Summary
שיטות למדידת תגובות סימפטי ואת הלב וכלי הדם מערכת העצבים המרכזית (CNS) מניפולציות חשובים לקידום מדעי המוח. פרוטוקול זה פותחה כדי לסייע למדענים מדידה וכימות שינויים חריפה בפעילות כליות העצבים הסימפתטית (RSNA) בחולדות מרדימים (ההישרדות).
Abstract
פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA), כלומר לחץ הדם בעורק הינם פרמטרים חשובים אוטונומי וכלי מחקר; עם זאת, ישנם משאבים מוגבלים בימוי מדענים טכניקות מדידה וניתוח של משתנים אלה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות למדידת RSNA ובלחץ עורקי רשע בחולדות מורדם. הפרוטוקול כוללת גם את הגישות לגישה אל המוח במהלך ההקלטות RSNA מניפולציות במערכת העצבים המרכזית (CNS). טכניקת הקלטה RSNA היא תואמת לתרופתי, optogenetic, או גירוי חשמלי של מערכת העצבים. הגישה היא שימושית כאשר חוקר ימדוד לטווח קצר (דקה כדי h) תגובות אוטונומי בניסויים ההישרדות כדי לתאם אנטומית עם גרעינים CNS. הגישה אינה מיועדת לשמש כדי להשיג הקלטות כרונית (הישרדות) של RSNA בחולדות. הפרשות ב RSNA, בממוצע לתקן RSNA ולאחר לחץ עורקי רשע יכול להיות לכמת וניתח נוסף באמצעות בדיקות סטטיסטיות פרמטרית. שיטות לקבלת גישה ורידית, הקלטה רשע לחץ הדם בעורק telemetrically של המוח קיבוע לבדיקה היסטולוגית בעתיד גם מתוארים במאמר.
Introduction
גילויים ניסויים פרה-קליניים על שליטה אוטונומי של מערכת הלב וכלי הדם להודיע אסטרטגיות לניהול הפרעות כגון יתר לחץ דם, אי ספיקת לב, מחלת כליות כרונית. פעילות יתר של מערכת העצבים הסימפתטית, מופחתת הטון הלב vagal לתרום לחץ דם גבוה (BP)1. מוגברות באופן כרוני יצוא סימפטי כליות מגבירה את הפרשת קטכולאמין ומקטינות את זרימת הדם כליות, עם השלכות מזיקות מערכות לב וכלי דם/כליות2,3. כדי להגדיר את המסלולים הנוירוביולוגי המובילים תפקוד אוטונומי, מחקרים בחולדות חשובים בקביעת כיצד נוירונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) להסדיר פרמטרים סימפטי. המטרה של פרוטוקול זה היא לספק מידע טכני על מדידת פעילות העצבים הסימפתטית כליות (RSNA) ולחץ הדם, חלוקה לרמות טכניקות לכימות בתגובה CNS מניפולציות בחולדות ומורדמת חריפה לשינויים סימפטי.
(ההישרדות) חריפה RSNA מדידות (שנמשך דקות ל- h) שימושיות כאשר מדענים שמחשבי מערכת העצבים פרמקולוגית, חשמלית, או optogenetically ב. מורדם חולדות כדי לקבוע את הפונקציות של גרעינים ספציפיים. בשיטות אלה, מבנים כגון לגרעין בודד, אפור periaqueductal, pedunculopontine tegmentum, rostral לשד ventrolateral נחקרו להגדרת מסלולים הנוירוביולוגי ויסות פרמטרים סימפטי4, 5,6,7. גישה זו חשובה לזיהוי מטרות CNS שתהיה חקירה נוספת במודלים כרונית של חוסר תפקוד אוטונומי8,9. להשלמת ניסויים אלה, המעבדה מחייבת את המלחם מיקרוסקופ כירורגי, מסגרת stereotaxic, מגבר microelectrode, צג השמע. בהתאם הגורמים נוכח במעבדה שתורמים רעש חשמלי, האזור כירורגי/הקלטה עשויים לדרוש של פאראדיי כלוב/הארקה רצועה להפחית את הרעש חשמל בהקלטה RSNA. אם המוח ניתוחים ידרוש קיבוע הרקמה, ברדס משאבת, fume זלוף נדרשים. נתונים יכול להיות דיגיטציה והקליט באמצעות מספר תוכנות הפיזיולוגיות/נתונים רכישה (ממיר אנלוגי-דיגיטלי) יחידות4,5, עם אפשרויות ניתוח שונה compatibilities לכלילת אותות telemetric .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות אושרו על-ידי מוסדיים חיה טיפול הוועדה ב אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.
1. ליצור הפרעה דו קוטבית RSNA אלקטרודות
- כדי ליצור האלקטרודה, לחתוך שתי חתיכות של פלדת אל-חלד חוט כל כ 18 מ מ אורך. חותכים חתיכה אחת של פוליאתילן (PE-50) אבובים כ-15 ארוך. להאכיל את שני החלקים של החוט לתוך הצנרת, עוזב את החוט בולט משני הכיוונים.
- הסר את הבידוד של קצות החוטים; חתוך את החוטים עוזב 2-3 מ מ חוט חשוף. בקצה אחד crimp פינים זכר על חוט חשוף. הלחמה הפינים בצורה מאובטחת לכבל, לאבטח הפינים שבתוך רצועת מחבר ולכסות את החיבור עם אפוקסי.
הערה: גישה חלופית אשר ימנע הלחמה היא להשתמש סרטונים אליגטור לחבר/שחרור מהיר. - בקצה הנגדי של האלקטרודה, הסר את הבידוד של קצות החוטים, עוזב 2-3 מ מ חוט חשוף. לכופף את החלק הזה של החוטים כדי ליצור קטן "V" בצורת ווים בתוך הגדר uninsulated.
הערה: זהו החלק של האלקטרודה זה יהיה בקשר עם העצב סימפטי כליות. חשוב לסגור את הקצה כדי למנוע חדירה של צינורות נוזלים. סיליקון או אפוקסי ביעילות יכול לשמש.
2. ניהול הרדמה ולהכין אתרי כירורגי
- לנהל הרדמה לחולדה ספראג Dawley זכר (גיל 9-11 שבועות, במשקל 150-400 גרם). לנהל סודיום פנטוברביטל 50 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה (IP) בקרום הבטן. כדי להעריך את המטוס יציב של ההרדמה במהלך הניתוח, בדוק הבוהן-קמצוץ רפלקס כל 15 דקות, הרדמה מחדש במינון לפי הצורך.
הערה: סודיום פנטוברביטל (לכי) נעשה שימוש במחקרים קודמים על מנת להשיג מטוס מתמשכת של הרדמה ללא הפרעה האפנון של RSNA-4,-5,-6. פרוטוקול זה הוא לניתוח ההישרדות, ולכן אין שחזור/פוסט-operative תקופת פיקוח. - הכנת האתר כירורגית לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים (כלומר., לגלח הבטן של החולדה, הגב, הראש; לנקות את העור עם 10% הפתרון povidone יוד; החל סיכה העין; למקם את החולדה על כרית החימום). לשמור על טמפרטורת הגוף ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים.
3. נקרר את הווריד של הירך (לגישה תוך ורידי)
- מוסיפים הפרין 0.9% מלח סטרילית (כדי להשיג 20 יחידות/mL). ממלאים מזרק 1 mL heparinized מלוחים דרך מחט 22 גרם. להתחבר 15 ס מ של צינורות PE-50 המחט ואת צינורות מילוי עם הפתרון.
- עם העכבר שוכב פרקדן, ליצור חתך אופקי 2 ס מ דרך אזור במפשעה. באמצעות applicators שקצהו כותנה, לנתח את רקמת החיבור לחשוף את וריד הירך עורק. להחזיק את החתך פתוח, או להחיל אלסטי יחיד-הוק שהייה כירורגי מאובטחת לשדה כירורגי במשי קלטת או להשתמש ועוצרי דימום קטן.
- השתמש ועוצרי דימום לכופף את קצה מחט 22 גרם בזווית של 90° כדי לשמש לו קטטר introducer10.
- דמיינו את כלי הדם במיקרוסקופ. הפרד בעדינות את הווריד ואת העורק באמצעות מלקחיים מעוקל. מקום שני 12 ס מ באורך 5-0 משי תפר מתחת הווריד (דיסטלי אחד ואחד proximal); מקם את התפר באופן זהה מתחת העורק.
- לקשור את התפר הדיסטלי (למטה) כדי occlude את הווריד; לאבטח את הקצוות של. התפר לשדה כירורגי באמצעות סרט משי או ועוצרי דימום קטן. משוך בעדינות את הווריד מתוח אבל לא עם כל כך הרבה כוח הספינה תקרע. מקם את הווריד בניצב היד הדומיננטית של המנתח.
- להשתמש קשר רופף חצי מונפות קדימה התפר proximal כדי occlude בקצרה את הווריד. עם מלקחיים עדינה hemostatic, הצמד בעדינות את. התפר כדי occlude זרימת הדם. . תחזיקי את המחט 22 גרם עם קצה מכופף ביד האחרת; אבזם את הצנרור עם מלקחיים באמצעות היד הדומיננטית.
- לנקב חור קטן בווריד עם introducer הקטטר (שלב 3.3) והכנס את צינורות PE-50 (מראש מלא heparinized מלוחים) לתוך הכלי; השתמש את המחט בנט כדי לשמור על הפתח הפתוח כלי לסייע במיקום את קצה הקטטר לתוך כלי הקיבול10.
- לשחרר את התפר proximal ותוציאו בעדינות 0.2 מ"ל של תמיסת מלח heparinized לווריד; לקדם הקטטר. בדוק החזרה דם הווריד כדי להבטיח השמה נכונה. להשלים את הקשר הפרוקסימלית ו, עם תפר דיסטלי עניבה, לאבטח את הצנרור פנימה הווריד.
- להשתמש גישה ורידית במהלך הניסויים עבור ניהול הרדמה משלימה או תרופות, איסוף דם. שלב 3-דרך מחבר אם חליטות תוך ורידי קבוע ודגימה הדם יהיה צורך. בדוק הבוהן-קמצוץ יתמודד רפלקס כל 15 דקות titrate הרדמה.
4. נקרר עורק הירך לניטור לחץ הדם בעורק מרושע
- דמיינו את העורק מתחת למיקרוסקופ. בדומה לפעולת השירות משמש תעלות ורידים, לקשור את התפר הדיסטלי (3.4 שלב) כדי occlude את העורק; לאבטח את הקצוות של. התפר בשדה כירורגית עם קלטת משי ומקם את העורק בניצב היד הדומיננטית של המנתח.
- עורקי הגישה, אם באמצעות מערכת העירוי/מתמר לחץ
- לחבר את מתמר לחץ/צינורות שקית saline 0.9% 500 מ"ל. לשטוף את הצנרור עם תמיסת מלח, הסרת כל הבועות, ומקם את התיק בתוך שקית משרן לחץ כדי לדחוס את המערכת.
- כפי שמתואר בשלב 3.1, למלא מזרק 1 mL heparinized מלוחים דרך מחט 22 גרם וחבר 15 ס מ PE-50 המחט (צינורות מיושרות עם heparinized מלוחים).
- להשתמש חצי קשר רופף התפר proximal כדי occlude בקצרה את העורק. להחזיק את introducer צנתר (שלב 3.3) ביד האחרת; להחזיק בקצה הדיסטלי של PE-50 עם מלקחיים תעלות כלי ביד הדומיננטית. לנקב חור בתוך העורק עם מחט 22 גרם כפופות והכנס את הצינורית לתוך הכלי.
- שחרר את התפר צינתור, סומק בעדינות 0.2 מ"ל של תמיסת מלח heparinized לתוך העורק מראש הצנתר ככל האפשר. בדוק אם ההחזרה כדי להבטיח השמה נכונה והסריקה. להשלים את הקשר הפרוקסימלית ו, עם תפר דיסטלי עניבה, לאבטח את הצנרור בתוך העורק. להתחבר העורק מתמר לחץ/שיט אבובים.
הערה: בחלק הדיסטלי של אבובים יכול להיות מודבק hindlimb של החולדה כדי לאבטח את העורק. גישה חלופית תעלות קיבול מתואר על ידי Jespersen et al.; 11 שפרוטוקול שלהם שונה על-ידי שימוש רטרקטורים להפיץ את החתך, דבק-מעדיף מאשר התפירות-כדי להבטיח הצנרת, ואת הגישה אינה כוללת את introducer המחט בנט.
- עורקי הגישה אם משתמש טלמטריה
- בדוק את הצנתר חישה לחץ תחת בהגדלה לפני תעלות עורקי. להבטיח כי הצנתר ללא בועות/פסולת ויש שלם מניסקוס בין מלאות נוזל (proximal) ורכיבים מלא ג'ל (דיסטלי). לפני ההשתלה כל מילוי מחדש את הג'ל בקצה הדיסטלי של הקטטר. להפעיל את המשדר באמצעות מגנט; לנטר לחץ דם במהלך הניתוח לסבול מיקום מושלם.
- להשתמש קשר רופף חצי מונפות קדימה התפר proximal כדי לזמן קצר occlude בעורק הירך. החזק את הקטטר introducer (שלב 3.3) ביד האחרת. להחזיק את קצה הצינורית של היחידה טלמטריה עם כלי מלקחיים תעלות כדי להימנע ועקרו מבתיהם ג'ל מהקצה.
- לנקב חור בתוך העורק עם מחט 22 גרם כפופות והכנס את הצינורית לתוך העורק באמצעות מלקחיים תעלות כלי כדי להימנע ועקרו מבתיהם ג'ל מהקצה. לקדם את הצינורית רחוק ככל האפשר. באמצעות הקשרים לקרע, תפירה, אבטח את הצנתר לחץ.
- מתיחת הגוף של השתל טלמטריה בתוך האגף הסמוכים החתך וסגור את החתך. באמצעות תפר ניילון 4-0 על מחט חיתוך. כבה התקנים בדיקות וטלמטריה על ידי מגנט בתום תקופת ההקלטה כדי לשמר את חיי הסוללה.
5. הצב את העכברוש במסגרת ניתוח Stereotaxic לגשת המוח
- בעדינות להעביר את החולדה בשכיבה על המסגרת ניתוח stereotaxic.
- מקם את החולדה בין הסורגים האוזן ו הבר חותכת על מנת להשוות את הגובה של למדא, bregma. מיצוב שעשוי להיות תלוי על זן עכברים, משקל, מיקומים של CNS מטרות.
- עושים 2 ס מ rostrocaudal האזמל חתך דרך האמצע של הקרקפת. באמצעות applicators שקצהו כותנה, הסר בחוזקה רקמת חיבור פני הגולגולת. מימן על-חמצני חלות על הגולגולת כדי לסייע להמחיש את bregma למדא, התפרים קו האמצע.
- באמצעות אטלס של המוח עכבר להנחות מיקוד12, לקדוח osteotomy בור באר, בגודל לגישה אלקטרודה, דרך הגולגולת.
6. לבודד את העצבים הסימפתטית כליות
- להתחבר האלקטרודה RSNA תיל (שלבים 1.1-1.3) 10 X קדם מגבר, מגבר microelectrode.
- לבודד את העצבים הכליות דרך חתך מאובחנת לפני, או אחרי, העכברוש מאובטח במסגרת stereotaxic. מקם את האלקטרודות RSNA ברגע העכברוש הוא במסגרת stereotaxic. להפוך את האזמל החתך המשתרעת 4-5 ס מ מתחת לצלעות לכיוון סימטרית, מעט לרוחב על עמוד השדרה. בלאנט לנתח את החתך כדי להמחיש את השרירים paraspinal.
- להשתמש במספריים לעשות חתך rostrocaudal שטחית מאוד 1-2 ס מ שם השומן פוגש את השריר. באמצעות applicators שקצהו כותנה, מורחים את השומן מן השריר להמחיש את הכליה. חשוב לא להיכנס לחלל הצפק.
- השתמש רטרקטורים בעדינות להפריד את הכליה השרירים paraspinal להמחיש את עורק הכליות ואת העורק הראשי. לא למתוח את כלי יתר על המידה כדי למנוע נזק העצבים כליות. השתמש 2 "x 2" גזה כרית כותנה טבול בתוך תמיסת מלח כדי להגן על הכליות מפציעה.
- תחת בהגדלה, לזהות את העצבים כליות בכיס של החתך. חבילות עצב גלויים בקלות הרבה ביותר בהזווית הנכונה שהוקמה על ידי אבי העורקים עורק הכליה. העצבים כליות בצע מקרוב את עורק הכליה העורקים לכליות.
- בחר קטע הצרור עצב שימוקמו על האלקטרודה הקלטה. בעדינות לנתח סיבי העצב מכלי שמסביב הרקמות/הקיבול באמצעות מלקחיים לנתח מיקרו.
- לאבטח את אלקטרודות RSNA ב בעל (למשל., סרטון תנין המצורפת עמדה תמיכה). להוריד את האלקטרודה לרמה של המקטע עצב. השתמש קרס עצב ותוציאי בעדינות על הקטע של עצב כליות על גבי האלקטרודה מבלי למתוח את העצב.
הערה: העצב צריכה לנוח בתוך שני "V" בצורת ווים בתוך הגדר uninsulated, במקביל העצב. החוטים אלקטרודה אסור לגעת בכל שאר רקמות, דם או נוזל הלימפה. - למלא את החתך עם שמן מינרלי כדי למנוע ייבוש העצב סימפטי כליות חשוף. השתמש קליפ הארקה עם קצה אחד על העור של החתך והשני צמוד לכלוב פאראדיי.
- כוונו את האות מגברים שימוש גבוהה - ו נמוך לעבור סינון (10 הרץ ו- 3 kHz). להתאים את הרווח עד ק' 10 כלול צג השמע כדי להעריך את דפוס המתפרצת של RSNA. להשתמש דגימה בשיעור הנע בין 2,000-10,000 הרץ4,5,6,7,8. השתמש של קצב הדגימה מוגברת כאשר מניפולציה CNS המשוערות לגרום תגובות סימפטי מהיר/קצר.
7. נתונים רשומה
- להעריך את איכות ההקלטה RSNA מאת לעורר את baroreflex עם זריקה בולוס של 1 מ"ל של תמיסת מלח או phenylephrine 10 µg/mL (ב 0.1 מ"ל) דרך הווריד. כמופיע באיור1, החדרת צריך להגביר את לחץ הדם ומעכבות RSNA. עליית לחץ הדם הממוצע של 60-80 מ מ כספית מספיקה sympathoinhibition כליות4,13,14.
- להתאים את מיקום האלקטרודות כדי לשפר את האות במידת הצורך. מיקום מחדש נדרש אם העצב אינו במגע עם שני ווים על האלקטרודה או כל נוזל רקמות, דם או לימפה נמצא בקשר עם החוטים.
הערה: לצורך שינוי מיקום מבוסס על מאפייני הפרשות עצב השמיעה.- אם להתפרצות RSNA לא מתרחשות המזמורים מחזור הלב, ואם אין כל הפרעה בהקלטה, ואז בזהירות למקם מחדש את האלקטרודה.
- כמו תנועות הנשימה יכול להשפיע גם על איכות ההקלטה RSNA, לשפר את האות על ידי בעדינות מתמקם האלקטרודה איפה תנועות שרירים לא לשבש את האלקטרודה במהלך הנשימה.
- ברגע מתקבל אות ברור, באבטחת האלקטרודה RSNA במקום על-ידי נסיגה שמן מינרלי ויישום של סיליקה ג'ל כדי לכסות את חיבור עצב/אלקטרודה בכיס של החתך. אל תזיז את החולדה לפני הג'ל הגדיר לחלוטין.
- לבצע מניפולציה CNS פרוטוקולים בזמן הקלטת ברציפות RSNA ואני מתכוון לחץ הדם בעורק. אם microinjector/pulser משמש עבור גזע המוח מניפולציות, אות לוגיקה ממכשיר זה יכול להיות מוחדרים ההקלטות RSNA/BP לתעד את התזמון של CNS מניפולציות.
- בתום הניסוי, לקבוע את רמת הרעש על ידי ריסוק העצב מקורב אל האלקטרודות הקלטה של סיליקה ג'ל בין השרירים בעמוד השדרה. שיא לפחות 30 s הערך "אפס" RSNA-4,-5,-6. כגישה חלופית לרעשים לכימות, לנהל חוסם ganglionic קצרת כגון אטרופין, hexamethonium, chlorisondamine או pentolinium tartrate8,15,16, 17.
- בזהירות להסיר את האלקטרודה RSNA ולהסיר עקבות של סיליקה ג'ל האלקטרודות תיל. לשמור את האלקטרודה לשימוש חוזר. כבה את המשדר טלמטריה ולהסיר אותו, דואגת שלא יגרמו נזק את קצה הקטטר.
8. המתת חסד (Transcardiac זלוף)
- לזהות את המיקומים של CNS מניפולציות על ידי הזרקת חומרי צבע או fluorochromes, יצירת נגעים electrolytic, או על ידי גילוי של ביטוי c-פוס.
- אם המוח ניתוחים ידרוש קיבעון, להכין את העכברוש transcardiac זלוף. להעריך את רפלקס הבוהן-קמצוץ כדי להבטיח החולדה יישאר עמוקות anesthetized. לספק הרדמה משלימות במידת הצורך. ביצוע זלוף transcardiac של paraformaldehyde מקבע ברדס fume.
התראה: Avid עור/עיניים מגרה. - הכנס אבובים משאבת זלוף, ראש הממשלה עם תמיסת מלח 0.9%.
- עושים חתך לרוחב 5-6 ס מ דרך העור דופן הבטן מיד מתחת לצלעות ופתח את חלל החזה. הפרד בזהירות את הכבד מהסרעפת. עושים חתך קטן בתוך הסרעפת באמצעות מספריים בוטה מעוקל. מזריקים 0.1 מ"ל של הפארין ישירות לתוך החדר השמאלי.
- עוברים מחט זלוף לתוך החדר השמאלי (מחט gavage פלדת אל-חלד עובד היטב עבור שלב זה) או ניקוב זה אל הלב או על ידי חיתוך חתך קטן באמצעות מספריים חדות, עובר את gavage מחט דרך אז הטיפ מוצגת דרך קיר של אבי העורקים (אבל לא צריך להגיע לקשת אבי העורקים). השתמש קליפ כירורגי או חשמל כדי לאבטח את המחט במקום.
- באמצעות משאבת אינפוזיה, לנהל 0.9% תמיסת מלח (טמפרטורת החדר). מיד ליצור חתך 2-3 מ מ באטריום ימין ליצירת פורקן רינס מלוחים. Not גזור העורקים. המשיכו על רינס מלוחים עד צבע שינויים בכבד מ אדום/חום צהוב חיוור, אינפוזיה של-400 מ ל מעל 2-3 דקות.
- עוצרים את המשאבה. לעבור את perfusate מקבע (למשל-, 10% פורמלין או 4% paraformaldehyde); להשרות 400 מ ל מעל 2-3 דקות מסירים את המוח ולאחסן את הדגימה בפתרון מקבע בן לילה ב 4 ° C לפני העברת הרקמות 30% סוכרוז (30 מ של מומס 100 מ ל תמיסת באגירה פוספט 0.1 M סוכרוז) לפחות 3 ימים או עד המוח כיורים , עבור cryoprotection לפני cryogenetic חלוקתה18.
9. ניתוח נתונים
- מלא-גל לתקן את RSNA raw להשיג הערכים המוחלטים. מלא-גל לתקן מקטע s 10 של אות רעש raw. חשוב לשלול כל מחקרים אשר הושפעו יחס אות לרעש נמוכה. במחקרים לכימות RSNA, חוקרים להחיל קריטריונים א-פריורי של דרישת אות רעש יחסי יעלה על 2:1 6:117,19,20.
- חישוב הממוצע לתקן RSNA עבור מקטעים שאינם חופפים (µV) ולהחסיר את אומדן הרעש (µV). בהתאם מטרות הניסוי, החוקרים ניתן לבחור מרווחי כגון 10 s (איור 1) או חישוב ס' 1 אומר באמצעות אפשרויות ניתוח waveform בתוכנה הפיזיולוגיות או ייצוא הנתונים לתוך גליונות אלקטרוניים כדי לחשב ממוצעים עבור מרווחי הזמן שנבחר.
- לנרמל מעבר בעלי חיים שונים, מבטאים את הערכים עבור ניתוח נוסף כמו לשנות האחוז מקו. השתמש סטטיסטיקה פרמטרית כדי לבצע השוואות קבוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגימה מדגם RSNA ולחץ הדם הקלטה של עכברוש מסקלין. מורדם. זריקה תוך ורידי של phenylephrine שימש לזירוז עליית לחץ הדם בעורק מתכוון לעורר את baroreflex ארעי sympathoinhibition4,6. כדי לכמת RSNA, RSNA raw היה לתקן, בממוצע עבור שאינם חופפים 10 s פלחי; אומדן הרעש היה המופחת בכל קטע.
איור 1: RSNA ולחץ הדם בתגובה להזרקת phenylephrine IV. RSNA raw (א) היה מלא-גל לתקן (B); לתקן כתוש "אפס" RSNA היא שמוצג שיבוץ C. חישוב שאינם חופפים ממוצעים s 10 (פחות רעש) (D). לעורר את baroreflex, 0.1 מ"ל של phenylephrine (1 µg/mL) היה מוזרק לווריד (ב חץ). החדרת בולוס elicited עלייה פתאומית BP וניגוד ארעית של RSNA. איור זה הותאמה מ פינק AM C דין, מר פסנתר, קארלי DW. Tegmentum pedunculopontine שולטת כליות העצבים הסימפתטית פעילות ופעילויות כך בחולדות מסקלין. מורדם. PLoS One. 2017; 12 (11): e01879564. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים למדידת RSNA כוללים: (1) הימנעות מתיחה של עורק הכליה ואת העצבים בעת הפרדת הכליה של השריר paraspinal בעת הנחת על קטע העצב על האלקטרודות הקלטה, לנתח בזהירות (2) סיבי העצב כליות מכלי הקיבול/הרקמה שמסביב, (3) להבטיח כי האלקטרודה חוטים הינם ללא רקמת דם או נוזל הלימפה, (4) מניעת העצב ממנו להתייבש על-ידי החלת שמן מינרלי העצבים כליות ואת סיליקה ג'ל ליחידה עצב-אלקטרודה. פתרון בעיות, חשוב להבטיח כי מערכת הקלטה מבוססת במידה מספקת. כדי לקבל אות RSNA ברור, המיקום של האלקטרודה ניתן להתאים בקפידה תוך כדי להמחיש ולהקשיב האות RSNA raw, לפני הטמעת ב סיליקה ג'ל. סיומו המוצלח של הניתוח התוצאה לאות RSNA יכול להיות מווסת על ידי מניפולציות CNS לניסויים שנמשך כמה שעות.
בעת פירוש התוצאות, החוקרים לשקול את השפעת ההרדמה על לחץ הדם בעורק מרושע, RSNA. פרוטוקול זה משתמש ברביטורט הרדמה (סודיום פנטוברביטל), אשר יכול להפחית את לחץ הדם בעורק מתכוון לשנות תגובות אוטונומי21. בהתאם הניסוי מטרות, ניסוחים להזרקה או שאיפת הרדמה (דרך האף-חרוט או מיכשור וציוד) אחרים יכולים להיות בשימוש22. חוקרים עשויים לשקול החלופות כגון urethane23 ואלפא-חי24. סוכנים אלה יש פחות השפעה על blunting רפלקסים לב וכלי דם, אבל יכול להוות פוטנציאל הסכנות הבריאותיות לחוקר.
בנוסף לשיטות המתוארות פרוטוקול זה, גישות אלטרנטיביות יש כבר מועסקים על ידי מעבדות אחרות עבור הקלטה של בדיית אלקטרודות. ניתן להקליט RSNA באמצעות נירוסטה4,9, כסף25או פלטינה26 תיל. בנוסף מרימים על עצב חשוף הקטע על החוט אלקטרודה, מדענים הקליטו בהצלחה monophasic ש-RSNA בקצות המרכזית לחתוך העצבים הסימפתטית כליות26. גמישות שונה בהתבסס על חוזק מתיחה של החוט (נמדד עם kPSI יחידות). חוט kPSI גבוה יותר הוא רך יותר אך שומרת על צורתה; חוט kPSI נמוך הוא גמיש יותר, פחות סביר לשבור כאשר כפופות, שוב ושוב. להקלטות RSNA, חשוב לבחור חוט כי ניתן בקלות התכופף לטאבים במהלך הקלטות. הכבל לא צריך להיות גמיש מדי, עושה את זה קשה ליצור ווים כדי למקם תחת העצב, אך לא נוקשה מידי. האחרון מגביר את הסיכון של מתיחות ופגיעה בעצבים. המעבדה שלנו משתמש נירוסטה עם kPSI 155-185.
גישות רבות לניתוח RSNA זמינים. במקום לכימות את הממוצעים עבור 10 s הקלטה פלחי וחישוב ההבדלים כמו האחוז השינוי, RSNA יכול להיקבע על ידי לכימות פרץ תדירות4,26,27. גישה זו עשויה להיות מועדפת כאשר רמות הבסיס של מגניטודות RSNA תגובות שונות בקרב חולדות מחקר15,26. גישה נוספת כרוכה תיקון של ומיזוג של האות RSNA; משרעת RSNA (נמדד ב- mV) מסוכם על מרווח נבחר של זמן (למשל., 20 ms)15,26. אינטגרטור מחיל מסנן נמוך-פאזי ומספק את משרעת פריקה הממוצע במהלך התפרצויות של פעילות העולה על הקבוע זמן (למשל., > 20 s)15,27. אותות משולבים שימושיים לבחינת את משרעת ושלב RSNA, אך גישה זו אינה מספקת מידע אודות שינויים מתנדנדות. תחום תדר ושיטות תחום הזמן הוחלו כאשר החוקרים בוחנים RSNA תנודות. הגישה שימוש תכוף עבור RSNA היא מהירה פורייה הטרנספורמציה (FFT), אשר מסווגת אות לתוך תנודות sinusoidal שלה, כל אחד עם משרעת ברורים, שלב20,26. FFT היא גישה שימושית בשביל לבחון את התפרצויות נמוך - ו בתדירות גבוהה ב- RSNA ועבור לומד אפנון והנשימה של האות RSNA.
השיטות של פרוטוקול זה חשובים למיעון היפותזות על המשמעות הפונקציונלית של CNS גרעינים. העצבים הסימפתטית כליות ישיר התקשורת העצבית בין מערכת העצבים המרכזית כליות, לכן, חריפה לשינויים RSNA מייצגים משתנה חשוב במחקר לב וכלי דם. הגדרת CNS מנגנוני ויסות יצוא סימפטי הוא אזור המחקר עדיפות, בהתחשב sympathoexcitation כליות הזה תורם פתופיזיולוגיה של המצגת קלינית של מחלות רבות (למשל., מחלת כליות כרונית, לב כשל, הפרעות בקצב הלב, סוכרת ו דום נשימה בשינה חסימתית)28,29. מדדים עקיפים של פעילות העצבים הסימפתטית (למשל., BP, השתנות קצב הלב, רמות קטכולאמין) אינם תמיד מתאימים למחקרים על המשמעות הפונקציונלית של CNS גרעינים. לכן, מדידה ישירה של RSNA ובלחץ עורקי רשע בחולדות ומורדמת מייצג שיטה ערך להגדרת פונקציונלית, מבחינה אנטומית במקורות הכלייתי aberrant סימפטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אן מ פינק הוא חבר של חבר הוועדה המייעצת הלקוח עבור נתונים מדעי בינלאומי.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר סיעוד (K99/R00NR014369).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
