Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

Regulering af kromatin miljø er en afgørende proces kræves for korrekt genekspression. Her, vi beskriver en metode til at kontrollere genekspression gennem ansættelse af ændring af kromatin maskiner i en gen-specifikke og reversibel måde.

Abstract

Regulering af kromatin jordpakning er en vigtig proces, der styrer genekspression i højere eukaryoter. Selvom kromatin jordpakning og genregulering udtryk er almindeligt forstyrret i mange sygdomme, har et locus-specifikke, endogene og reversible metode til at studere og kontrollere disse virkningsmekanismer manglet. For at løse dette problem, har vi udviklet og karakteriseret roman gen-regulerende bifunctional molekyler. En del af den bifunctional molekyle binder sig til en DNA-protein anker så at det vil blive ansat til en allel-specifik locus. Anden komponenten engagerer endogene cellulære ændring af kromatin maskiner, rekruttere disse proteiner til et gen af interesse. Disse små molekyler kaldet kemisk epigenetiske modifikatorer (CEMs), er i stand til at kontrollere genekspression og kromatin miljø i en dosisafhængig og reversibel måde. Vi detalje her, en CEM tilgang og dens anvendelse til at formindske genekspression og Histon hale acetylation på en grøn fluorescerende proteiner (NGL) reporter beliggende på Oct4 locus i mus embryonale stamceller (mESCs). Vi karakteriserer føringen CEM (CEM23) ved hjælp af fluorescerende mikroskopi, flowcytometri og kromatin immunoprecipitation (ChIP), efterfulgt af en kvantitativ Polymerasekædereaktionen (qPCR). Mens styrken af dette system er demonstreret på locus Oct4 begrebsmæssigt, CEM-teknologi er modulopbygget og kan anvendes i andre celletyper og på andre genomisk loci.

Introduction

Kromatin består af DNA snoet omkring Histon octamer proteiner, der danner kernen nucleosome partikel. Regulering af kromatin jordpakning er en helt nødvendig mekanisme for ordentlig DNA reparation, replikering og udtryk1,2,3. En måde hvorpå celler styre niveauet af jordpakning er gennem tilføjelse eller fjernelse af forskellige posttranslationelle Histon hale ændringer. To sådanne ændringer omfatter (1) lysin acetylation, som er oftest forbundet med genaktivering, og (2) lysin methylering, som kan være forbundet med enten genaktivering eller undertrykkelse, afhængigt af konteksten aminosyre. Tilføjelsen af acetylation og methylering varemærkerne er katalyseret af Histon acetyltransferases (hatte) og Histon methyltransferases (HMTs), henholdsvis, der henviser til, at fjernelse af mærket er udført af Histon deacetyltransferase (HDAC'er) og Histon demethylases (P550 ), henholdsvis4,5. Selv om eksistensen af disse proteiner har været kendt i årtier, mange mekanismer af hvordan ændring af kromatin maskiner værker til korrekt regulere genekspression fortsat være defineret. Da kromatin lovgivningsprocesser er dysregulated i mange menneskelige sygdomme, kunne nye mekanistiske indblik føre til fremtidig terapeutisk anvendelse.

Kromatin i vivo assay (CiA) er en nylig beskrevet teknik, der bruger et kemisk inducer af nærhed (CIP) til at styre ændring af kromatin maskiner rekruttering til en specifik locus6. Denne teknologi har været brugt til at studere en voksende liste af kromatin dynamics, herunder ændring af Histon proteiner, kromatin remodelers og transskription faktorer6,7,8,9. CIP-baserede kromatin tøjring af eksogent udtrykte proteiner har også forlænget forbi CiA til at modulere ikke-modificerede genetiske loci ved brug med en deaktiveret grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager CRISPR-forbundet protein (dCas9) 10 , 11. i CiA-systemet, mESCs er blevet ændret for at give udtryk for en normal god landbrugspraksis reporter gen i Oct4 locus, et stærkt udtryk og strengt regulerede område af mESC genom. Tidligere, dette system er blevet anvendt til at beskrive dosisafhængig og reversible ansættelse af eksogent udtrykt heterochromatin protein 1 (HP1), et enzym, der binder H3K9me3 og overfører repressive mærker (f.eks.H3K9me3) og DNA methylering6. For at opnå denne form for rekruttering strategi, er mESCs inficeret med et plasmid, der udtrykker en FK506-bindende protein (FKBP) forbundet til en Gal4, som er en DNA-protein anker, der binder sig til en Gal4-binding array opstrøms af normal god landbrugspraksis reporter. Cellerne er også smittet med en FKBP-rapamycin-bindende domæne (FRB) forbundet til HP1. Når mESCs udsættes for lav nanomolar koncentrationer af CIP, rapamycin, både FRB og FKBP, er bragt sammen på target locus. Inden for dage af rapamycin behandling, udtryk for mål-genet er undertrykt, som det fremgår af Fluorescens mikroskopi og flow flowcytometri og Histon acetylation er faldet, vist af ChIP og bisulfite-sekventering. Mens udviklingen og valideringen af denne tilgang har været betydelige fremskridt inden for kromatin forskning og forordning, en ulempe er det krævede eksogene udtryk for ændring af kromatin maskiner.

For at gøre den teknologi baseret på rekruttering af kun endogene fysiologisk relevante enzymer og gøre en mere modulopbygget system, vi designet og kendetegnet roman bifunctional molekyler, betegnes CEMs (figur 1)12. En komponent i CEMs omfatter FK506, som svarer til rapamycin, bindes stramt og specifikt til FKBP. Således, CEMs vil stadig være ansat til Oct4 locus i CiA mESCs. Anden del af CEMs er en gruppe, der binder endogene ændring af kromatin maskiner. I en pilotundersøgelse testede vi CEMs, der indeholder HDAC-hæmmere. Mens begrebet ved hjælp af en inhibitor for at rekruttere HDAC'er synes counter-intuitive, er inhibitoren ikke desto mindre kan rekruttere HDAC aktivitet til gen af interesse. Dette opnås ved at (1) omdirigere HDAC til locus, frigiver enzymet, og øge tætheden af un-hæmmet HDAC'er i området og (2) opretholder HDAC-hæmning på locus, men rekruttere repressive komplekser, der binder til de hæmmet HDAC'er, eller (3) en kombination af begge. I en tidligere undersøgelse, viste vi, at CEMs var købedygtig med held undertrykke normal god landbrugspraksis reporter på en måde, afhængig af dosis og tidspunkt og på en måde, der var hurtigt reversible (dvs.inden for 24 timer)12. Vi kendetegnet evne til CEM teknologi præsenteres her til kontrol genekspression ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, flowcytometri og evnen til at styre kromatin miljø ved hjælp af ChIP-qPCR6. Her, beskriver vi en metode til at bruge og kendetegner CEMs, som vil lette tilpasning af dette system til at besvare yderligere spørgsmål relateret til kromatin biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) celle linje kultur for at producere Lentivirus

  1. Vokse friske, lav-passage (mindre end passage 30) 293T menneskelige embryonale nyre (HEK) celler i høj-glucose Dulbecco ændrede Eagle er medium (DMEM) base media suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2. Opdel celler hver 3-5 d og før de bliver > 95% sammenflydende.
  2. Passage 293T HEK celler med 18 x 106 pr. 15-cm plade (en 15-cm plade for hver virus produceret).
    1. For en 15-cm format, Opsug den gamle medier, der tilsættes 10 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS), Aspirér PBS og tilsættes 3 mL 0,05% trypsin. Inkuber celler i trypsin for 8 min ved 37 ° C, rokkende og trykke celler halvvejs gennem inkubation.
      Bemærk: Målet med dette trin er at få cellerne til en enkelt celle suspension.
  3. Når cellerne har nået 60-80% confluency den følgende dag, udføre en polyethylenimine (PEI) Transfektion med 13,5 µg psPAX2 plasmid, 4,5 µg for pMD2.G plasmid, 18 µg for lentiviral-kompatible levering vektor med gen af interesse (dvs. , FKBP-Gal4), 108 µL af PEI og 1,8 mL Transfektion medier.
    1. Forsigtigt blandes DNA, PEI og Transfektion medier i en 15 mL konisk slange, inkuberes prøve ved stuetemperatur i 15 min og tilføje det dråbevis til 15-cm plade.
      Bemærk: Skal du bruge passende sikkerhed måler og følg alle institutionelle og laboratorium sikkerhedsprocedurer efter dette trin, som alle reagenser skal indeholde en levende virus.
  4. Efter 16 h Transfektion og inkubation i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2, Aspirér medierne og forsigtigt tilføje frisk 293 HEK medier (forvarmet i et 37 ° C vandbad) til 15-cm plader. Inkuber celler i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2 for 48 h, når medierne ændrer. Virussen er derefter klar til at blive høstet.

2) infektion af musen embryonale stamceller (mESC) med Lentivirus

  1. Vokse lav-passage (mindre end passage 35), feeder-gratis tilpasset CiA mESCs i high-glucose DMEM base media suppleret med 20% ESC-grade FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, Pen/Strep, 2-mercaptoenthanol og 1: 500 leukæmi hæmmer faktor (LIF) i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
    Bemærk: LIF er fremstillet af supernatanten opbevares i COS LIF-producerende celler, der er indsamlet i batch og frosset ved-80 ° C.
    1. Vokse celler på plader, der er forinkubereret for 1-3 h med 0,1% gelatine i 1 x PBS, og efterfølgende vaskes med 1 x PBS. Feed cellerne dagligt og opdele dem hver 2-3 d, afhængigt af deres tæthed.
      Bemærk: Morfologisk, embryonale stamceller (ES) kolonier skal være små, runde, og adskiller sig fra hinanden.
  2. Passage mESC i en 12-godt plade format (100.000 celler/brønd) 1 d før infektionen.
    1. Tælle celler med en hemocytometer. For celler dyrkes i 10 cm format, Opsug den gamle medier, der tilsættes 5 mL af 1 x PBS, Aspirér PBS og tilsættes 1 mL 0,25% trypsin. Inkuber celler i trypsin for 8 min ved 37 ° C, rokkende og trykke celler halvvejs gennem inkubation. Målet med dette trin er at få cellerne til en enkelt celle suspension.
  3. 48 timer efter medieskift fra 293T15-cm viral emballage celler fra trin 1.4, fjerne og overføre supernatanten til en 50 mL konisk slange.
  4. Der centrifugeres supernatanten ved 300 x g i 5 min at sammenpresse celle debris.
  5. Filtrer supernatanten gennem et 0,45 µm membran.
    Bemærk: Sørg for at bruge overfladeaktivt stof-fri celluloseacetat (SFCA) membraner, som nogle andre materialer kan bevare virus og reducere udbyttet.
  6. Koncentrere sig virus med ultracentrifugering, ved hjælp af en centrifuge med en SW32 rotor, og spinde det på 20.000 rpm (~ 72.000 x g) i 2,5 timer ved 4 ° C.
  7. Mens virussen koncentrerer sig under ultracentrifugering, behandle CiA mESCs i 12-godt plade med friske ES medier indeholdende 5 µg/mL af polybrene.
  8. Når virus fusionen har færdig, omhyggeligt Aspirér supernatanten og ophæve virus pelleten i 100 µL 1 x PBS (undgå overskydende bobler).
  9. Tilføje virus og 1 x PBS til en 1,5 mL mikrofuge tube. Vortex/ryste rør på 300 x g (eller ved den laveste indstilling) til fuldt suspendere virussen. Spin ned i røret i en mini bordplade der centrifugeres i 5-10 s til at fjerne boblerne.
  10. Tilsæt 30 µL af virus til hver brønd med en 12-godt plade. Swirl pladen og derefter centrifugeres plade på 1.000 x g i 20 min.
    Bemærk: Mængden af virus tilføjet kan varieres afhængigt af viral titer, der er omvendt relateret til levering konstruere størrelse.
    1. Alternativt, flash fryse virus med flydende kvælstof og opbevar den ved-80 ° C. Dog vil frysning virus sænke den virale titer.
  11. 12-godt pladen anbringes tilbage i 37 ° C inkubator og ændre medierne den følgende morgen (~ 16 h) senere med friske ES medier (som beskrevet i trin 2.1).
  12. Efter 48 h af infektion, skal du vælge for celler, integreret den virale plasmid ved at tilføje den passende antibiotikaet (dvs., 1,5 µg/mL af puromycin, 10 µg/mL af blasticidin m.v.). Ændre medierne dagligt og vaske cellerne med 1 x PBS, hvis et flertal af cellerne er flydende/døde. Holde udvalg medier på celler i 72-96 timer i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.

3) kemisk epigenetiske modifikatorer (CEM) s forberedelse og behandling

  1. Afbryde den pulveriserede CEM i dimethylsulfoxid (DMSO) til en bestand koncentration på 1 mM og en arbejdsgruppe koncentration af 100 µM.
  2. Efter cellerne har gennemgået en udvalg i 72-96 timer, opdelt på mESCs i en 12-godt format med 100.000 celler/brønd. Inkuber celler i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2 til 24 h. bagefter, forberede medier løsning af 100 nM CEM med ES medier. Bruge dette medie til at fodre CiA mESC med 1 mL/godt. For at tjene som en kontrol, holde et godt af celler uden nogen ekstra CEMs.
    1. Ændre medierne ved sugning gamle medier og tilsætning af 1 mL/godt af frisklavede CEM-holdige eller CEM-fri ES media hver 24 h for varigheden af et eksperiment.

4) analyse af udtryk af mikroskopi og flowcytometri

  1. Efter 48 timer af CEM behandling, billede celler uden CEM behandling og de celler, der er behandlet med 100 nM CEM ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Tage repræsentative billeder ved hjælp af fase eller brightfield for at optage mESC morfologi ved 20 X forstørrelse; cellerne skal have dannet runde kolonier, med et par differentierede celler. Under FITC fluorescens kanal, image begge celle betingelser.
  2. Isolere kontrol og CEM-behandlede celler til flowcytometri ved sugning medierne, vaske cellerne med 1 mL af 1 x PBS, sugning PBS og tilføje 0,25 mL 0,25% trypsin med EDTA for 8-10 min.
  3. Bekræfte, at cellerne er ikke længere i store klumper af ser i mikroskopet. Bruge en 20 X forstørrelse. Hvis cellerne ikke synes at være i en enkelt celle suspension, forsigtigt pipetteres op og ned med en P1000 pipette til fuldt trypsinize cellerne.
  4. Dæmpning af trypsin med 1 mL frisk medier og resuspend celler ved høj hastighed med en serologisk pipette (eller bruger en P1000 pipette og tip) indtil cellerne er i en enkelt celle suspension.
  5. Spin ned celler ved 300 x g i 5 min. aspirat supernatanten. Vask med 1 x PBS og recentrifuge celler. Opsug PBS supernatanten.
  6. Resuspenderes celle i 200 mL af FACS buffer (1 mM ethylendiamintetra syre [EDTA], 1 x PBS og 0,2% bovint serumalbumin [BSA]).
    1. Den samlede mængde af FACS buffer vil være afhængig af hvor mange celler er til stede, men koncentrationen skal 1.000-3.000 celler / µL. tæller antallet af celler i 3 prøver og gennemsnitlig koncentration af celler. Tilføje flere FACS buffer, hvis nødvendigt.
  7. Udføre flowcytometri på > 50.000 celler med betingede celler, at holde cellerne på is, når de ikke er at blive analyseret. Bruge en 530/40 filter (FITC, AF488, normal god landbrugspraksis, osv.) til at optage ændringerne i udtryk. Bestemme den korrekte fluorescerende spænding ved hjælp af en ubehandlet kontrolkultur celle prøve og indstille spændingen til har de fluorescerende peak være i midten af det optagede intensitet spektrum. Køre prøverne på en kappe hastighed på omkring 5.000 celler/s.
  8. Eksportere data og analysere FCS-filer på en flow flowcytometri program (dvs.FlowJo) ved gating først på forward scatter vs side scatter for levende celler og derefter på forward scatter højde vs område for slåbrokker. Derefter, visualisere normal god landbrugspraksis kanaldata på et histogram til at bestemme de relative normal god landbrugspraksis udtryk i den målrettede og styre populationer.

5) analyse af kromatin af kromatin Immunoprecipitation (ChIP) besøgt af qPCR

  1. Opdele mESCs i en 10-cm plade med 3 millioner celler og 10 mL ES medier (en 10 cm plade for hver eksperimenterende eller kontrollere betingelse). Den følgende dag tilsættes 10 mL af CEM-holdige eller CEM-frie medier. Efter 48 timer af CEM behandling, Opsug den gamle medier. Vask og Opsug celler med 5 mL af 1 x PBS. Næste, tage afstand celler med 0,25% trypsin, og slukke trypsin med 10 mL ES medier. Tælle og isolere et udsnit af 10 millioner celler pr. betingelse.
  2. Spin ned hver af de 10 millioner celle prøver på 300 x g i 5 min.
  3. Resuspend hver pellet i 10 mL 1 x PBS og recentrifuge celler ved 300 x g i 5 min.
  4. Resuspend hver pellet i 10 mL af CiA Fix buffer (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM ethylenglycol-bis [ß-aminoethyl ether]-N, N, N', N'-tetraacetic syre [EGTA] pH 8 og 100 mM natriumchlorid [NaCl]). Der tilsættes 1 mL af 11% formaldehyd løsning og umiddelbart invertere prøver 5 x - 10 x. Inkuber prøve ved stuetemperatur i 10 min.
  5. Der tilsættes 0,5 mL 2,5 M Glycin. Invertere prøver straks og inkuberes prøven i isbad i 5 min.
  6. Centrifugeres prøve på 1.200 x g i 5 min. ved 4 ° C. Opsug supernatanten.
  7. Resuspenderes i 10 mL af CiA skyl 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glycerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] og 0,25% Triton X100). Inkuber prøve på ice for 10 min. derefter centrifugeres det ved 1.200 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  8. Resuspenderes i 10 mL af CiA skyl 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 og 200 mM NaCl). Centrifugeres prøve på 1.200 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  9. Forsigtigt tilsættes 5 mL af CiA klipning buffer (0,1% SDS, 1 mM EDTA og 10 mM Tris pH 8) langs siderne af den koniske rør til at vaske eventuelle salt uden at forstyrre pelleten. Centrifugeres prøve på 1.200 x g i 3 min. ved 4 ° C. Gentag trinnet vask.
  10. Resuspenderes i 90 µL af CiA klipning buffer og frisk proteasehæmmere (brug en blanding af leupeptin, chymostatin og pepstatin A opløst sammen på 10mg/mL hver i DMSO at gøre en 1.000 x stamopløsning, hvilket gør en endelig koncentration på 10 µg/mL). Tilføje 10 µL af sonikering-styrke nanodroplets mens du holder alt på is13,14.
  11. Overføre 100 µL af opløsningen til et glasrør og cap røret.
  12. Der sonikeres prøver til 3,5 min (bestemt baseret på cellelinje og antallet af celler). For at undgå overophedning prøverne, skal du behandle prøverne i 2-min-maksimum cyklustider, overstiger den samlede sonikering tid 2 min.
    Bemærk: Den fokuserede ultrasonicator anvendte her funktioner med en høj frekvens (500 kHz). Kør maskinen ved en akustisk effekt af 55 W. Sonikering varighed bør være forudbestemt af hver individuel lab.
  13. Overføre hver sonicated kromatin prøve til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube. Spin rør på 8.000 x g i 2 min. ved 4 ° C.
  14. Til at analysere klipning effektivitet og kvantificere den relative mængde af kromatin følge ChIP kit producentens protokol.
    Bemærk: Bestemmer DNA koncentration spektrofotometrisk (f.eks.ved hjælp af et DNA nanodrop instrument), og køre ~ 200 ng af DNA på en 1%-agarosegel at kontrollere, at kromatin er sonicated til omtrent 200-500 basepairs (bp) i størrelse.
  15. Til at udføre immunoprecipitation og isolere kromatin, Følg ChIP kit producentens protokol.
    Bemærk: For immunoprecipitation af prøver med højere DNA koncentrationer, varm eluering buffer ved 37 ° C og elueres prøver 2 x med 30 µL af eluering buffer (spinning i 1 min. hver gang).
  16. For at udføre qPCR, skal du indlæse reagenserne i en 384-godt plade. Tilsæt 5 µL af 2 x asymmetrisk cyanine farvestof master mix, 2,5 µM hver primer, vand og 0,1 - 10 ng af DNA for hver reaktion.
    1. Design primere til at forstærke 50-100 bp amplikoner og CT værdier er normaliseret til et hus-holder gen, intracisternal A-type partikler (IAP).
      Bemærk: For yderligere qPCR metoder, se kit producentens protokol. Den primer, der bruges til at målrette Oct4 locus var: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Kontrol primer der anvendes til target IAP var: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Baseret på primere og den ønskede vare, køre qPCR med 40 cyklusser af en udgloedning temperatur på 60 ° C i 1 minut.
      Bemærk: De resulterende data blev quantitated ved hjælp af delta-delta Ct sammenligninger mellem prøver, med CiA:Oct4 normaliseret over IAP. De endelige analyseresultater vises som gennemsnit af tredobbelt eksperimentelle prøver, med fejl repræsenteret som standardafvigelsen fra middelværdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har for nylig udviklet CEMs og påvist, at denne teknologi kan anvendes til at regulere genekspression og kromatin miljø på en reporter locus i en dosisafhængig og reversibel måde. I figur 1vist CEM, CEM23, en model af bly. HDAC maskiner er rekrutteret til reporter locus af HDAC-hæmmer, som i dette tilfælde, er normal god landbrugspraksis reporter indsat i Oct4 locus.

Vi forsøgte at karakterisere CEM systemet på Oct4 locus i CiA mESCs. Fordi cellerne udtrykke normal god landbrugspraksis, var det muligt at hurtigt visualisere udtryk for reporter med Fluorescens mikroskopi. Cellerne blev afbildet efter 48 timer efter behandling med 100 nM af CEM23, sammen med ubehandlede celler. Fase billeder viser sund mESCs, hvilket er vigtigt, fordi usunde eller differentierede mESCs tyder på en ikke-specifik normal god landbrugspraksis undertrykkelse. Fluorescens billeder viser en lyse normal god landbrugspraksis udtryk i cellerne, kontrol og en reduceret udtryk for normal god landbrugspraksis i mESCs behandlet med CEM23. Repræsentative billeder vises i figur 2.

For at kvantificere ændringerne i normal god landbrugspraksis udtryk, blev flowcytometri brugt. Igen, CiA mESCs blev behandlet med 100 nM af CEM23 for 48 timer. Eksperimentelle celler behandles med CEM23 og kontrol celler blev forberedt til flowcytometri, ved hjælp af > 100.000 celler pr. prøve. Konsekvent, konstaterede vi en > 30% fald i normal god landbrugspraksis-udtrykker celler blandt disse blev behandlet med CEMs. En repræsentativ histogrammet er vist i figur 3.

Når beviser af CEM-induceret NGL gen expression fald blev vist, vi har testet for ændringer i kromatin miljø ved hjælp af ChIP. En vigtig faktor for at forberede ChIP prøver er omfanget af kromatin sonikering. For at få prøver som konsekvent og korrekt afrevne som muligt, blev 10 millioner celler sonicated for 3,5 minutter at få kromatin mellem 200 og 500 bp i størrelse (figur 4). Fordi vi den hypotese, at de repressive CEMs bindende til og rekruttere HDAC proteiner og undertrykkende komplekser til journalisten, vi har testet for ændringer i Histon hale acetylation. Histon 3 lysin 27 acetylation (H3K27ac) er almindeligt forekommende langs transcriptional startsted (TSS) af gener. Vi udførte ChIP med et antistof til H3K27ac og derefter udført en qPCR med primer sæt opstrøms og nedstrøms for TSS. Resultaterne viser, at en 48-timers behandling med 100 nM af CEM23 faldt niveauet af H3K27ac i target locus sammenlignet med kontrol celler ikke behandlet med CEMs (p < 0,01, tosidede Student's t-test med tre biologiske replikater, Figur 5).

Figure 1
Figur 1 : CEMs binder sig til den CiA:Oct4 locus gennem ansættelse på FKBP og tether endogene epigenetiske maskinen. Model af CEM systemet viser Gal4-FKBP som protein til DNA anker. FK506 del af CEM binder sig til FKBP og HDAC-hæmmer rekrutter endogene HDAC proteiner for at undertrykke normal god landbrugspraksis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Fluorescens billeder af musen embryonale stamceller (mESCs) med en CiA:Oct4 - Normal god landbrugspraksis reporter. Fluorescens mikroskopi billeder viser et fald i normal god landbrugspraksis udtryk på CEM behandling. Det øverste panel viser fase og fluorescerende billeder af mESCs vokset med ubehandlet medier. Bundpanelet viser fase og fluorescerende af mESCs behandlet med 100 nM af CEM23 for 48 timer. De billeder, tilpasset med tilladelse fra ACS syntetisk biologi12. Ophavsret (2018) American Chemical-Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Flow flowcytometri analyse quantitates et nedsat udtryk for normal god landbrugspraksis i mESCs ved CEM23 behandling. mESCs uden CEM23 (blå) sammenlignet med mESCs behandlet med 100 nM af CEM23 i 48 timer (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Sonikering af kromatin er ensartede, og en smear er synlig mellem 200 og 500 bp. For at udføre ChIP-qPCR, var kromatin fra mESCs sonicated. Hver prøve bestod cirka 10 millioner celler, som var sonicated for 3,5 minutter, til at producere ligeledes forskydes kromatin prøver mellem 200 og 500 bp i længden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 : CEM23 behandling forårsager et fald i H3K27ac på CiA locus. ChIP-qPCR blev udført for at teste for ændringer i kromatin miljø. Efter en 48-timers behandling med 100 nM af CEM23, et fald i H3K27ac blev observeret på CiA:Oct4 (**p < 0,01, tosidede Student's t-test med tre biologiske replikater. Fejllinjer udgør standardafvigelsen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskrev vi for nylig udviklede CEM systemet anvendes til at regulere genekspression og kromatin miljø på et specifikt gen i en dosisafhængig måde. Vi leverer en præcis metode til at studere dynamikken involveret i reguleringen af genekspression gennem selektiv rekruttering af specifikke endogene kromatin regulerede proteiner. Dette er en yderst modulære teknologi, der kan anvendes til at undersøge, hvordan forskellige protein - og kromatin-ændre komplekser arbejde i koncert til korrekt regulere kromatin miljøet, samt for at studere, hvordan disse processer er dysregulated, med den Fordelen ved at opnå gen specificitet.

Her, påvistes tre måder for at visualisere ændringer i kromatin struktur og gen udtryk med ny teknologi. Efter undertrykkelse af netbårne af specifikke målrettede loci med CEMs, kunne real-time ændringer i genekspression analyseres af Fluorescens mikroskopi. Derefter, kan ændringer i gen expression niveauer måles mere kvantitativt med flowcytometri på definerede slutpunkter. Endelig, ændringer af posttranslationelle epigenetiske mærker på kromatin blev undersøgt af ChIP; specifikt, i dette tilfælde, H3K27ac. Vi har ikke teste HDAC rekruttering med ChIP-qPCR på grund af mangfoldigheden af HDAC'er at handle i fællesskab på et enkelt locus. Det er sandsynligt, at en heterogene befolkning af HDAC-enzymer blev ansat, og det ville derfor være teknisk vanskeligt at teste dem alle af ChIP. I en tidligere offentliggjort arbejde, har vi vist, at den direkte ansættelse af HDAC3 af en GAL4 fusion forårsaget lignende aktivitet på gen expression og kromatin ændring af ChIP12. Hvis en ikke-fluorescerende reporter bliver moduleres, kan ændringer i genekspression også måles ved (1) en RNA udtryk analyse med omvendt transkriptase qPCR eller (2) protein udtryk med western blotting eller imaging og foretage flowcytometri med fluorescerende sekundære antistoffer.

I forhold til nuværende CIP-baserede teknikker som CiA system12har denne CEM teknologi fordelen, at rekruttere endogene epigenetiske modulatorer til target-genet. Omdirigere cellens egne maskiner skaber en mere fysiologisk relevante middel til at modulere udtryk. Eksogent udtrykker master enzymer, som hatte og transkriptionsfaktorer, kan medføre bivirkninger fra deres øgede udtryk, især mens ikke aktivt at blive rekrutteret til gen locus.

Mens denne artikel viser funktionerne i dette nye system med CEMs sammensat af HDAC-hæmmere, kan flere andre hæmmere eller protein personalekonsulenter syntetiseres i stedet for HDAC-hæmmer. For at opnå genaktivering, kan HAT inhibitor- eller HDMT inhibitor-baserede CEMs syntetiseres. For at undertrykke og derefter overexpress samme gen, er det muligt at behandle celler med en undertrykkende CEM, vaske dem med regelmæssige medier og derefter tilføje en aktiverende CEM. Dette ville muliggøre en ren system at studere dynamikken i rekruttere repressive og aktiverende komplekser til samme genomisk regionen. Når du udformer fremtidige CEMs, skal flere kendetegn overvejes, herunder celle permeabilitet, hæmmer potens, struktur og hæmmende kinetik. Linker længde mellem FK506 og personalekonsulent gruppe vil påvirke permeabilitet af CEMs, samt placeringen af de rekrutterede protein. Når man sammenligner to CEMs, der afveg kun i linker længde, var CEM med den kortere linker mere effektiv12. Mens det ikke har været testet direkte her, er den højere effektivitet et resultat af større celle permeabilitet. Vælge hæmmere med kemiske strukturer imødekommenhed over for ændringen uden at forstyrre den del, der binder det aktive sted på målet er også vigtig. Potens og specificiteten blev også anset for ved at vælge hæmmere med en høj potens og specificitet for en given kategori af proteiner. Kinetik af hæmning kan påvirke effektiviteten af CEMs. CEMs består af hæmmere med langsom-off satser tendens til at være mindre effektiv.

En begrænsning af den nuværende CEM teknologi er kravet om en Gal4-binding array på target gen locus. For at rekruttere CEMs til et andet område end Oct4 CiA locus, kan nogen af hundredvis af manipuleret Gal4 opstrøms aktivering sekvens (UAS) linjer tilgængelige til det videnskabelige samfund bruges. En måde systemet vil blive gjort mere modulære er ved at indarbejde en deaktiveret Cas9 (dCas9) med kemiske epigenetiske enzym rekruttering10,11,15. Denne nukleasen-døde protein fra CRISPR-Cas9-systemet vil stadig blive ansat til enhver region i genomet som en guide-RNA (gRNA) er udviklet, men det vil ikke skære DNA. Ved hjælp af en dCas9-FKBP fusion FKBP komponent vil rekruttere CEMs hvor dCas9 er ansat, hvilket øger den lethed og fleksibilitet af potentielle mål gener. Forestil dig at bruge denne teknologi til at målrette sygdom-relevante gener som en potentiel terapeutisk eller et middel til at reversibelt og tidsligt studere sygdomsmekanismer på niveauet kromatin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Hathaway og Jin laboratorierne for deres nyttige diskussioner. Forfatterne også takke Dan Crona og Ian MacDonald for deres kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet i en del af Grant R01GM118653 fra USA National Institutes of Health (til N.A.H.); og af tilskud R01GM122749, R01CA218600 og R01HD088626 fra det amerikanske nationale institutter for sundhed (til J.J.). Dette arbejde blev også støttet af en tier 3 og en studerende tilskud fra UNC Eshelman Institut for Innovation (N.A.H og A.M.C, henholdsvis). Yderligere finansiering fra en T-32 GM007092 (til A.M.C) støttet dette arbejde. Flow flowcytometri data blev opnået på UNC-Flow flowcytometri Core facilitet finansieret af en P30 CA016086 Cancer Center Core støtte tilskud til UNC-Lineberger Comprehensive Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

Bioteknologi sag 139 kemisk biologi bifunctional molekyler kemiske induceret nærhed kromatin forordning gen undertrykkelse Histon deacetylase Epigenetik kemiske epigenetiske modifikatorer CEMs
Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,… More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter