Summary
Metoder til måling af sympatisk og hjerte-kar-svar til centralnervesystemet (CNS) manipulationer er vigtige for at fremme neurovidenskab. Denne protokol blev udviklet for at hjælpe forskere med måle og kvantificere akutte ændringer i renal sympatiske nerve aktivitet (RSNA) i bedøvede rotter (ikke-overlevelse).
Abstract
Renal sympatiske nerve aktivitet (RSNA) og middel-arterielt tryk er vigtige parametre i hjerte-kar- og autonome forskning; der er dog begrænsede ressourcer lede forskere i teknikker til at måle og analysere disse variabler. Denne protokol beskriver metoder til måling af RSNA og middel-arterielt tryk i bedøvede rotter. Protokollen indeholder også metoder til at få adgang til hjernen under RSNA optagelser til centralnervesystemet (CNS) manipulationer. RSNA optagelse teknik er kompatibel med farmakologiske, optogenetic, eller elektrisk stimulation af CNS. Fremgangsmåde er nyttig, når en efterforsker vil måle kortsigtede (min til h) autonome svar i ikke-overlevelse eksperimenter til at korrelere anatomisk med CNS kerner. Tilgangen er ikke beregnet til at blive brugt til at få kronisk (overlevelse) optagelser af RSNA i rotter. Udledninger i RSNA, gennemsnit udbedret RSNA, og middel-arterielt tryk kan kvantificeres og analyseres yderligere ved hjælp af parametrisk statistiske test. Metoder til fremskaffelse af venøs adgang, optagelse middel-arterielt tryk telemetrically og hjerne fiksering for fremtidige histologiske analyse er også beskrevet i artiklen.
Introduction
Prækliniske opdagelser om autonom kontrol af hjerte-kar-systemet informere strategier til håndtering af lidelser som hypertension, hjerteinsufficiens og kronisk nyresygdom. Overdreven aktivitet af det sympatiske nervesystem og reduceret vagus hjerte tone bidrager til forhøjet blodtryk (BP)1. Kronisk forhøjet renal sympatisk udstrømning forbedrer katekolamin udskillelse og nedsætter renale blodgennemstrømning, med skadelige konsekvenser for hjerte-kar-/ renal systemer2,3. For at definere den neurobiologiske veje fører til autonom dysfunktion, er studier i gnavere vigtige for at afgøre, hvordan centrale nervesystem (CNS) neuroner regulere sympatisk parametre. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe de tekniske data om måling af renal sympatiske nerve aktivitet (RSNA) og BP og skitsere teknikkerne til at kvantificere akut sympatiske ændringer som reaktion på CNS manipulationer i bedøvede rotter.
Akut (ikke-overlevelse) RSNA målinger (varig min til h) er nyttige, når forskerne vil sonden CNS farmakologisk, elektrisk, eller optogenetically i bedøvede rotter til at bestemme funktionerne af specifikke kerner. Ved hjælp af disse metoder, strukturer som den ensomme kerne, periaqueductal grå, er pedunculopontine tegmentum og rostralt ventrolaterale medulla blevet undersøgt for at definere neurobiologiske veje regulering sympatisk parametre4, 5,6,7. Denne tilgang er vigtig for at identificere CNS mål undersøges yderligere i kronisk modeller af autonom dysfunktion8,9. For at fuldføre disse eksperimenter, kræver laboratoriet en loddekolbe, kirurgisk mikroskop, stereotaxisk ramme, mikroelektrode forstærker og lyd monitor. Afhængigt af de faktorer i laboratoriet at bidrager til elektrisk støj, kan kirurgiske/optagelse område kræve et Faraday bur/jordforbindelse rem til at reducere elektrisk støj i RSNA optagelse. Hvis hjernen analyser vil kræve væv fiksering, en perfusion pumpe og aftræk hood er påkrævet. Data kan digitaliseres og registreres ved hjælp af flere fysiologisk software/data erhvervelse (analog-digital konverter) enheder4,5, med forskellige analyser valgmuligheder og kompatibilitet for at indarbejde telemetric signaler .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet blev godkendt af Udvalget om institutionelle Animal Care på University of Illinois i Chicago.
1. Opret Bipolar RSNA elektroder
- Hvis du vil oprette elektroden, skåret to stykker af tråd af rustfrit stål hver ca. 18 mm lang. Skær et stykke af polyethylen (PE-50) slanger ca 15 mm lange. Fodre begge stykker af tråd ind i slangen, forlader den ledning fremspringende fra begge ender.
- Fjerne isoleringen fra enderne af ledningerne; trim ledningerne forlader 2-3 mm af udsatte wire. Den ene ende, krympe mandlige pins over udsatte wiren. Lodde pins sikkert til wire, sikre pins indenfor et stik strimmel og dække forbindelse med epoxy.
NOTE: En alternativ tilgang, der undgår lodning er at bruge hurtig forbinde/release krokodillenæb. - På den modsatte ende af elektroden, fjerne isoleringen fra enderne af ledningerne, forlader 2-3 mm af udsatte wire. Bøje denne del af ledninger til at skabe små "V" formet kroge i uisoleret ledning.
Bemærk: Dette er del af den elektrode, der vil være i kontakt med den renale sympatiske nerve. Det er vigtigt at forsegle herpå for at forhindre væske ind i slangen. Silikone eller epoxy kan effektivt bruges.
2. administrere anæstesi og forberede kirurgisk websteder
- Administrere anæstesi til en mandlig Sprague Dawley rotte (alder 9-11 uger, vejer 150-400 g). Administrere pentobarbital natrium 50 mg/kg via en intraperitoneal (IP) injektion. For at vurdere en stabil flyet af anæstesi under operationen, kontrollere tå-knivspids refleks hver 15 min og re dosis anæstesi efter behov.
Bemærk: Pentobarbital natrium (Nembutal) blev brugt i tidligere undersøgelser til at opnå en vedvarende flyet af anæstesi uden at forstyrre graduering af RSNA4,5,6. Denne protokol er for ikke-overlevelse kirurgi, så der er ingen recovery/post-operative overvågning periode. - Forberede operationsstedet ifølge institutionelle dyrs pleje retningslinjer (dvs., barbere rotten mave, ryg og hoved; rense huden med 10% povidon-jodopløsning; anvende øje lubricant; og placere rotten på en varmepude). Opretholde kropstemperaturen ved 37 ° C under forsøgene.
3. kanyleres i Femoral vene (for intravenøs adgang)
- Tilføje heparin til 0,9% sterilt saltvand (at opnå 20 enheder/mL). Fyld en 1 mL sprøjte med heparinized saltvand gennem en 22G kanyle. Forbind 15 cm af PE-50 slangen til nålen og fyld slangen med løsningen.
- Med rotten liggende liggende, oprette en 2 cm vandret snit igennem lyskelymfeknuder området. Ved hjælp af bomuld tippes applikatorer, dissekere bindevæv at eksponere femoral vene- og arterie. For at holde indsnittet åben, anvende enten enkelt-krogen elastik kirurgisk forbliver fastgjort til de kirurgiske felt med silke bånd eller bruge små hemostats.
- Brug hemostats til at bøje spidsen af en 22G kanyle i en 90° vinkel til at tjene som et kateter introducerende10.
- Visualisere fartøjer under mikroskop. Forsigtigt separat vene- og arterie ved hjælp af buet pincet. Sted to 12 cm lang 5-0 silke sutur under venen (en distale og en proksimal); Placer sutur på samme måde under arterie.
- Binde den distale (nederst) sutur for at occlude vene; sikre kanterne af denne sutur til kirurgisk feltet enten silke bånd eller små hemostats. Træk forsigtigt venen stramt, men ikke med så meget kraft at fartøjet vil rive. Placer vinkelret på kirurgens dominerende hånd vene.
- Bruge en løs overhånd halv knude i den proksimale sutur til kortvarigt occlude venen. Med delikat hæmostatisk pincet, forsigtigt klemme denne sutur for at occlude blodgennemstrømning. Hold 22G nålen med bøjet spids i den ikke-dominerende hånd; spænde slangen med pincet med den dominerende hånd.
- Punktere et lille hul i vene med kateter introducerende (trin 3.3) og indsætte PE-50 slangen (fyldt med heparinized saltvand) ind i skibet; bruge den bøjet nål, at holde åbningen i fartøj åben og hjælpe med at placere spidsen af kateteret ind i fartøjet10.
- Frigive den proksimale sutur og forsigtigt flush 0,2 mL af heparinized saltvand ind i venen; rykke kateteret. Kontrollere blod tilbagevenden fra vene til at sikre korrekt placering. Fuldføre den proksimale knude og med distale sutur slips, sikre slangen inde i venen.
- Bruge venøs adgang under forsøgene for administration af supplerende anæstesi eller medicin og blod samling. Indarbejde en 3-vejs-connector, hvis regelmæssig intravenøse infusioner og udtagning af blodprøve vil være nødvendigt. Kontrollere skadelige tå-knivspids refleks hver 15 min titreres anæstesi.
4. kanyleres arteria femoralis for middel-arterielt tryk overvågning
- Visualisere arterie under mikroskop. Svarende til metoden, der anvendes til venøs cannulation, binde den distale sutur (trin 3,4) til at occlude arterie; sikre kanterne af denne sutur til det kirurgiske felt med silke bånd og Placer vinkelret på kirurgens dominerende hånd arterie.
- Arteriel adgang hvis du bruger en transducer/infusion tryksystem
- Tilslut transducer/trykslanger til en 500 mL 0,9% saltvand taske. Skyl slanger med saltvand, fjerne alle bobler, og placere tasken inde i en presset inducer taske til at presse systemet.
- Som beskrevet i trin 3.1, udfylde en 1 mL sprøjte med heparinized saltvand gennem en 22G kanyle og tilsluttes nålen (flush slanger med heparinized saltvand) 15 cm af PE-50.
- Bruge en løs halv knude i den proksimale sutur til kortvarigt occlude arterie. Hold kateter introducerende (trin 3.3) i ikke-dominerende hånd; hold den distale spidsen af PE-50 med fartøjet cannulation pincet i den dominerende hånd. Punkteres et hul i arterien med bøjet 22G kanyle og sæt kanylen i fartøjet.
- Frigive de proksimale sutur, forsigtigt flush 0,2 mL af heparinized saltvand ind i arterien og advance kateteret så vidt muligt. Check for arterielt blod tilbage til at sikre korrekt placering. Fuldføre den proksimale knude og med distale sutur slips, sikre slangen inde i arterie. Tilslut den arterielle linje til transducer/trykslanger.
Bemærk: Den distale del af slangen kan tapede til rottes hindlimb til at sikre den arterielle linje. En alternativ tilgang til skib cannulation er beskrevet af Jespersen mfl.; 11 deres protokol adskiller sig ved hjælp af retraktorer for at sprede indsnittet, lim-snarere end sutur-at sikre slangen, og tilgangen omfatter ikke bøjet nål introducerende.
- Arteriel adgang hvis ved hjælp af telemetri
- Inspicere pres-sensing kateteret under høj forstørrelse før arteriel cannulation. Sikre, at kateteret er fri af bobler/snavs og har en intakt menisk mellem de væskefyldte (proksimalt) og gel-fyldt (distale) komponenter. Før hver implantation, refill gel på distale spidsen af kateteret. Tænd senderen ved hjælp af en magnet; overvåge BP under kirurgi til at udholde perfekt placering.
- Bruge en løs overhånd halv knude i den proksimale sutur til kortvarigt occlude arteria femoralis. Hold kateter introducerende (trin 3.3) i ikke-dominerende hånd. Hold spidsen af kanylen af telemetri enhed med fartøjet cannulation pincet til at undgå at fortrænge gel fra spidsen.
- Punkteres et hul i arterien med bøjet 22G kanyle og sæt kanylen i arterie ved hjælp af fartøjet cannulation pincet til at undgå at fortrænge gel fra spidsen. Forhånd kanyle så vidt muligt. Bruger de proksimale og distale sutur bånd, sikre pres kateter.
- Tuck kroppen af telemetri implantatet inde flanke støder op til indsnittet, og luk denne indsnit ved hjælp af 4-0 nylon sutur på en skæring nål. Slukke telemetri enheder af magnet ved afslutningen af perioden optagelse hen til conserve akkumulator liv.
5. Placer rotten i rammen stereotaxisk kirurgi til at få adgang til hjernen
- Forsigtigt flytte rotten i den liggende position i rammen stereotaxisk kirurgi.
- Placere rotten mellem øre barer, og justere chopper bar for at udjævne højden af lambda og bregma. Positionering kan afhænge af rat stamme, vægt og andre steder af CNS mål.
- Lave en 2 cm rostrocaudal skalpel snit gennem midterlinjen af hovedbunden. Ved hjælp af bomuld tippes applikatorer, fast fjerne bindevæv fra kraniet overflade. Anvende brintoverilte til kraniet til at hjælpe med at visualisere bregma, lambda og midterlinjen suturer.
- Bruger en atlas af rotte hjernen til at guide målretning12, bore et burr hul osteotomi, dimensioneret for elektrode adgang gennem kraniet.
6. isolering af Renal sympatiske nerver
- Tilslut wire RSNA elektrode (trin 1.1-1.3) til en 10 X forforstærker og mikroelektrode forstærker.
- Isolere renal nerverne gennem en retroperitoneal snit forud for eller efter rotten er sikret i stereotaxisk rammen. Placer RSNA elektroder, når rotten er i stereotaxisk rammen. Gøre en skalpel indsnit strækker sig fra 4-5 cm under ribbenene i caudale retning, lidt lateralt for rygsøjlen. Blunt dissekere snit til at visualisere paraspinal muskler.
- Brug saks til at gøre en meget overfladisk 1-2 cm rostrocaudal snit hvor fedt møder musklen. Ved hjælp af bomuld tippes applikatorer, sprede fedt fra musklen til at visualisere nyren. Det er vigtigt ikke at indtaste peritoneal plads.
- Bruge retraktorer forsigtigt adskille nyre fra paraspinal muskler til at visualisere nyrearteriestenose og abdominale aorta. Ikke strække fartøjer alt for at undgå at beskadige de renale nerver. Brug en 2 "x 2" gaze vatrondel gennemvædet med saltvand til at beskytte nyrerne fra skade.
- Under høj forstørrelse, identificere de renale nerver i snit lomme. Nerve bundter er mest synlige på den rette vinkel dannet af aorta og nyrearteriestenose. De renale nerver følge nøje nyrearteriestenose fra aorta til nyrerne.
- Vælg et segment af nerve bundle, der vil blive placeret på den optagelse elektrode. Forsigtigt dissekere nervetråde fra det omkringliggende væv/fartøj ved hjælp af mikro-dissekere pincet.
- Sikre wire RSNA elektrode i en holder (fx., en alligator klip knyttet til en stativet). Lavere elektrode til niveauet af nerve-segmentet. Brug en nerve krog til at forsigtigt løfte segment af renal nerve på elektroden uden at strække nerven.
Bemærk: Nerven bør hvile inde i begge "V" formet kroge i den uisolerede ledning, parallelt med nerven. Elektrode ledninger må ikke røre andre væv, blod eller lymfe væske. - Fylde snit med mineralsk olie til at forhindre den udsatte renal sympatiske nerve bliver tør. Bruge en grundstødning klip med ene ende på huden af indsnittet og den anden tilknyttet Faraday bur.
- Direkte signal-forstærkere ved hjælp af high - og low-pass filtrering (10 Hz og 3 kHz). Justere gevinst op til 10 K. Medtag en lyd monitor til at vurdere de brister mønster af RSNA. Bruge prøveudtagning priser spænder mellem 2.000-10.000 Hz4,5,6,7,8. Bruge en øget samplingfrekvens, når CNS manipulation er en hypotese for at forårsage hurtig/kort sympatiske svar.
7. Optag Data
- Vurdere kvaliteten af RSNA optagelse af fremmane baroreflex med en bolus injektion af 1 mL saltvand eller 10 µg/mL phenylephrin (i 0,1 mL) intravenøst. Som illustreret i figur 1, bør infusionen øge BP og hæmme RSNA. En stigning i middel-arterielt tryk af 60-80 mmHg er tilstrækkelig for nyre sympathoinhibition4,13,14.
- Justere placeringen af elektroderne for at forbedre signalet, hvis nødvendigt. Repositionering er påkrævet, hvis nerven ikke er i kontakt med både kroge på elektroden, eller hvis nogen væv, blod eller lymfe væske er i kontakt med ledningerne.
Bemærk: Behovet for repositionering er baseret på de auditive egenskaber af nerve udledninger.- Hvis byger af RSNA ikke forekommer cyklisk med hjertets cyklus, og hvis der er nogen indblanding i optagelsen, derefter forsigtigt flytte elektrode.
- Respiratoriske bevægelser kan også påvirke kvaliteten af RSNA optagelse, forbedre signalet ved at flytte forsigtigt elektroden ind i en position, hvor muskelbevægelser ikke forstyrrer elektroden i løbet af vejrtrækning.
- Når et signal er opnået, sikre RSNA elektrode på plads ved fratagelse af mineralsk olie og anvende en silica gel for at dække nerve/elektrode-forbindelsen i indsnit lommen. Flyt ikke rotten, før gel har sat helt.
- Udføre CNS manipulation protokoller mens løbende optagelse RSNA og betyde arterielt tryk. Hvis en microinjector/impulsgiver bruges til hjernestammen manipulationer, kan en logik signal fra denne enhed indføres i RSNA/BP optagelser til at dokumentere timingen af CNS manipulationer.
- Når eksperimentet er afsluttet, skal du bestemme støjniveauet ved at knuse den nerve proksimalt for optagelse elektroderne mellem silica gel og spinal musklen. Post mindst 30 s af denne "nul" værdi for RSNA4,5,6. Som en alternativ metode til kvantificering støj, administrere en korttidsvirkende ganglionære blocker f.eks. atropin, hexamethonium, chlorisondamine eller pentolinium tartrat8,15,16, 17.
- Forsigtigt fjerne RSNA elektrode og fjerne alle spor af silica gel fra wire elektroder. Gemme elektrode til genbrug. Slå telemetri senderen og fjerne det, pas på ikke for at beskadige spidsen af kateteret.
8. dødshjælp (Transcardiac Perfusion)
- Identificere placeringen af CNS manipulationer ved at indsprøjte farvestoffer eller fluorokromer, skabe elektrolytisk læsioner, eller ved påvisning af c-fos udtryk.
- Hvis hjernen analyser vil kræve fiksering, forberede transcardiac perfusion rotten. Vurdere den tå-knivspids refleks for at sikre, at rotten forbliver dybt bedøvede. Give supplerende anæstesi, hvis nødvendigt. Udføre transcardiac perfusion af PARAFORMALDEHYD fiksativ i et stinkskab.
Forsigtig: Ivrig hud/øje irriterende. - Indsæt slanger i perfusion pumpe og prime med 0,9% normal saltvand.
- Lave en 5-6 cm lateral snit gennem huden og bugvæggen umiddelbart under brystkassen og åbne brysthulen. Forsigtigt adskille leveren fra mellemgulvet. Gør et lille snit i mellemgulvet, bruger buet sløv saks. Injicere 0,1 mL af heparin direkte ind i venstre hjertekammer.
- Passere en perfusion nål ind i venstre hjertekammer (en rustfrit stål sonde nål fungerer godt for dette trin) af enten punktering det ind i hjertet eller ved at skære et lille snit ved hjælp af skarp saks og passerer sonde nål gennem, så spidsen er synlig gennem de væggen af aorta (men ikke skulle ikke nå aortabuen). Brug et kirurgisk eller elektriske klip til at sikre nålen i sted.
- Bruge en infusion pumpe, administrere 0,9% normal saltvand (stuetemperatur). Straks oprette en 2-3 mm snit i højre atrium til at oprette en afsætningsmulighed for den saltvand skylning. Ikke skære den nedadgående aorta. Fortsætte den saltvand skylning indtil leveren skifter farve fra rød/brun til bleg gul, en infusion af ca. 400 mL over 2-3 min.
- Standse pumpen. Skifte perfusate til fiksativ (fx., 10% formalin eller 4% PARAFORMALDEHYD); indgyde 400 mL over 2-3 min. fjerne hjernen og gemme modellen i Fikseringsvæske løsning natten over ved 4 ° C før overførsel af væv til 30% saccharose (30 mL af saccharose opløses i 100 mL af 0,1 M fosfatbufferet saltopløsning) i mindst 3 dage eller indtil hjernen dræn , for cryoprotection før cryogenetic skæring18.
9. analysere Data
- Fuld-bølge berigtige den rå RSNA at opnå absolutte værdier. Fuld-bølge berigtige en 10 s segment af rå støj signalet. Det er vigtigt at udelukke nogen undersøgelser, der blev ramt af et lavt signal / støj-forhold. I undersøgelser kvantificere RSNA, efterforskere anvendes forudgående kriterier som kræver signal til støj forhold til overstiger 2:1 til 6:117,19,20.
- Beregne middelværdien udbedret RSNA for ikke-overlappende segmenter (µV) og trække støj skøn (µV). Afhængigt af formålet med forsøget, efterforskere kan Vælg intervaller som 10 s (figur 1) eller 1 s. Beregn betyder ved hjælp af bølgeform analyseindstillinger i fysiologisk softwaren eller eksportere data til regneark til at beregne gennemsnittene for valgte tidsintervaller.
- Express værdier for yderligere analyse for at normalisere på tværs af forskellige dyr, som procent fra grundlinje. Bruge parametrisk statistik til at gennemføre gruppe sammenligninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer en prøve RSNA og BP optagelse fra en Nembutal-bedøvede rotte. En intravenøs injektion af phenylephrin blev brugt til at fremkalde en stigning i middel-arterielt tryk og at fremmane den baroreflex og forbigående sympathoinhibition4,6. For at kvantificere RSNA, var den rå RSNA korrigeret og gennemsnit for ikke-overlappende 10 s segmenter; støj skøn blev trukket fra hver segment.
Figur 1: RSNA og BP svar på phenylephrin injektion IV. Den rå RSNA (A) var fuld-bølge udbedret (B); udbedret knust "nul" RSNA er vist i inset C. Ikke-overlappende 10 s gennemsnit (minus støj) blev beregnet (D). For at fremkalde baroreflex, var 0,1 mL af phenylephrin (1 µg/mL) injiceres intravenøst (ved pilen). Bolus infusion fremkaldte en brat stigning i BP og forbigående hæmning af RSNA. Dette tal var tilpasset fra Fink AM, Dean C, klaver hr., Carley DW. Pedunculopontine tegmentum kontrol renal sympatiske nerve aktivitet og kardiorespiratorisk aktiviteter i Nembutal-bedøvede rotter. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afgørende skridt til at måle RSNA omfatter: (1) undgå udspænding af nyrearteriestenose og nerver når adskiller nyre fra paraspinal muskel og når markedsføring nerve segment optagelse elektroder, (2) omhyggeligt dissekere de renale nervefibre fra de omkringliggende væv/skib, (3) at sikre, at elektroden ledninger er fri for væv, blod, eller lymfeknuder væske, og (4) forhindrer nerven mod udtørring ved at anvende mineralsk olie på den renale nerve og silica gel til nerve-elektrode enhed. I forbindelse med fejlfinding er det vigtigt at sikre, at registreringssystemet er tilstrækkeligt begrundet. For at opnå et klart signal om RSNA, kan placeringen af elektroden justeres omhyggeligt mens visualisere og lytte til den rå RSNA signal, forud for indlejring i silicagel. Fuldførelse af kirurgi resulterer i en RSNA signal, der kan tilpasses af CNS manipulationer for forsøgene varede flere timer.
Ved fortolkningen af resultaterne, bør efterforskerne overveje anæstesi indflydelse på middel-arterielt tryk og RSNA. Denne protokol bruger barbiturat anæstesi (pentobarbital natrium), som kan reducere middel-arterielt tryk og ændre autonome svar21. Afhængigt af eksperimentet kan mål, andre injicerbare formuleringer eller inhalation anæstesi (via næse-kegle eller tracheostomi) være brugt22. Forskere kan overveje alternativer såsom urethan23 og alpha-chloralose24. Disse agenter har mindre indvirkning på forfladige hjerte-kar-reflekser men kan udgøre potentielle sundhedsrisici til investigator.
Ud over de i denne protokol beskrevne metoder, har alternative metoder været beskæftiget i andre laboratorier for registrering og opdigte elektroder. RSNA kan registreres ved hjælp af rustfrit stål4,9, sølv25eller platin26 wire. Ud over løft udsatte nerve segment på elektrode wire, har forskere med succes registreret monofasiske RSNA i centrale enderne af klip renal sympatiske nerver26. Fleksibilitet er forskellig baseret på trækstyrke på wiren (målt med kPSI enheder). Højere kPSI wire er mere skørt men bevarer sin form; lav kPSI wire er mere fleksibel og mindre tilbøjelige til at pause, når bøjet, gentagne gange. For RSNA optagelser er det vigtigt at vælge en wire, der let kan bøjes og flyttes under optagelser. Ledning bør ikke være alt for fleksibel, hvilket gør det vanskeligt at oprette kroge til at placere under nerven, men ikke for stiv. Sidstnævnte øger risikoen for stretching og skader på nerverne. Vores laboratorium bruger rustfrit stål wire med 155-185 kPSI.
Der er mange tilgange til RSNA analyse. Snarere end kvantificere gennemsnit for 10 s optagelse segmenter og beregning af forskelle som procentvise ændring, RSNA kan bestemmes ved kvantificere burst frekvens4,26,27. Denne tilgang kan være foretrukne, når baseline niveauer og omfanget af RSNA svar afviger blandt rotter i en undersøgelse15,26. En anden tilgang indebærer berigtigelse og integration i RSNA signal; RSNA amplitude (målt i mV) er sammenfattet i et defineret interval af tid (fx., 20 ms)15,26. En integrator anvender et filter, low-fase og giver den gennemsnitlige udledning amplitude under burstperioder aktivitet overstiger tid konstanten (fx., > 20 s)15,27. Integreret signaler er nyttige til at undersøge amplitude og fase af RSNA, men denne fremgangsmåde indeholder ikke oplysninger om oscillerende ændringer. Frekvens domæne og tid domæne metoder er blevet anvendt, når forskere undersøger RSNA svingninger. Den tilgang, der ofte anvendes til RSNA er den hurtige Fourier transformation (FFT), der kategoriserer et signal i sin sinusformet svingninger, hver med en særskilt amplitude og fase20,26. FFT er en nyttig tilgang for behandlingen af lav - og højfrekvens byger i RSNA og til at studere luftvejssygdomme og hjerte graduering af RSNA signal.
Metoderne i denne protokol er vigtig for adressering hypoteser om de funktionelle betydning af CNS kerner. Renal sympatiske nerver direkte neurale kommunikation mellem CNS og nyre, og akut ændringer i RSNA repræsenterer derfor en vigtig variabel i hjerte-kar-forskning. Definere CNS mekanismer regulere sympatisk udstrømning er et prioriteret forskningsområde, overvejer den renale sympathoexcitation bidrager til Patofysiologi og kliniske præsentation af mange sygdomme (fx., kronisk nyresygdom, hjerte svigt, arytmier, diabetes mellitus og obstruktiv søvnapnø)28,29. Indirekte foranstaltninger af sympatiske nerve aktivitet (fx., BP, hjertefrekvens variabilitet, katekolamin niveauer) er ikke altid egnet til undersøgelser på den funktionelle betydning af CNS kerner. Derfor, direkte måling af RSNA og middel-arterielt tryk i bedøvede rotter udgør en værdifuld metode for funktionelt, anatomisk definere kilder af afvigende sympatisk nyrefunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anne M. Fink er medlem af Customer Advisory Board for Data Sciences International.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af det nationale Institut for sygepleje forskning (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
