka c-fos uttryck.
- Om hjärnan analyser kommer att kräva fixering, förbereda råtta för transcardiac perfusion. Bedöma den tå-nypa reflexen så att råttan förblir djupt sövda. Ge kompletterande bedövning om det behövs. Utföra transcardiac genomblödning av PARAFORMALDEHYD fixativ i dragskåp.
FÖRSIKTIGHET: Ivrig hud/ögon irriterande. - Sätt in slangen i perfusion pumpen och prime med 0,9% fysiologisk koksaltlösning.
- Gör en 5-6 cm laterala snitt genom huden och bukväggen omedelbart under revbenen och öppna brösthålan. Försiktigt separera levern från membranet. Göra ett litet snitt i membranen med böjd trubbig sax. Injicera 0,1 mL heparin direkt i vänster kammare.
- Passera en perfusion nål in i vänster kammare (en nål av rostfritt stål sondmatning fungerar bra för detta steg) genom att antingen punktera det in i hjärtat eller genom att skära ett litet snitt med vass sax och passerar sondmatning nål genom så spetsen syns genom den vägg av aorta (men bör inte nå aortabågen). Använd ett kirurgiskt eller elektriska klipp för att säkra nålen på plats.
- Med en infusionspump, administrera 0,9% fysiologisk koksaltlösning (rumstemperatur). Omedelbart skapa en 2-3 mm snitt i höger förmak att skapa ett utlopp för saltlösning sköljningen. Skär inte fallande aorta. Fortsätta den saltlösning skölj tills leverförändringar färgen från rödbrun till blekgul, en infusion av ca 400 mL under 2-3 min.
- Stoppa pumpen. Växla i perfusatet till fixeringsvätskan (t.ex., 10% formalin eller 4% PARAFORMALDEHYD); ingjuta 400 mL över 2-3 min. ta bort hjärnan och förvara preparatet i fixativ lösning över natten vid 4 ° C innan du överför vävnaden till 30% sackaros (30 mL sackaros löses i 100 mL 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning) i minst 3 dagar eller tills hjärnan sjunker , för cryoprotection innan cryogenetic snittning18.
9. analysera Data
- Full-wave rätta den råa RSNA att få absoluta värden. Full-wave rätta ett 10 s segment av den råa brussignalen. Det är viktigt att utesluta några studier som påverkades av en låg signal-brus-förhållande. I studier kvantifiera RSNA, utredare tillämpas en priori kriterier såsom som kräver signal till brus förhållande att överstiga 2:1 till 6:117,19,20.
- Beräkna medelvärdet rättas RSNA för icke-överlappande segment (µV) och subtrahera buller uppskattningen (µV). Beroende på syftet med försöket, utredare kan välja intervall t ex 10 s (figur 1) eller 1 s. beräkna innebär genom att använda vågform analysalternativ i fysiologiska programvaran eller exportera data till kalkylblad att beräkna medelvärden för valda tidsintervall.
- För att normalisera över olika djur, uttrycka värden för ytterligare analys som procentuella förändringen från baseline. Använda parametrisk statistik för att genomföra grupp jämförelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar en prov RSNA och BP inspelning från en Nembutal-sövd råtta. En intravenös injektion av fenylefrin användes att inducera en ökning av medelvärdet artärtryck och att framkalla baroreflex och övergående sympathoinhibition4,6. För att kvantifiera RSNA, var den råa RSNA rättas och ett medelvärde för icke-överlappande 10 s segment; buller uppskattningen var subtraheras från varje segment.
Figur 1: RSNA och BP svar på fenylefrin injektion IV. Den råa RSNA (A) var full-våg rättas till (B). rättas krossade ”noll” RSNA visas i infälld C. Icke-överlappande 10 s medelvärden (minus buller) beräknades (D). För att framkalla baroreflex, injicerades 0,1 mL av fenylefrin (1 µg/mL) intravenöst (vid pilen). Bolus infusionen framkallade en plötslig ökning av BP och övergående hämning av RSNA. Denna siffra var anpassad från Fink AM, Dean C, Piano herr, Carley DW. De pedunculopontine tegmentum kontroller nedsatt sympatisk nervaktivitet och kardiorespiratorisk verksamheter Nembutal-sövda råttor. PLoS One. 2017. 12 (11): e01879564. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg för att mäta RSNA inkluderar: (1) att undvika stretching av Njurartären och nerver när separera njuren från paraspinal muskeln och när du placerar segmentet nerv på inspelning elektroderna, (2) noggrant dissekera nedsatt nervfibrerna från omgivande vävnad/fartyget, (3) säkerställa att elektroden ledningar är fria från vävnad, blod, eller lymfan vätska och (4) hindrar nerven från att torka ut genom att använda mineralolja nedsatt nerv och kiselgel till nerv-elektrod enheten. För felsökning är det viktigt att se till att inspelningssystemet är korrekt jordad. För att få en tydlig signal om RSNA, kan placeringen av elektroden noggrant justeras samtidigt visualisera och lyssnar på signalen raw RSNA, före inbäddning i kiselgel. Framgångsrikt slutförande av operationen resulterar i en RSNA signal som kan moduleras av CNS manipulationer för experiment varar flera timmar.
Vid tolkningen av resultaten skall överväga utredarna påverkan av anestesi på genomsnittlig artärtryck och RSNA. Detta protokoll används barbiturater anestesi (pentobarbital natrium), vilket kan minska genomsnittliga arteriella trycket och ändra autonoma Svaren21. Beroende på experimentet kan mål, andra injicerbara formuleringar eller inandning anestesi (via-Kona eller trakeostomi) vara begagnade22. Forskare kan överväga alternativen såsom uretan23 och alpha-chloralose24. Dessa medel har mindre påverkan på avtrubbning kardiovaskulära reflexer men kan utgöra potentiella hälsorisker till utredaren.
Utöver de metoder som beskrivs i detta protokoll, har alternativa metoder varit anställd av andra laboratorier för inspelning och tillverka elektroder. RSNA kan registreras med hjälp av rostfritt stål4,9, silver25eller platina26 wire. Dessutom lyfta utsatta nerven segmentet på Elektrodtråd, har forskare framgångsrikt registreras monofasiska RSNA i centrala ändar skär nedsatt sympatiska nerver26. Flexibilitet varierar beroende på den tänjbara styrkan av tråd (mätt med kPSI enheter). Högre kPSI tråd är sprödare men behåller sin form; låg kPSI wire är mer flexibla och mindre benägna att bryta när böjda, upprepande. För RSNA inspelningar är det viktigt att välja en tråd som lätt kan böjas och flyttas under inspelningar. Kabeln bör inte vara alltför flexibla, vilket gör det svårt att skapa krokar att placera under nerven, men inte alltför stel. Den senare ökar risken för stretching och skadar nerverna. Vårt laboratorium använder rostfritt stål wire med 155-185 kPSI.
Det finns många metoder för RSNA analys. I stället för att kvantifiera genomsnitt för 10 s inspelning segment och beräkna skillnaderna som procentuell förändring, RSNA kan bestämmas genom kvantifiera burst frekvens4,26,27. Detta tillvägagångssätt kan vara att föredra när de utgångsnivåerna och magnituder av RSNA Svaren skiljer sig bland råttor i en studie15,26. Ett annat tillvägagångssätt innebär rättelse och integration av RSNA signalen; RSNA amplituden (mätt i mV) summeras över ett valt tidsintervall (t.ex., 20 ms)15,26. En integratör tillämpar ett låg-fas filter och ger genomsnittliga ansvarsfrihet amplituden under utbrott av aktivitet överstiger tidskonstanten (t.ex., > 20 s)15,27. Integrerad signaler är användbara för att undersöka amplitud och fas av RSNA, men detta tillvägagångssätt ger inte information om oscillerande ändringar. Frekvens domän och tid domän metoder har tillämpats när forskare undersöker RSNA svängningar. Den strategi som ofta används för RSNA är snabb Fourier omformningen (FFT), som kategoriserar en signal till dess sinusformad svängningar, med en distinkt amplitud och fas20,26. FFT är en användbar metod för att undersöka de låg - och högfrekventa skurar i RSNA och studera respiratoriska och kardiella modulering av RSNA signalen.
Metoderna i detta protokoll är viktiga för att hantera hypoteser om den funktionella betydelsen av CNS atomkärnor. Nedsatt sympatiska nerver direkt neural kommunikation mellan CNS och njure, och akuta förändringar i RSNA utgör därför en viktig variabel i kardiovaskulär forskning. Definiera CNS mekanismer som reglerar sympatiska utflöde är ett prioriterat forskningsområde, med tanke på att nedsatt sympathoexcitation bidrar till patofysiologi och kliniska presentation av många sjukdomar (t.ex., kronisk njursjukdom, hjärta misslyckande, arytmier, diabetes mellitus och obstruktiv sömnapné)28,29. Indirekta mått på sympatisk nervaktivitet (t.ex., BP, pulsfrekvensvariation, katekolamin nivåer) är inte alltid lämpliga för studierna på den funktionella betydelsen av CNS atomkärnor. Direkt mätning av RSNA och genomsnittliga arteriella trycket hos sövda råttor utgör därför, en värdefull metod för funktionellt, anatomiskt definiera källorna till avvikande njurfunktion sympatisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anne M. Fink är medlem av kunden Advisory Board för Data Sciences International.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institute for Nursing Research (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
