Summary
Sempatik ve kardiyovasküler Yanıt Merkezi sinir sistemi (MSS) manipülasyonlar ölçme yöntemleri ilerleyen nörolojik için önemlidir. Bu iletişim kuralı ile ölçme ve böbrek sempatik sinir etkinliği (RSNA) (hayatta kalma olmayan) imzalat sıçanlarda akut değişiklikler miktarının bilim adamları yardımcı olmak için geliştirilmiştir.
Abstract
Böbrek sempatik sinir etkinliği (RSNA) ve ortalama arteriyel basınç kardiyovasküler ve otonomik araştırmada önemli parametreler şunlardır; Ancak, sınırlı kaynakları bilim adamları ölçme ve bu değişkenlerin analiz teknikleri yönetmenlik vardır. Bu iletişim kuralı RSNA ve imzalat sıçanlarda ortalama arter basıncı ölçüm yöntemlerini açıklar. Protokolü de merkezi sinir sistemi (MSS) manipülasyon için RSNA kayıtlar sırasında beyin erişmek için yaklaşımları içerir. RSNA kayıt tekniği ile uyumludur farmakolojik, optogenetic, veya MSS elektrik stimülasyon. Bir dedektif kısa vadeli (min h) otonomik yanıt anatomik olarak CNS çekirdeği ile ilişkilendirmek için hayatta kalma sigara deneylerde ölçtüğünüzde yararlı bir yaklaşımdır. Yaklaşım içinde rats RSNA kronik (hayatta kalma) kayıtları elde etmek için kullanılmak üzere tasarlanmamıştır. RSNA, ortalama deşarj RSNA doğrultucu ve ortalama arteriyel basınç olabilir sayılabilir ve daha fazla parametrik istatistik testleri kullanılarak analiz. Venöz erişim, ortalama arteriyel basınç telemetrically kayıt ve beyin fiksasyon gelecekteki histolojik analizler için edinme yöntemleri de makalesinde açıklanmıştır.
Introduction
Kalp-damar sisteminin otonom kontrolü hakkında önceden klinik keşifler hipertansiyon, kalp yetmezliği ve kronik böbrek hastalığı gibi hastalıkları yönetme stratejileri bilgilendirmek. Sempatik sinir sistemi ve düşük kardiyak vagus aşırı aktivite yüksek kan basıncı (tansiyon)1olarak katkıda bulunur. Kronik olarak yükseltilmiş böbrek sempatik çıkış katekoiamin salgılanmasını artırır ve kalp-damar/böbrek sistemleri2,3zararlı sonuçları ile renal kan akımı azalır. Otonomik disfonksiyon için önde gelen nörobiyolojik yolları tanımlamak için çalışmalar Rodents nasıl düzenleyen merkezi sinir sistemi (MSS) nöronlar sempatik parametreleri belirlemek için önemlidir. Böbrek sempatik sinir etkinliği (RSNA) ölçme hakkında teknik bilgiler sağlamak için bu protokolü amacı olduğunu ve BP ve yanıt CNS manipülasyonlar imzalat sıçanlarda akut sempatik değişiklikleri miktarının teknikleri anahat.
Akut (hayatta kalma olmayan) RSNA ölçümleri (h kalıcı min) bilim adamları MSS araştıracağını farmakolojik, elektrikle, ya da optogenetically içinde belirli çekirdek işlevlerini belirlemek için fareler anestezi olduğunda yararlıdır. Bu yöntemler, yalnız çekirdek, periaqueductal gri, gibi yapıları kullanarak pedunculopontine tegmentum ve rostral ventrolateral medulla nörobiyolojik yolları sempatik parametreleri4düzenleyen tanımlamak için araştırdık, 5,6,7. Bu yaklaşım araştırılması için CNS hedefler belirlemek için önemlidir otonomik disfonksiyon8,9kronik modellerinde daha fazla. Bu deneyler tamamlamak için havya, cerrahi mikroskop, stereotaksik çerçeve, elektrot amplifikatör ve ses monitör laboratuvar gerektirir. Elektriksel gürültü için katkıda bulunan etkenleri bağlı olarak laboratuvarda mevcut, cerrahi/kayıt alan RSNA kayıt elektriksel gürültü azaltmak kafes/kayış topraklama bir Faraday gerektirebilir. Beyin analizleri doku fiksasyon gerektiriyorsa, perfüzyon pompa ve duman hood gereklidir. Veriler sayısallaştırılmış ve farklı analiz seçenekleri ve telemetric sinyalleri dahil etmek için uyumlulukları ile birden çok fizyolojik yazılım/veri toplama (analog-dijital çevirici) adet4,5, kullanarak kaydedilen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntemleri açıklanan Chicago Illinois Üniversitesi'nde kurumsal hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. iki kutuplu RSNA elektrotlar oluşturun
- Elektrot oluşturmak için yaklaşık 18 mm uzun paslanmaz çelik tel her iki parçalar kesin. Yaklaşık 15 mm uzun Boru polietilen (PE-50) bir parça kesti. Tel tel her iki tarafın çıkıntılı bırakarak borulama, içine iki adet yem.
- Yalıtım tellerin uçları kaldır; 2-3 mm maruz tel bırakarak teller kırpın. Bir ucunda, Erkek pim maruz tel üzerinden sarılmış. Tel için güvenli bir şekilde pins lehim, pins bir bağlayıcı şerit içinde güvenli ve epoksi ile bağlantı kapsar.
Not: lehimleme önler alternatif bir yaklaşım hızlı bağlanmak/release timsah klipleri kullanmaktır. - Elektrot ters ucunda yalıtım 2-3 mm maruz tel bırakarak tellerin uçları kaldırın. "Küçük V yalıtılmamış dikkat edin, kanca şeklinde" oluşturmak için tel'in bu bölümünü viraj.
Not: Bu böbrek sempatik sinir ile temas halinde olacak elektrot bölümüdür. Sıvı tüp girmesini önlemek için bu amaçla mühürlemek önemlidir. Silikon veya epoksi etkin bir şekilde kullanılabilir.
2. yönetmek anestezi ve cerrahi siteler hazırlamak
- Anestezi bir erkek Sprague Dawley rat (yaş 9-11 hafta, 150-400 g ağırlığında) için yönetmek. Fentobarbital sodyum yönetmek 50 mg/kg mayi (IP) enjeksiyonu ile. Ameliyat sırasında anestezi istikrarlı bir uçak değerlendirmek için her 15 dk ve gerektiği gibi yeniden doz anestezi ayak-çimdik refleks denetleyin.
Not: Fentobarbital sodyum (Nembutal) önceki çalışmalarda RSNA4,5,6modülasyonla engel olmadan sürekli uçağa anestezi elde etmek için kullanılmıştır. Bu nedenle bu protokolü hayatta kalma sigara için hiçbir kurtarma/post-izleme süresi operative cerrahidir. - Hayvan Kurulusları esaslarına göre cerrahi site hazırlamak (i.e., sıçan karın, sırt ve kafa tıraş; % 10 povidone-iyot solüsyonu ile cilt temizlemek; göz kayganlaßtırıcı; uygulamak ve fareyi bir ısıtma yastığı yer). Vücut ısısı 37 ° C'de deneyler sırasında korumak.
3. cannulate Femoral ven (intravenöz erişimi için)
- Heparin (20 adet/mL ulaşmak için) % 0,9 steril serum fizyolojik için ekleyin. 1 mL şırınga heparinized serum fizyolojik ile 22 G iğne ile doldurun. PE-50 boru 15 cm iğne ve dolgu boru çözüm ile bağlayın.
- Sırtüstü yatan fare ile 2 cm yatay kesi kasık bölgesi ile oluşturun. Pamuk uçlu uygulayıcıları kullanarak, femoral ven ve arter duyurmak bağ dokusu incelemek. Belgili tanımlık kesme açık tutmak için ya tek kanca elastik bant ve küçük hemostats kullanmak için ipek ile cerrahi alan güvenli cerrahi konaklamalar geçerli.
- Hemostats bir kateter uygulayıcıya10olarak hizmet için 90 ° açıyla 22 G iğne ucu eğmek için kullanın.
- Mikroskop altında gemiler görselleştirin. Hafifçe eğimli forseps kullanarak arter ve ven ayırın. Yer iki 12 cm uzunluğunda 5-0 ipek dikiş altında ven (bir distal ve proksimal); dikişi arter altında aynı şekilde yerleştirin.
- Ven doldurmak için distal (alt) dikiş kravat; ipek teyp veya küçük hemostats kullanarak cerrahi alan için bu dikiş kenarlarını güvenli. Yavaşça ven gergin çekin ama kuvvet ile değil çok gemi giyecekler. Cerrahın dominant el için dikey ven getirin.
- Gevşek bir overhand yarım düğüm proksimal dikiş kısaca ven doldurmak için kullanın. Hassas kan durdurucu sargı forseps ile hafifçe kan akımı doldurmak için bu dikiş kelepçe. 22 G iğne ile bükülmüş ucunu dominant olmayan elinde tutmak; Tüp dominant el kullanarak forseps ile kucaklayışını.
- Ven kateteri uygulayıcıya (adım 3.3) ile küçük bir delik delik ve PE-50 boru (heparinized serum önceden doldurulmuş) geminin yerleştirin; bükülmüş iğne açılış gemi açık tutmak için ve kateter ucu gemi10konumlandırma yardımcı olmak için kullanın.
- Proksimal dikiş serbest bırak ve yavaşça damar içine heparinized serum 0.2 mL sifonu; kateter ilerlemek. Uygun yerleşim sağlamak için damardan kan geri kontrol edin. Proksimal düğüm tamamlamak ve tüp distal dikiş kravatla güvenli ven içinde.
- Venöz erişim deneyler sırasında kan toplama ve tamamlayıcı anestezi veya ilaçlar yönetmek için kullanın. Eğer gerekli olacak düzenli intravenöz infüzyon ve kan örnekleme bir 3-yönlü bağlantı dahil. Zararlı toe-çimdik refleks her 15dk anestezi titre denetleyin.
4. Ortalama arter basıncının izlenmesi için Femoral arter cannulate
- Mikroskop altında arter görselleştirin. Benzer yöntem venöz cannulation için kullanılan, distal dikiş (adım arter; doldurmak için 3,4) bağla ipek bant ile cerrahi alan için bu dikiş kenarlarını güvenli ve arter cerrahın dominant el için dikey pozisyon.
- Bir basınç dönüştürücü/infüzyon sistemi kullanıyorsanız arteryel erişim
- Basınç dönüştürücü/boru 500 mL % 0,9 serum fizyolojik çanta için bağlayın. Boru ile serum, tüm kabarcıklar, kaldırma Temizleme ve çanta sistem baskı yapmak için basınç uyarıcı çantanın içine yerleştirin.
- Adım 3. 1'de açıklandığı gibi 1 mL şırınga heparinized serum fizyolojik ile 22 G iğne ile doldurun ve PE-50 15 cm iğne (floş heparinized serum boru) bağlanın.
- Gevşek bir yarım düğüm proksimal dikiş kısaca arter doldurmak için kullanın. Kateter uygulayıcıya (adım 3.3) Sigara dominant elinde tutmak; Gemi cannulation forseps dominant el ile PE-50 distal ucu tut. Bir delik arter ile bükülmüş 22 G iğne ponksiyon ve kanül geminin yerleştirin.
- Proksimal dikişi, yavaşça floş heparinized serum 0.2 mL arter ve önceden kateter mümkün olduğunca serbest bırakın. Arteryel kan uygun yerleşim sağlamak için dönüş için kontrol edin. Proksimal düğüm tamamlamak ve tüp distal dikiş kravatla güvenli arter içinde. Arter hattı basınç dönüştürücü/boru için bağlayın.
Not: Tüp distal kısmını arteryel yolun güvenliğini sağlamak için sıçan hindlimb kaydetmiş. Gemi cannulation için alternatif bir yaklaşım Jespersen ve arktarafından anlatılan.; dikiş için güvenli daha tüp ve yaklaşım kesi, tutkal-daha doğrusu yaymak için ekartör kullanarak onların iletişim kuralı farklıdır 11 bükülmüş iğne uygulayıcıya içermez.
- Telemetri kullanıyorsanız arteryel erişim
- Arteryel cannulation önce yüksek büyütme altında basınç algılamalı kateter bakarak kontrol edin. Kateter kabarcıklar/enkaz serbest olduğundan ve sağlam bir menisküs (proksimal) arasında sıvı dolu olduğundan emin olun ve (distal) bileşenleri jel dolu. Her implantasyon öncesinde kateterin distal uç jel dolum. Bir mıknatıs kullanarak verici açmak; Mükemmel yerleşim katlanmak için ameliyat sırasında kan basıncı İzleyicisi.
- Gevşek bir overhand yarım düğüm proksimal dikiş kısaca femoral arter doldurmak için kullanın. Kateter uygulayıcıya (adım 3.3) Sigara dominant elinde tutmak. Jel ucundan yerinden önlemek için gemi cannulation forseps ile telemetri birim kanül ucu tut.
- Bir delik arter ile bükülmüş 22 G iğne ponksiyon ve jel ucundan yerinden önlemek için gemi cannulation forseps kullanarak arter kanül yerleştirin. Kanül mümkün olduğu kadar ilerlemek. Proksimal ve distal dikiş bağları kullanarak, basınç kateter güvenli.
- Vücut içinde belgili tanımlık kesme için bitişik kanadını telemetri implantın sokmak ve 4-0 naylon sütür kesici iğne üzerinde kullanarak bu kesi kapatın. Pil ömrü tasarruf etmek için kayıt sürelerin mıknatıs tarafından telemetri aygıtlar kapanır.
5. pozisyon sıçan beyin erişmek için stereotaksik cerrahi çerçeve
- Yavaşça fare stereotaksik cerrahi çerçeve yüzükoyun sígara içine taşıyın.
- Sıçan kulak barlar arasında konumlandırın ve lambda ve bregma yüksekliği eşitlemek için kesici bar ayarlayın. Konumlandırma sıçan zorlanma, ağırlık ve mekanlar CNS hedeflerin üzerinde bağlı olabilir.
- Orta çizgi üzerinden kesme 2 cm rostrocaudal neşter kafa derisi olun. Pamuk uçlu uygulayıcıları, sıkıca bağ dokusu kafatası yüzeyinden çıkarmak istimal. Hidrojen peroksit bregma, lambda ve orta hat dikiş görselleştirme yardımcı olmak için kafatasını uygulanır.
- Bir sıçan beyin atlas kullanarak hedefleme12Kılavuzu, burr deliği osteotomi ulaşmak için kafatasını üzerinden elektrot erişim için ölçekli.
6. böbrek sempatik sinirler yalıtma
- Tel RSNA elektrot (adım 1.1-1.3) 10 X öncesi amplifikatör ve elektrot amplifikatör bağlamak.
- Önce Retroperitonal bir kesi yoluyla renal sinirler yalıtmak veya sonra fare stereotaksik çerçevede sabitlenir. Fareyi stereotaksik çerçevede olduğunda RSNA elektrotlar getirin. Bir neşter kesi 4-5 cm kaudal yönde omurga için biraz yan kaburga altında uzanan olun. Blunt paraspinal kas görselleştirmek için belgili tanımlık kesme parçalara.
- Makas yağ kas buluştuğu bir çok yüzeysel 1-2 cm rostrocaudal giriş yapmak için kullanın. Pamuk uçlu uygulayıcıları kullanarak, uzak böbrek görselleştirmek için kas yağ yayıldı. Peritonal boşluk değil önemlidir.
- Çok yavaşça böbrek renal arter ve abdominal aort görselleştirmek için paraspinal kas ayırmak için kullanın. Aşırı renal sinirler zarar görmesini önlemek için gemiler germeyin. Salin batırılmış bir 2 "x 2" pamuk gazlı bez takımını böbrek yaralanmalara karşı korumak için kullanın.
- Yüksek büyütme altında kesi cebinde renal sinirler tanımlayın. Sinir demetleri en kolay aorta ve renal arter oluşturduğu dik açı görünür. Renal sinirler, böbrekler aort renal arter yakından takip.
- Kayıt elektrot yerleştirilir sinir demeti bir parçasını seçin. Yavaşça sinir lifleri gemisinden çevreleyen doku/mikro-anatomi Cımbız kullanarak incelemek.
- Tel RSNA elektrot bir tutucu güvenli (Örn., bir timsah klip bağlı bir destek stand). Elektrot sinir segment düzeye indirin. Bir sinir kanca yavaşça sinir germe olmadan elektrot üzerine böbrek sinir parçası kaldırmak için kullanın.
Not: Sinir içinde "kanca yalıtılmamış tel, sinir için paralel şeklinde her iki V" dinlenmelisin. Elektrot tel diğer doku, kan veya lenf sıvısı dokunma gerekir. - Belgili tanımlık kesme maruz böbrek sempatik sinir kuru olmasını önlemek için mineral yağ ile doldurun. İle belgili tanımlık kesme ve diğer Faraday kafesi bağlı deri bir ucunda bir topraklama klibi kullanın.
- Yüksek ve düşük (10 Hz ve 3 kHz) filtreleme geçiş kullanarak amplifikatörler sinyali doğrudan. 10 K. Ekle RSNA patlama desen değerlendirmek için bir ses monitör kadar kazanç ayarlayın. 2.000-10,000 Hz4,5,6,7,8arasında değişen örneklendirme oranı kullanın. CNS manipülasyon hızlı/kısa sempatik yanıt neden olan bir yüksek örnekleme oranı kullanın.
7. kayıt verileri
- İntravenöz bolus enjeksiyon 1 mL serum fizyolojik veya 10 µg/mL phenylephrine (içinde 0.1 mL) ile baroreflex çağrıştıran tarafından RSNA kayıt kalitesini değerlendirmek. Şekil 1' de gösterildiği gibi infüzyon kan basıncı artırmak ve RSNA inhibe. 60-80 mmHg ortalama arteriyel basınç artışı böbrek sympathoinhibition4,13,14için yeterlidir.
- Gerekirse sinyallerinin geliştirilmesi için elektrotlar konumunu ayarlamak. Yeniden konumlandırma sinir her iki elektrot kanca ile temas halinde değilse veya herhangi bir doku, kan veya lenf sıvısı ile temas teller ise gerekli değildir.
Not: yeniden konumlandırma gereğini sinir deşarj işitsel özelliklerine bağlıdır.- Eğer RSNA patlamaları deliği kalp döngüsü ile gerçekleşmiyor ve kayıt, herhangi bir müdahale eğer elektrot dikkatli bir şekilde konumlandırma.
- Solunum hareketleri de RSNA kayıt kalitesini etkileyebilir, sinyal yavaşça elektrot nerede kas hareketleri elektrot sırasında nefes bozmak değil bir konuma taşıyarak geliştirmek.
- Net bir sinyal alındığında, mineral yağ çekilmesi ve sinir/elektrot bağlantı kesik cebinde kapsayacak bir Silis jeli uygulayarak RSNA elektrot yerde güvenli. Önce jel tamamen belirledi fareyi hareket ettirmeyin.
- CNS manipülasyon protokolleri sürekli RSNA kaydederken gerçekleştirmek ve arteriyel basınç demek. Microinjector/nabız beyin sapı manipülasyonlar için kullanılıyorsa, bu cihaz bir mantık sinyal CNS manipülasyonlar zamanlaması belgelemek için RSNA/BP kayıtlar tanıttı olabilir.
- Deneme tamamlandığında gürültü seviyesi sinir proksimal silika jel ve spinal kas arasında kayıt elektrotları için kırma tarafından belirler. Bu "sıfır" değer RSNA4,5,6için kayıt en az 30 s. Sayısal ses için alternatif bir yaklaşım atropin, hexamethonium, chlorisondamine veya pentolinium tartarat8,15,16, gibi bir kısa etkili ganglionic pencere engelleyicisi yönetmek 17.
- Dikkatle RSNA elektrot kaldırmak ve herhangi bir iz silika jel tel elektrot kaldırın. Elektrot yeniden kullanmak için kaydedin. Telemetri vericisi ve, kateter ucu zarar vermemeye dikkat çekici çıkarın.
8. ötenazi (Transcardiac perfüzyon)
- CNS manipülasyonlar konumları boya veya fluorochromes, elektrolitik lezyonlar, oluşturma enjekte veya c-fos ifade algılama belirleyin.
- Beyin analizleri fiksasyon gerektiriyorsa, fare transcardiac perfüzyon için hazır olun. Fareyi derinden imzalat kalmasını sağlamak için ayak-çimdik refleks değerlendirmek. Tamamlayıcı anestezi gerekirse sağlayın. Transcardiac perfüzyon paraformaldehyde sabitleştirici, duman mahallede gerçekleştirin.
Dikkat: Hevesli cilt/göz tahriş eder. - Perfüzyon pompa ve Başbakan % 0,9 normal salin ile tüp takın.
- 5-6 cm yanal kesi cilt ve hemen altında göğüs kafesi karın duvarı üzerinden yapmak ve göğüs boşluğu açın. Dikkatli bir şekilde karaciğer diyaframdan ayırın. Küçük bir insizyon attım eğri künt makas kullanarak diyafram olun. 0.1 mL heparin doğrudan sol ventrikül enjekte.
- Ya bunu kalbine delinme tarafından bir perfüzyon iğne (Paslanmaz çelik sonda ile besleme iğne eser de bu adım için) sol ventrikül içine geçmek veya ucu ile görünür olacak şekilde küçük bir insizyon attım keserek keskin makas kullanarak ve gavaj geçen aracılığıyla iğne aort duvarında (ama aort ulaşmak gerekir). Bir cerrahi ya da elektrik klibi yer iğnede güvenliğini sağlamak için kullanın.
- Bir infüzyon pompa kullanarak, % 0,9 normal salin (Oda sıcaklığında) yönetme. Hemen bir 2-3 mm kesi tuzlu durulama için bir çıkış oluşturmak için sağ atrium oluşturun. Azalan aort kesmeyin. Kırmızı/kahverengi soluk sarı, yaklaşık 400 mL bir infüzyon karaciğer değişiklikleri renge kadar tuzlu durulama devam üzerinde 2-3 dk.
- Pompa kes. Perfusate için sabitleştirici geçiş (Örn., % 10 formalin veya %4 paraformaldehyde); 400 mL demlemek üzerinde 2-3 dk. beyin kaldırmak ve doku % 30 sukroz (30 mL 100 mL 0.1 M fosfat tamponlu tuz çözünmüş sükroz) için en az 3 gün veya beyin lavabo kadar aktarmadan önce numune sabitleştirici çözüm gecede 4 ° C'de depolayın , daha önce18kesit cryogenetic cryoprotection için.
9. veri analiz
- Tam dalga doğrultucu mutlak değerler elde etmek için ham RSNA. Tam dalga doğrultucu 10 s kesimini de ham ses sinyali. Düşük sinyal-gürültü oranı tarafından etkilenen herhangi bir çalışmaları dışlamak önemlidir. RSNA miktarının çalışmalarda, müfettişler gibi 2:1 6:117,19,20aşmak için sinyal noise oranları için gerektiren bir temanın ölçütleri uygulanan.
- Ortalama RSNA üst üste kesimleri (µV) düzeltilmesi ve gürültü Tahmini (µV) çıkarmak hesaplamak. Denemenin amacı bağlı olarak, 10 gibi aralıklarla müfettişler seçebilirsiniz s (Şekil 1) veya 1 s. Calculate anlamına gelir fizyolojik yazılımında dalga çözümleme seçeneğini kullanarak veya elektronik tablo veri verme ortalama için hesaplamak için Seçili zaman aralıkları.
- Farklı hayvanlar arasında normalize etmek yüzde satır taban çizgisinden değiştirmek gibi değerler daha ayrıntılı bir çözümleme için hızlı. Parametrik istatistik grup karşılaştırmaları yapmak için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 bir örnek RSNA ve BP kaydından tedavisiydi anestezi sıçan göstermektedir. Phenylephrine bir İntravenöz enjeksiyon ortalama arteriyel basınç artışı teşvik ve baroreflex ve geçici sympathoinhibition4,6uyandırmak için kullanıldı. RSNA ölçmek için ham RSNA doğrultucu ve üst üste 10 s segmentler için Ortalama olarak; gürültü tahmin her kesiminden düşülen.
Şekil 1: RSNA ve BP yanıt olarak phenylephrine enjeksiyon IV. Ham RSNA(a)tam-dalga (B); Doğrultucu yapıldı. ezilmiş "sıfır" doğrultucu RSNA ilave Cgösterilir. Sigara üst üste 10 s ortalamaları (gürültü) eksi hesaplanan (D). Baroreflex uyandırmak için phenylephrine (1 µg/mL) 0.1 mL intravenöz (oku) enjekte ettiler. Bolus infüzyonu BP ve geçici RSNA inhibisyonu ani bir artış elde edildi. Bu rakam Fink AM, Dean C, piyano Bay, Carley DW uyarlanmıştır. Pedunculopontine tegmentum böbrek sempatik sinir etkinliği ve sıçanlarda tedavisiydi anestezi kardiyorespiratuvar faaliyetleri kontrol eder. PLoS bir. 2017; 12 (11): e01879564. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RSNA ölçmek için önemli adımlar şunlardır: (1) kaçınarak renal arter ve sinirler, böbrek paraspinal kas ayıran zaman germe ve sinir segment üzerinde kayıt elektrotları yerleştirirken, böbrek sinir lifleri (2) dikkatle anatomi çevreleyen doku/gemi, doku, kan veya lenf sıvısı ve (4) önlenmesi sinir böbrek sinir ve silika jel sinir-elektrot birimine madeni yağ uygulayarak kurutma üzerinden ücretsiz (3) sağlanması bu elektrot teller var. Sorun giderme için kayıt sistemi yeterince topraklı olduğuna emin olmak önemlidir. Net bir RSNA sinyal elde etmek için elektrot konumunu dikkatlice görselleştirme ve silika jel içinde katıştırma önce ham RSNA sinyal, dinleme sırasında ayarlanabilir. Ameliyat başarıyla tamamlanması birkaç saat süren deneyleri için CNS manipülasyonlar tarafından modüle bir RSNA sinyal sonuçlanır.
Sonuçları yorumlama, müfettişlerin anestezi etkisi ortalama arter basıncı ve RSNA düşünmelisiniz. Ortalama arter basıncı azaltmak ve otonomik yanıtları21değiştirebilecek barbitürat anestezi (Fentobarbital sodyum), bu iletişim kuralını kullanır. Deney bağlı olarak amaçları, diğer enjekte edilebilir formülasyonları veya inhalasyon anestezi (burun konisi veya trakestomi) üzerinden kullanılan22olabilir. Araştırmacılar üretan23 ve Alfa-chloralose24gibi alternatifler düşünebilirsiniz. Bu aracılar kardiyovasküler refleksleri blunting üzerinde daha az etkisi var ama araştırmacı için potansiyel sağlık riskleri doğurabilir.
Bu protokol için açıklanan yöntemlere ek olarak, alternatif yaklaşımlar kayıt ve elektrotlar imalatı için diğer laboratuvarlar tarafından istihdam edilmiştir. RSNA paslanmaz çelik4,9,25gümüş veya platin26 tel kullanarak kaydedilebilir. Elektrot tel üzerine maruz sinir segment kaldırma ek olarak, bilim adamları başarıyla RSNA merkezi ucunda böbrek sempatik sinirler26kesmek monophasic kaydettik. Esneklik (kPSI birimleriyle ölçülür) Tel çekme dayanımı göre farklı. Daha yüksek kPSI Tel daha kırılgan ama şeklini korur; düşük kPSI Tel daha esnek ve daha az zaman bükülmüş, hkr kırmak olasılığı var. RSNA kayıtları için kolayca eğildi ve kayıtları sırasında yeniden konumlandırılmış bir tel seçmek önemlidir. Tel çok esnek, yapım o sinir altında konumlandırmak için kanca oluşturmak zor, ama çok sert olmamalıdır. İkinci germe ve sinirler zarar riskini artırır. Bizim Laboratuvar paslanmaz çelik tel ile 155-185 kPSI kullanır.
Pek çok yaklaşım RSNA analizi için kullanılabilir. Tercihan--dan ortalama 10 s kaydı kesimleri için miktarının ve farkı yüzde olarak hesaplama değişikliği, RSNA patlama frekans4,26,27miktarının tarafından belirlenebilir. Temel düzeyleri ve büyüklükleri RSNA tepkilerin de bir çalışma15,26, fareler arasında farklı olduğu zaman bu yaklaşım tercih edilebilir. Başka bir yaklaşım düzeltme ve entegrasyon RSNA sinyal içerir; (mV içinde ölçülen) RSNA genlik bir zaman seçili aralığındaki toplanır (Örn., 20 ms)15,26. Bir integral alıcı bir düşük fazlı filtre uygular ve etkinlik zaman sabit aşan patlamaları sırasında ortalama deşarj genlik sağlar (Örn., > 20 s)15,27. Entegre sinyallerin genlik ve RSNA aşaması incelenmesi için yararlıdır, ancak bu yaklaşım salınım değişiklikler hakkında bilgi sağlamaz. Araştırmacılar RSNA salınımlarını incelediğinizde frekans etki alanı ve saat etki alanı Yöntemler uygulandı. Sık kullanılan RSNA için hangi bir sinyal onun sinüsoidal salınımlarını sınıflandırır, Hızlı Fourier dönüşümü (FFT), her bir farklı genlik ve faz20,26yaklaşımdır. FFT RSNA düşük ve yüksek frekans patlamaları incelenmesi için solunum ve kalp modülasyon RSNA sinyal çalışmak için yararlı bir yaklaşımdır.
Bu iletişim kuralı yöntemlerdeki CNS çekirdeklerin işlev önemi hakkında hipotezler adresleme için önemlidir. Böbrek sempatik sinirler CNS ve böbrek arasındaki sinirsel iletişim doğrudan ve bu nedenle, akut RSNA değişimler kardiyovasküler araştırma önemli bir değişkeni temsil eder. CNS mekanizmaları sempatik çıkış düzenleyen tanimlar o böbrek sympathoexcitation katkıda patofizyolojisi ve birçok hastalığın klinik sunumunu düşünüyor bir öncelikli araştırma alanı (Örn., kronik böbrek hastalığı, kalp başarısızlık, aritmiler, diabet ve obstrüktif uyku apne sendromu)28,29. Sempatik sinir aktivitesinin dolaylı tedbirler (Örn., kan basıncı, kalp hızı değişkenliği, katekoiamin düzeyleri) her zaman CNS çekirdeklerin işlev önemi üzerinde çalışmalar için uygun değildir. Bu nedenle, doğrudan ölçüm RSNA ve ortalama arteriyel basınç imzalat sıçanlarda işlevsel olarak, anatomik olarak anormal böbrek sempatik işlevi kaynakları tanımlamak için değerli bir yöntemi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Anne M. Fink veri Bilimler International için Müşteri Danışma Kurulu üyesidir.
Acknowledgments
Bu çalışmada hemşirelik araştırma (K99/R00NR014369) için Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen bir durumdu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel wire | A-M Systems; Sequim, WA | 791000 | RSNA electrode |
| Polyethylene (PE-50) tubing | VWR; Radnor, PA | 63019-048 | RSNA electrode; vessel cannulation |
| Miniature pin connector | A-M Systems; Sequim, WA | 520200 | RSNA electrode |
| Crimping tool | Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL | M22520 | RSNA electrode |
| Connector strip | Amphenol; Clinton Township, MI | 221-2653 | RSNA electrode |
| J-B Kwik Epoxy | J-B Weld, Sulphur Springs, TX | 8270 | RSNA electrode |
| Silicone | Permatex; Hartford, CT | 2222 | RSNA electrode |
| Heparin sodium; Injectable (10 mL vial, 1000 U/mL) | KV Veterinary Supply; David City, NE | P03466 | Venous line patency |
| Phenylephrine HCl; Injectable (1 mL vial; 10 mg/mL) | ACE Surgical Supply; Brockton, MA | 950-6312 | Testing renal sympathoinhibition |
| Single-hook elastic surgical stays | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 72-2595 | Incision |
| Silk surgical tape | 3M, Minneapolis, MN | 1538-0 | Secure surgical stays |
| Needles, 20 G | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | Z192554-100EA | Vessel cannulation |
| Dumont #7 curved forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11274-20 | Vessel cannulation |
| 5-0 silk suture ties | Braintree Scientific; Braintree, MA | SUT-S 106 | Vessel cannulation |
| Delicate hemostatic forceps | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-7117 | Vessel cannulation and RSNA surgery |
| Crile Hemostatic forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 13004-14 | Needle bending |
| Telemetry transmitter | Data Sciences International; Minneapolis, MN | PA-10 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| Re-gel syringe | Data Sciences International; Minneapolis, MN | 276-0038-001 | Transmitter reuse (telemetry) |
| Disposable pressure transducer | Transpac; San Clemente, CA | MI-1224 | Mean arterial pressure monitoring |
| Clear-Cuff pressure infuser | MILA International Inc.; Florence, KY | 2281339 | Mean arterial pressure monitoring |
| Vessel cannulation forceps | Fine Science Tools; Foster City, CA | 00574-11 | Catheter insertion |
| Black monofilament nylon 4-0 suture on reverse cutting needle | McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA | S661GX | Secure telemetry transmitter |
| Telemetry receiver | Data Sciences International; Minneapolis, MN | RPC-1 | Mean arterial pressure monitoring (telemetry) |
| LabChart Pro (software), PowerLab (acquisition hardware) | AD Instruments; Colorado Springs, CO | ML846, MX2 matrix 2.0 (Compatible with Data Science International telemetry) | 3 options for software/acquisition hardware |
| SciWorks (software), DataWave (acquisition hardware) | DataWave Technologies, Loveland, CO | N/A | |
| Spike 2 (software), Micro1401-3 | Cambridge Electronic Design Ltd., London UK | 1401-3 | |
| Micro-drill | Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD | RS-6300 | CNS surgery |
| Stereotaxic surgery frame | Stoelting; Wood Dale, IL | 51600 | CNS surgery |
| Microelectrode amplifier with 10X pre-amplifier | A-M Systems; Sequim, WA | 1800-2 | RSNA recording |
| Retractors | Fine Science Tools; Foster City, CA | 17009-07 | RSNA surgery |
| Micro-dissecting tweezers | Fine Science Tools; Foster City, CA | 11251-10 | RSNA surgery |
| Micro-hook | Fine Science Tools; Foster City, CA | 10064-14 | RSNA surgery |
| Mineral oil | Fisher Scientific; Waltham, MA | 8042-47-5 | RSNA surgery |
| Audio monitor | A-M Systems; Sequim, WA | 3300 | RSNA surgery |
| Silica gel | Wacker, Munchen; Germany | RT601A-B | RSNA surgery |
| Electrical clips | Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland | EB0283-000 | Grounding or securing perfusion needle |
| Bonn scissors, straight/sharp points | Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD | RS-5840 | Perfusion |
| Gavage needle | Harvard Apparatus; Holliston, MA | 75-0286 | Perfusion |
| Masterflex perfusion pump | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 7524-10 | Perfusion |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL | 96410-15 | Perfusion |
| Formalin (10% buffered solution; 4 L) | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | HT501128 | Perfusion |
| Sucrose | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | S0389 | Cryoprotection |
References
- Mancia, G., Grassi, G. The autonomic nervous system and hypertension. Circulation Research. 114 (11), 1804-1814 (2014).
- Kannan, A., Medina, R. I., Nagajothi, N., Balamuthusamy, S. Renal sympathetic nervous system and the effects of denervation on renal arteries. World Journal of Cardiology. 6 (8), 814-823 (2014).
- Johns, E. J., Kopp, U. C., DiBona, G. F. Neural control of renal function. Comprehensive Physiology. 1 (2), 767 (2011).
- Fink, A. M., Dean, C., Piano, M. R., Carley, D. W. The pedunculopontine tegmentum controls renal sympathetic nerve activity and cardiorespiratory activities in Nembutal-anesthetized rats. PLoS One. 12 (11), e0187956 (2017).
- Dean, C. Endocannabinoid modulation of sympathetic and cardiovascular responses to acute stress in the periaqueductal gray of the rat. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), R771-R779 (2011).
- Seagard, J. L., et al. Anandamide content and interaction of endocannabinoid/GABA modulatory effects in the NTS on baroreflex-evoked sympathoinhibition. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H992-H1000 (2004).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: Role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: Surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (10), H1407-H1416 (2013).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Experimental Physiology. 87 (1), 33-39 (2002).
- Huetteman, D. A., Bogie, H. Direct blood pressure monitoring in laboratory rodents via implantable radio telemetry. Methods in Molecular Biology. 573, 57-73 (2009).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), 3496 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Sydney/New York. (2014).
- Scislo, T. J., Augustyniak, R. A., O'Leary, D. S. Differential arterial baroreflex regulation of renal, lumbar, and adrenal sympathetic nerve activity in the rat. American Journal of Physiology. 275, R995-R1002 (1998).
- Kopp, U. C., Jones, S. Y., DiBona, G. F. Afferent renal denervation impairs baroreflex control of efferent renal sympathetic nerve activity. American Journal of Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 295 (6), R1882-R1890 (2008).
- Guild, S. J., et al. Quantifying sympathetic nerve activity: problems, pitfalls and the need for standardization. Experimental Physiology. 95 (1), 41-50 (2010).
- Stocker, S. D., Hunwick, K. J., Toney, G. M. Hypothalamic paraventricular nucleus differentially supports lumbar and renal sympathetic outflow in water-deprived rats. Journal of Physiology. 15 (563 Pt 1), 249-263 (2005).
- Stocker, S. D., Gordon, K. W. J. Glutamate receptors in the hypothalamic paraventricular nucleus contribute to insulin-induced sympathoexcitation. Neurophysiology. 113 (5), 1302-1309 (2015).
- Saponjic, J., Radulovacki, M., Carley, D. W. Injection of glutamate into the pedunculopontine tegmental nuclei of anesthetized rat causes respiratory dysrhythmia and alters EEG and EMG power. Sleep and Breathing. 9 (2), 82-91 (2005).
- DiBona, G. F., Jones, S. Y. Dynamic analysis of renal nerve activity responses to baroreceptor denervation in hypertensive rats. Hypertension. 37 (4), 1153-1163 (2001).
- Kunitake, T., Kannan, H. Discharge pattern of renal sympathetic nerve activity in the conscious rat: spectral analysis of integrated activity. Journal of Neurophysiology. 84 (6), 2859-2867 (2000).
- Machado, B. H., Bonagamba, L. G. Microinjection of L-glutamate into the nucleus tractus solitarii increases arterial pressure in conscious rats. Brain Research. 576 (1), 131-138 (1992).
- Murakami, M., et al. Inhalation anesthesia is preferable for recording rat cardiac function using an electrocardiogram. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (5), 834-839 (2014).
- Nakamura, T., Tanida, M., Niijima, A., Hibino, H., Shen, J., Nagai, K. Auditory stimulation affects renal sympathetic nerve activity and blood pressure in rats. Neuroscience Letters. 416 (2), 107-112 (2007).
- Bardgett, M. E., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Glutamatergic receptor activation in the rostral ventrolateral medulla mediates the sympathoexcitatory response to hyperinsulinemia. Hypertension. 55 (2), 284-290 (2010).
- Brozoski, D. T., Dean, C., Hopp, F. A., Seagard, J. L. Uptake blockade of endocannabinoids in the NTS modulates baroreflex-evoked sympathoinhibition. Brain Research. 1059 (2), 197-202 (2005).
- Barman, S. M. What can we learn about neural control of the cardiovascular system by studying rhythms in sympathetic nerve activity? International Journal of Psychophysiology. 103, 69-78 (2016).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Comprehensive Physiology. 4 (2), 825-850 (2014).
- Malpas, S. C. Sympathetic nervous system overactivity and its role in the development of cardiovascular disease. Physiological Reviews. 90 (2), 513-557 (2010).
- Chen, W. W., Xiong, X. Q., Chen, Q., Li, Y. H., Kang, Y. M., Zhu, G. Q. Cardiac sympathetic afferent reflex and its implications for sympathetic activation in chronic heart failure and hypertension. Acta Physiologica. 213 (4), 778-794 (2015).
- Linz, D., et al. Modulation of renal sympathetic innervation: Recent insights beyond blood pressure control. Clinical Autonomic Research. , Epub ahead of print (2018).
