Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Published: September 20, 2018 doi: 10.3791/58222
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Summary

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Abstract

Regulering van de chromatine verdichting is een belangrijk proces dat genexpressie in hogere eukaryoten regelt. Hoewel chromatine verdichting en genregulatie expressie zijn vaak verstoord in veel ziekten, heeft een locus-specifieke, endogene en omkeerbare methode te bestuderen en deze controlemechanismen van actie ontbroken. Om aan te pakken dit probleem, hebben wij ontwikkeld en nieuwe gen-regulering bifunctionele moleculen gekenmerkt. Een onderdeel van het bifunctionele molecule bindt aan een DNA-proteïne-anker zodat het naar een allele-specifieke locus zullen worden aangeworven. De andere component bezighoudt endogene cellulaire chromatine-aanpassen machines, werven van deze eiwitten aan een gen van belang. Deze kleine moleculen, chemische epigenetische modifiers (CEMs), genaamd zijn geschikt voor het beheren van genexpressie en de chromatine milieu dosisafhankelijk en omkeerbare wijze. Hier, detail wij een CEM-aanpak en de toepassing ervan om genuitdrukking en Histon staart acetylation op een verslaggever van de groen fluorescente proteïne (GFP) gelegen op het Oct4 locus in muis embryonale stamcellen (mESCs) te verlagen. We karakteriseren de leiding CEM (CEM23) met behulp van fluorescentie microscopie en stroom cytometry chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door een kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR). Terwijl de kracht van dit systeem is gedemonstreerd op de locus Oct4 , conceptueel, de technologie van CEM is modulair en kan worden toegepast in andere celtypes, en op andere genomic loci.

Introduction

Chromatine bestaat van DNA, histone octamer eiwitten die de kern nucleosoom particle vormen gewikkeld. Regulering van de chromatine verdichting is een essentieel mechanisme voor goede DNA reparatie, replicatie en expressie1,2,3. Unidirectioneel in die cellen het toegangsniveau verdichting is door de toevoeging of verwijdering van verschillende posttranslationele Histon staart wijzigingen. Twee dergelijke wijzigingen omvatten lysine (1) acetylation, die wordt meestal geassocieerd met gene activering, en (2) lysine methylering, die kan worden gekoppeld aan gene activering of onderdrukking, afhankelijk van de context van het aminozuur. De toevoeging van de acetylation en methylation merken wordt gekatalyseerd door Histon acetyltransferases (hoeden) en Histon methyltransferases (HMTs), respectievelijk, overwegende dat de opheffing van het merk wordt gedaan door Histon deacetylases (HDACs) en Histon demethylases (HDMs ), respectievelijk4,5. Hoewel het bestaan van deze eiwitten is gekend voor decennia, veel mechanismen van hoe chromatine-aanpassen machines blijven werken voor het goed regelen van genexpressie vast te stellen. Aangezien chromatine regelgevingsprocessen dysregulated in vele ziekten bij de mens, kunnen nieuwe mechanistische inzichten leiden tot toekomstige therapeutische toepassingen.

De chromatine in vivo test (CiA) is een recent beschreven techniek die een chemische inductor van nabijheid (CIP gebruikt) om controle van machines werving chromatine-aanpassen aan een specifieke locus6. Deze technologie is gebruikt om te bestuderen van een groeiende lijst van chromatine dynamiek, waaronder eiwitten Histon-aanpassen, chromatine remodelers en transcriptie factoren6,7,8,9. CIP gebaseerde chromatine binden van exogenously uitgedrukt eiwitten is ook uitgebreid verleden CiA te moduleren van niet-gemodificeerde genetische loci door gebruik met een gedeactiveerde geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische wordt herhaald CRISPR-geassocieerde proteïne (dCas9) 10 , 11. in het systeem van de CiA, mESCs zijn gewijzigd om een verslaggever GFP-gen op de locus van Oct4 , een zeer uitgesproken en strikt gereguleerde gebied van het genoom mESC express. Eerder, dit systeem is toegepast om te beschrijven de dosisafhankelijk en omkeerbare aanwerving van exogenously uitgesproken heterochromatin eiwit 1 (ML1), een enzym dat bindt H3K9me3 en repressieve merken (bvH3K9me3) wordt doorgegeven en DNA Methylation van6. Om te bereiken dit soort rekruteringsstrategie, zijn de mESCs besmet met een plasmide die een FK506-bindend-proteïne (FKBP), gekoppeld aan een Gal4, die een DNA-proteïne-anker dat zich aan een scala van Gal4-bindende stroomopwaarts van het GFP-verslaggever bindt uitdrukt. De cellen zijn ook besmet met een FKBP-rapamycin-bindend domein (FRB) verbonden met HP1. Wanneer de mESCs worden blootgesteld aan lage nanomolar concentraties van het CIP, rapamycin, zowel FRB en FKBP, zijn samengebracht op de locus van het doel. Binnen enkele dagen van rapamycin behandeling, expressie van het target-gen wordt onderdrukt, zoals blijkt uit de fluorescentie microscopie en stroom cytometry en Histon acetylation daalt, aangetoond door ChIP en bisulfiet sequentiebepaling. Terwijl de ontwikkelings- en valideringsfase van deze aanpak aanzienlijke vooruitgang op het gebied van chromatine onderzoek en regelgeving zijn, een nadeel is de vereiste exogene uitdrukking van chromatine-aanpassen machines.

Te maken van de technologie op basis van werving van alleen endogene fysiologisch relevante enzymen en maken een meer modulair systeem, we ontworpen en gekenmerkt roman bifunctionele moleculen, systemen voor continue emissiemeting (Figuur 1)12genoemd. Een onderdeel van het CEMs bevat FK506 die, vergelijkbaar met rapamycin, strak en specifiek bindt aan FKBP. De CEMs zullen dus nog steeds worden aangeworven om de locus Oct4 in de mESCs van de CiA. De andere component van het CEMs is een groep die endogene chromatine-aanpassen machines bindt. In een pilot-studie, we getest CEMs die HDAC remmers bevatten. Hoewel het concept van het gebruik van een inhibitor van de omwenteling te werven HDACs contra-intuïtief lijkt, is de Inhibitor van de omwenteling toch kunnen aanwerven HDAC activiteit naar het gen van belang. Dit wordt bereikt door (1) het omleiden van de HDAC naar de locus, het vrijgeven van het enzym, en het verhogen van de dichtheid van niet-geremde HDACs in het gebied en (2) handhaving HDAC inhibition op de locus, maar het werven repressieve complexen die zich aan de geremde HDACs binden, of (3) een combinatie van beide. In een eerdere studie, we toonden dat het CEMs kundig voor met succes het onderdrukken van het GFP-verslaggever op een dosis - en tijd-afhankelijke manier, alsmede op een wijze die was snel omkeerbaar (dat wil zeggen, binnen 24 uur)12. We het vermogen van de technologie van de CEM hier gepresenteerd aan controle genexpressie met behulp van fluorescentie microscopie, cytometry van de stroom en de mogelijkheid om te controleren de chromatine-omgeving met behulp van de ChIP-qPCR6gekenmerkt. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik en karakteriseren van het CEMs, die de aanpassing van dit systeem vergemakkelijken zal te beantwoorden van aanvullende vragen met betrekking tot de chromatine biologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) lijn celkweek voor het produceren van Lentivirus

  1. Groeien vers, lage-passage (minder dan een passage 30) 293T menselijke embryonale nier (HEK) cellen in hoge-glucose Dulbecco Eagle gewijzigd van het medium (DMEM) base media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x van niet-essentiële aminozuren (NEAA), Pen / STREP, 2-mercaptoenthanol in een incubator 37 ° C met 5% CO2. De cellen splitsen elke 3-5 d en voordat ze > 95% heuvels.
  2. Passage 293T HEK cellen met 18 x 10-6 per plaat van 15 cm (één 15-cm plaat voor elke virus geproduceerd).
    1. Voor een 15 cm formaat, gecombineerd de oude media, voeg toe 10 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gecombineerd de PBS en voeg 3 mL trypsine van 0,05%. Incubeer de cellen in trypsine gedurende 8 minuten bij 37 ° C, schommelen en tik op de cellen halverwege de incubatie.
      Opmerking: Het doel van deze stap is om de cellen in een suspensie van eencellige.
  3. Wanneer de cellen 60-80 procent confluentie de volgende dag bereikt hebben, uitvoeren van een polyethylenimine (PEI) transfectie met 13,5 µg het plasmide psPAX2, 4.5 µg van de plasmide pMD2.G en 18 µg lentivirale-compatibele levering vector met het gen van belang (d.w.z. , FKBP-Gal4), 108 µL van PEI, en 1.8 mL van transfectie media.
    1. Voorzichtig mengen van het DNA, PEI en transfectie media in een conische buis 15 mL, Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en ontkleuring toevoegen aan de plaat van 15 cm.
      Opmerking: Gelieve gebruik juiste veiligheid maatregelen en volg alle institutionele en laboratorium veiligheidsprocedures na deze stap, als alle gebruikte reagentia zal bevatten een levend virus.
  4. Na 16 h van transfectie en incubatie in een incubator 37 ° C met 5% CO2, gecombineerd de media en verse 293 HEK media (voorverwarmde in een waterbad 37 ° C) voorzichtig toe te voegen aan de platen van 15 cm. Incubeer de cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 gedurende 48 uur nadat de media hebt gewijzigd. Het virus is vervolgens klaar om te worden geoogst.

2) infectie van muis embryonale stamcellen (mESC) met Lentivirus

  1. Lage-passage (minder dan een passage 35) groeien, feeder-gratis aangepast CiA mESCs in hoog-glucose DMEM base media aangevuld met 20% ESC-grade FBS, 10 mM HEPES, 1 x NEAA, Pen/Strep, 2-mercaptoenthanol en 1:500 leukemie remmer factor (LIF) in een incubator 37 ° C met 5% CO2.
    Opmerking: De LIF wordt verkregen uit het supernatant van COS LIF-producerende cellen, die zijn verzameld in batch en bevroren bij-80 ° C.
    1. Het groeien van cellen op platen die zijn gepreïncubeerd voor 1-3 h met 0,1% gelatine in 1 x PBS, en vervolgens met 1 x PBS gewassen. De cellen dagelijks voeden en splitsen ze elke 2-3-d, afhankelijk van hun dichtheid.
      Opmerking: Morfologisch, embryonale stamcellen (ES) kolonies moeten kleine, ronde, en verschillend van elkaar.
  2. MESC passage in een formaat van 12-well plaat (100.000 cellen per putje) 1 d voorafgaand aan de infectie.
    1. Telt de cellen met een hemocytometer. Voor cellen gekweekt in het formaat van een 10-cm, gecombineerd de oude media, voeg 5 mL 1 x PBS gecombineerd de PBS en voeg 1 mL trypsine van 0,25%. Incubeer de cellen in trypsine gedurende 8 minuten bij 37 ° C, schommelen en tik op de cellen halverwege de incubatie. Het doel van deze stap is om de cellen in een suspensie van eencellige.
  3. 48 uur na het wijzigen van de media van de 293T15-cm virale verpakking van cellen uit stap 1.4, verwijderen en het supernatant overbrengen in een conische buis van 50 mL.
  4. Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 5 min naar pellet cel puin.
  5. De bovendrijvende vloeistof door een membraan van 0,45 µm filter.
    Opmerking: Maak gebruik van de oppervlakteactieve stof-vrije cellulose acetaat (SFCA) membranen, zoals sommige andere materialen kunnen behouden van virus en opbrengsten aanzienlijk te verminderen.
  6. Het concentreren van het virus met ultracentrifugatie, met behulp van een centrifuge met een SW32 rotor, en draaien het op 20.000 rpm (~ 72.000 x g) gedurende 2,5 uur bij 4 ° C.
  7. Terwijl het virus zich onder ultracentrifugatie concentreert, behandelen de mESCs van de CiA in de 12-well plaat met verse ES medium met 5 µg/mL polybrene.
  8. Wanneer de concentratie van het virus is voltooid, zorgvuldig gecombineerd het supernatant en Suspendeer de pellet virus in 100 µL van 1 x PBS (Vermijd overtollige bubbels).
  9. Het virus en 1 x PBS toevoegen aan een 1.5-mL microfuge buis. Vortex/schudden de buis bij 300 x g (of op de laagste instelling) om het virus volledig te schorsen. Spin naar beneden de buis in een centrifuge mini tafelblad voor 5-10 s te verwijderen van de bubbels.
  10. Voeg 30 µL van het virus aan elk putje van de plaat van een 12-well. Swirl van de plaat en vervolgens de plaat bij 1.000 x g gedurende 20 minuten centrifugeren.
    Opmerking: De hoeveelheid virus toegevoegd kan worden gevarieerd afhankelijk van de virale titer, die omgekeerd gerelateerd is aan de grootte van de constructie van de levering.
    1. U kunt ook flash bevriezen van het virus met vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C. Als u echter bevriezing van het virus, zal de virale titer lager.
  11. Plaats van de 12-well plaat terug in de 37 ° C incubator en wijzig de media de volgende ochtend (~ 16 h) later met verse ES media (zoals beschreven in stap 2.1).
  12. Na 48u van infectie, Selecteer voor cellen die de virale plasmide geïntegreerd door toevoeging van de juiste antibioticum (d.w.z., 1,5 µg/mL puromycin, 10 µg/mL blasticidin, enz.). De media dagelijks veranderen en wassen van de cellen met 1 x PBS indien een meerderheid van de cellen drijvende/doden zijn. Het medium van de selectie van de cellen gedurende 72-96 uur bewaren in een incubator 37 ° C met 5% CO2.

3) chemische epigenetische Modifiers (CEM) s voorbereiding en behandeling

  1. Schorten de poedervorm CEM in dimethylsulfoxide (DMSO) een voorraad concentratie van 1 mM en een werkende concentratie van 100 µM.
  2. Na de cellen hebben ondergaan de selectie voor 72-96 h, de mESCs splitsen in een formaat van 12-well met 100.000 cellen per putje. Incubeer de cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 voor 24 h. daarna, bereid een media-oplossing van 100 nM CEM met ES media. Gebruik deze media om de feed van de CiA mESC met 1 mL/goed. Houden om te dienen als een besturingselement, een putje van cellen zonder enige toegevoegde CEMs.
    1. Wijzig de media door zuigen oude media en toevoeging van 1 mL/goed van vers bereide CEM-bevattende of ES CEM-vrije media elke 24 uur voor de duur van een experiment.

4) analyse van de expressie door microscopie en Stroom Cytometry

  1. Na 48 uren van CEM behandeling, het beeld van de cellen zonder CEM behandeling en de cellen die zijn behandeld met 100 nM CEM met behulp van een fluorescentie Microscoop. Het nemen van representatieve beelden met behulp van fase of helderveld opnemen de mESC morfologie bij 20 X vergroting; de cellen moeten ronde kolonies, met een paar gedifferentieerde cellen hebben gevormd. Onder het FITC fluorescentie kanaal, het imago van beide voorwaarden cel.
  2. De controle- en CEM-behandelde cellen voor stroom cytometry isoleren door de media aspirating, wassen van de cellen met 1 mL 1 x PBS, aspirating van de PBS en toevoeging van 0,25 mL trypsine van 0,25% met EDTA voor 8-10 min.
  3. Controleer of de cellen niet langer in grote klontjes zijn door te kijken in de Microscoop. Gebruik een 20 X vergroting. Als de cellen niet lijken te worden een schorsing van de eencellige, Pipetteer zachtjes op en neer met een P1000 pipet om de cellen volledig te trypsinize.
  4. Doven van de trypsine met 1 mL verse media en resuspendeer de cellen op hoge snelheid met een serologische Pipet (of met behulp van een pipet P1000 en tip) totdat de cellen in een suspensie van eencellige.
  5. Spin down de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Aspirate het supernatant. Spoel met 1 x PBS en recentrifuge van de cellen. Gecombineerd het supernatant PBS.
  6. Resuspendeer de pellet cel in 200 mL FACS buffer (1 mM ethyleendiamminetetra zuur [EDTA], 1 x PBS en 0,2% bovien serumalbumine [BSA]).
    1. Het totale volume van FACS buffer zullen afhankelijk van hoeveel cellen aanwezig zijn, maar de concentratie moet 1000-3000 cellen / µL. tellen het aantal cellen in 3 monsters en het gemiddelde van de concentratie van cellen. Voeg meer FACS buffer indien nodig.
  7. Stroom cytometry uitvoeren op > 50.000 cellen met de zwevende cellen, houden van de cellen op ijs, wanneer zij niet worden geanalyseerd. Een 530/40-filter (FITC, AF488, GFP, etc.) gebruiken voor het vastleggen van de wijzigingen in de expressie. Bepalen van de juiste TL spanning met behulp van een onbehandelde cel controlemonster en stel de spanning te hebben van de fluorescerende piek in het midden van het spectrum opgenomen intensiteit. De monsters worden uitgevoerd met een schede snelheid van ongeveer 5.000 cellen/s.
  8. Exporteren van de gegevens en het analyseren van de FCS-bestanden op een stroom cytometry programma (dat wil zeggen, FlowJo) door het gating eerst op voorwaartse scatter vs. kant scatter voor levende cellen en vervolgens op forward scatter hoogte vs. gebied voor onderhemden. Vervolgens Visualiseer GFP kanaal gegevens in een histogram kunt bepalen van de relatieve GFP-expressie in de gerichte populaties.

5) analyse van chromatine door chromatine Immunoprecipitation (ChIP) gevolgde door qPCR

  1. Splitsen van de mESCs in een 10-cm plaat met 3 miljoen cellen en 10 mL van ES media (één 10-cm plaat voor elk experimenteel of besturingselement voorwaarde). De volgende dag, voeg 10 mL van CEM-bevattende of CEM-vrije media. Na 48 uren van CEM behandeling, gecombineerd de oude media. Wassen en de cellen met 5 mL 1 x PBS gecombineerd. Vervolgens distantiëren van de cellen met 0,25% trypsine en doven van de trypsine met 10 mL ES media. Tellen en isoleren van een steekproef van 10 miljoen cellen per voorwaarde.
  2. Spin down elk van de 10 miljoen celsteekproeven bij 300 x g gedurende 5 min.
  3. Resuspendeer elke pellet in 10 mL 1 x PBS en recentrifuge van de cellen bij 300 x g gedurende 5 min.
  4. Resuspendeer elke pellet in 10 mL CiA Fix buffer (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM ethyleenglycol-bis [ß-aminoethyl ether]-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra [EGTA] pH 8, en 100 mM natrium zuurchloride [NaCl]). Voeg vervolgens 1 mL van 11% formaldehyde-oplossing en meteen omkeren de monsters 5 x - 10 x. Incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  5. Voeg 0,5 mL 2,5 M glycine. De monsters onmiddellijk omkeren en Incubeer het monster op het ijs gedurende 5 minuten.
  6. Centrifugeer het monster bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie gecombineerd.
  7. Resuspendeer de pellet in 10 mL CiA Rinse 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glycerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40], en 0,25% Triton X100). Incubeer het monster op het ijs voor 10 min. na het centrifugeren op 1200 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  8. Resuspendeer de pellet in 10 mL CiA Rinse 2 (10 mM tris [hydroxymethyl] aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0.5 mM EGTA pH 8, en 200 mM NaCl). Centrifugeer het monster bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  9. Zachtjes Voeg 5 mL van de CiA schuintrekken buffer (0,1% SDS 1 mM EDTA en 10 mM Tris pH 8) langs de zijkanten van de conische buis afwassen zout zonder de pellet te verstoren. Centrifugeer het monster bij 1.200 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Herhaal de stap wassen.
  10. Resuspendeer de pellet in 90 µL van CiA schuintrekken buffer en verse proteaseinhibitors (gebruik een mengsel van leupeptin, chymostatin en pepstatin A samen op 10mg/mL elke in DMSO ontbonden te maken van een 1.000 x stockoplossing, waardoor een eindconcentratie van 10 µg/mL). Voeg toe 10 µL van ultrasoonapparaat-verbetering nanodroplets terwijl het houden van alles over ijs13,14.
  11. Breng 100 µL van de oplossing op een glazen buis en dop van de tube.
  12. Bewerk de monsters gedurende 3,5 minuten ultrasone trillingen ten (bepaald op basis van het aantal cellen en cellijn). Voorkom oververhitting en installeer de monsters door de monsters in 2-min-maximale cyclustijden verwerken als de totale ultrasoonapparaat keer groter is dan 2 min.
    Opmerking: De gerichte ultrasonicator gebruikt hier functies op een hoge frequentie (500 kHz). Start de machine op een akoestische kracht van 55 W. De ultrasoonapparaat duur moet worden bepaald door elke afzonderlijke lab.
  13. Elk monster sonicated chromatine overbrengen in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis. Draai de buizen bij 8.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.
  14. Ga als volgt te van de chipfabrikant kit protocol om te analyseren de shearing efficiëntie en te kwantificeren van de relatieve hoeveelheid chromatine.
    Opmerking: Bepaal de concentratie van DNA spectrophotometrically (bijvoorbeeldmet behulp van een instrument van DNA nanodrop), en stormloop ~ 200 ng van DNA op een 1% agarose gel om te verifiëren dat de chromatine is sonicated tot ongeveer 200-500 basepairs (bp) in grootte.
  15. Voor het uitvoeren van immunoprecipitation en isoleren van de chromatine, volg de ChIP kit fabrikant protocol.
    Opmerking: Voor de immunoprecipitation van monsters met hogere concentraties van DNA, de elutie buffer bij 37 ° C warm en elueer de monsters 2 x met 30 µL van elutie buffer (spinnen voor 1 min elke keer).
  16. Voor het uitvoeren van qPCR, de reagentia in een 384-well plaat te laden. Voeg 5 µL van 2 x asymmetrische cyanine kleurstof master mix, 2,5 µM van elk primer, water en 0.1 - 10 ng van DNA voor elke reactie.
    1. Ontwerp inleidingen tot het versterken van 50-100 bp waarbij en CT-waarden zijn genormaliseerd naar een house-keeping gen, intracisternal A-type deeltjes (IAP).
      Opmerking: Zie voor verdere qPCR methoden, van de fabrikant van de kit protocol. De set van de primer gebruikt te richten op de locus Oct4 was: (F) de CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. De primer van de controle instellen doel IAP gewend was: (F) de ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Gebaseerd op de inleidingen en het gewenste product, de qPCR met 40 cycli van een onthardende temperatuur van 60 ° C voor 1 min lopen.
      Opmerking: De resulterende gegevens was quantitated met behulp van de delta-delta Ct vergelijkingen tussen de monsters, met CiA:Oct4 over IAP genormaliseerd. De uiteindelijke analyseresultaten worden weergegeven als gemiddelden van drievoudige experimentele monsters, met de fout weergegeven als de standaarddeviatie van het gemiddelde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We onlangs ontwikkelde systemen voor continue emissiemeting en aangetoond dat deze technologie voor het regelen van genexpressie en de chromatine milieu op een verslaggever locus dosisafhankelijk en omkeerbare wijze kan worden toegepast. In Figuur 1wordt een model van het lood CEM, CEM23, weergegeven. HDAC machines is aangeworven om de verslaggever locus door de HDAC-inhibitor, die in dit geval de GFP-verslaggever aan de locus Oct4 ingevoegd.

Wij willen karakteriseren de CEM-systeem op de locus Oct4 in mESCs van de CiA. Omdat de cellen GFP uiten, bleek het mogelijk snel het visualiseren van de uitdrukking van de verslaggever met fluorescentie microscopie. De cellen waren beeld na 48 uur na behandeling met 100 nM CEM23, samen met onbehandelde cellen. De fase-afbeeldingen tonen gezonde mESCs, dat is belangrijk omdat ongezonde of gedifferentieerde mESCs op een niet-specifieke GFP repressie wijzen. De fluorescentie afbeeldingen tonen een heldere GFP-expressie in de cellen en een verminderde GFP-expressie in mESCs behandeld met CEM23. Representatieve afbeeldingen worden weergegeven in Figuur 2.

Om te kwantificeren van de wijzigingen in het GFP-expressie, werd stroom cytometry gebruikt. Nogmaals, de mESCs van de CiA werden behandeld met 100 nM van CEM23 voor 48 uur. Experimentele cellen behandeld met CEM23 en controle cellen waren voorbereid op stroom cytometry, cuvetten van > 100.000 per monster. Consequent, zien we een uiting van GFP cellen onder degenen behandeld met systemen voor continue emissiemeting afname van > 30%. Een representatieve histogram is afgebeeld in Figuur 3.

Zodra het bewijs van CEM-geïnduceerde GFP-gen expressie daling werd getoond, we getest voor veranderingen in de omgeving van de chromatine met behulp van de ChIP. Een belangrijke factor voor de voorbereiding van monsters voor ChIP is de omvang van de chromatine ultrasoonapparaat. Als u wilt dat de monsters als consistent en correct sheared mogelijk, werden 10 miljoen cellen sonicated 3,5 minuten aan het verkrijgen van de chromatine tussen 200 en 500 bp in grootte (Figuur 4). Omdat we veronderstelde dat de repressieve systemen voor continue emissiemeting waren binden aan en het werven van HDAC eiwitten en repressieve complexen aan de verslaggever, we getest voor veranderingen in Histon staart acetylation. Histon 3 Lysine 27 acetylation (H3K27ac) wordt algemeen gevonden langs de transcriptionele start site (TSS) van genen. Wij uitgevoerd ChIP met een antilichaam voor H3K27ac en vervolgens een qPCR met primer sets bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van de TSS. De resultaten tonen aan dat de behandeling van een 48-urige met 100 nM van CEM23 daalde het aantal H3K27ac op de doel-locus in vergelijking met cellen niet behandeld met systemen voor continue emissiemeting (p < 0,01, tweezijdige Student t-test met drie biologische wordt gerepliceerd, Figuur 5).

Figure 1
Figuur 1 : CEMs binden aan de CiA:Oct4 locus via rekrutering voor de FKBP en ketting endogene epigenetische machines. Het model van het systeem van CEM toont Gal4-FKBP als het anker van de eiwit-naar-DNA. Het FK506 gedeelte van de CEM bindt aan FKBP en de HDAC-inhibitor werft endogene HDAC eiwitten om te onderdrukken GFP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 2
Figuur 2 : Beelden van de fluorescentie van muis embryonale cellen (mESCs) met een CiA:Oct4 - GFP verslaggever. Fluorescentie microscopie beelden tonen een afname van de GFP expressie op CEM behandeling. Het hoogste paneel toont fase en fluorescerende beelden van mESCs gegroeid met onbehandelde media. Het onderste paneel toont fase en TL van de mESCs behandeld met 100 nM van CEM23 voor 48 uur. De afbeeldingen aangepast met toestemming van ACS synthetische biologie12. Auteursrecht (2018) American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 3
Figuur 3 : Stroom cytometry analyse kwantificeert een verminderde expressie van GFP in mESCs op een CEM23 behandeling. mESCs zonder CEM23 (blauw) werden vergeleken met mESCs behandeld met 100 nM van CEM23 voor 48 uur (rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 4
Figuur 4 : Ultrasoonapparaat van de chromatine is uniform, en een uitstrijkje is zichtbaar tussen 200 en 500 bp. Voor het uitvoeren van ChIP-qPCR, was de chromatine van mESCs sonicated. Elk monster bestaat uit ongeveer 10 miljoen cellen, die waren sonicated voor 3,5 minuten, ook geschoren chromatine metingen tussen 200 en 500 bp in lengte te geven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 5
Figuur 5 : CEM23 behandeling veroorzaakt een afname van de H3K27ac bij de CiA locus. ChIP-qPCR werd uitgevoerd om te testen voor veranderingen in de omgeving van de chromatine. Na een behandeling van de 48-urige met 100 nM van CEM23, een afname van de H3K27ac werd waargenomen bij CiA:Oct4 (**p < 0,01, tweezijdige Student t-test met drie biologische replicatieonderzoeken. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschreven hier, de onlangs ontwikkelde CEM systeem wordt toegepast voor het regelen van genexpressie en chromatine omgeving op een specifiek gen op een dosis-afhankelijke manier. Wij bieden een nauwkeurige methode om te studeren van de dynamiek die betrokken zijn bij het reguleren van de genexpressie door de selectieve aanwerving van specifieke endogene chromatine regelgevende eiwitten. Dit is een zeer modulair technologie die kan worden toegepast om te onderzoeken hoe de verschillende eiwit - en chromatine-aanpassen complexen werken samen aan goed reguleren het chromatine milieu, alsmede over het bestuderen hoe deze processen zijn dysregulated, met de voordeel van het bereiken van gen specificiteit.

Hier werden drie manieren gedemonstreerd om te visualiseren van wijzigingen in de chromatine structuur en gen-expressie met nieuwe technologie. Na de verstoring van de specifieke gerichte loci met systemen voor continue emissiemeting, kunnen real-time wijzigingen in genexpressie worden geanalyseerd door fluorescentie microscopie. Vervolgens kunnen veranderingen in gen expressie niveaus meer kwantitatief worden gemeten met stroom cytometry op gedefinieerde eindpunten. Ten slotte, wijzigingen in posttranslationele epigenetische merken op chromatine werden onderzocht door ChIP; specifiek, in dit geval, H3K27ac. We testen HDAC werving met ChIP-qPCR niet vanwege de diversiteit van de HDACs die in concert in een interne locus handelen. Het is waarschijnlijk dat een heterogene populatie van HDAC enzymen werd gerekruteerd en daarom zou het technisch moeilijk om ze te testen alle door ChIP. In een eerder gepubliceerd werk, hebben we aangetoond dat de directe werving van HDAC3 ontstaan door een fusie van GAL4 soortgelijke activiteit op gen-expressie en chromatin wijziging door ChIP12 veroorzaakt. Als een niet-fluorescerende verslaggever wordt gemoduleerd, kunnen wijzigingen in genexpressie ook worden gemeten (1) een analyse van de expressie RNA met reverse-transcriptase qPCR of (2) eiwit expressie met het westelijke bevlekken of imaging en geleidende stroom cytometry met fluorescerende secundaire antilichamen.

Met betrekking tot de huidige CIP gebaseerde technieken zoals de CiA systeem12heeft deze CEM-technologie het voordeel van het werven van endogene epigenetische modulatoren aan het target-gen. Omleiden van de cel van eigen machines maakt een meer fysiologisch relevante middelen voor het moduleren van de expressie. Bijwerkingen van hun verhoogde expressie, vooral tijdens het niet actief wordt gerekruteerd om de gene locus kan exogenously uiten master enzymen, zoals hoeden en transcriptiefactoren, leiden.

Terwijl dit artikel de functionaliteit van dit nieuwe systeem met systemen voor continue emissiemeting samengesteld uit HDAC remmers toont, kunnen verschillende andere remmers of eiwit recruiters worden gesynthetiseerd in plaats van de HDAC-inhibitor. Om te bereiken van gen activering, kunnen HAT Inhibitor van de omwenteling- of HDMT remmer gebaseerde systemen voor continue emissiemeting worden gesynthetiseerd. Om te onderdrukken en vervolgens hetzelfde gen overexpress, is het mogelijk om de cellen met een repressieve CEM behandelen, wassen met reguliere media, en vervolgens een activerend CEM. Dit zou zorgen voor een schoon systeem te bestuderen van de dynamiek van het werven van repressieve en activerend complexen tot de zelfde genomic regio. Bij het ontwerpen van toekomstige systemen voor continue emissiemeting, moeten verschillende kenmerken worden overwogen, met inbegrip van de permeabiliteit van de cel, remmer potentie, structuur en remmende kinetiek. De lengte van de linker tussen FK506 en de recruiter groep beïnvloedt de permeabiliteit van het CEMs, evenals de positie van de aangeworven proteïne. Bij het vergelijken van twee systemen voor continue emissiemeting die alleen in linker lengte verschilden, betekent dit dat de CEM met de kortere linker effectiever12was. Terwijl het niet is getest direct hier, is de hogere effectiviteit een gevolg van grotere doorlaatbaarheid van de cel. Remmers met chemische structuren vatbaar voor wijziging kiezen zonder het verstoren van het gedeelte dat de actieve site van het doel bindt is ook belangrijk. De potentie en specificiteit bevonden zich ook door het selecteren van remmers met een hoge potentie en specificiteit voor een gegeven klasse van eiwitten. De kinetiek van remming invloed kan hebben op de effectiviteit van het CEMs. Systemen voor continue emissiemeting bestaat uit remmers met langzaam aan / uit-tarieven zijn doorgaans minder effectief.

Een beperking van de huidige CEM-technologie is de eis van een Gal4-bindende-array op de doelgroep gene locus. Te werven CEMs naar een regio dan de locus Oct4 CiA , kan elk van de honderden gemanipuleerde Gal4 stroomopwaarts activering sequentie (UAS) lijnen beschikbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap worden gebruikt. Het systeem geschiedt meer modulaire unidirectioneel is door het opnemen van een gedeactiveerde Cas9 (dCas9) met chemische epigenetische enzym werving10,11,15. Dit nuclease-dode eiwit van het CRISPR-Cas9-systeem zal nog steeds worden gerekruteerd om elk gebied van het genoom waarnaar een gids-RNA (gRNA) is ontworpen, maar het zal niet het snijden van het DNA. Met behulp van een dCas9-FKBP-fusion, de FKBP-component zal werven het CEMs waar de dCas9 is aangeworven, het gemak en de flexibiliteit van potentiële doelgenen sterk te verhogen. Stel met behulp van deze technologie te richten op ziekte-relevante genen als een potentieel therapeutische of een middel om te omkeerbaar en stoffelijk studie ziekte mechanismen op het niveau van de chromatine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank de leden van de Hathaway en Jin laboratoria voor hun nuttige discussies. De auteurs worden Dan Crona en Ian MacDonald ook bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Grant R01GM118653 van de Amerikaanse National Institutes of Health (aan N.A.H.); en door subsidies R01GM122749, R01CA218600, en R01HD088626 van de Amerikaanse nationale instituten voor gezondheid (bij J.J.). Dit werk werd ook ondersteund door een tier 3 en een student van het UNC-Eshelman Instituut voor innovatie verlenen (N.A.H en A.M.C, respectievelijk). Extra financiering van een T-32 GM007092 (A.M.C) ondersteund dit werk. Stroom cytometry gegevens is verkregen op de UNC-Stroom Cytometry Core faciliteit gefinancierd door een P30 CA016086 Cancer Center Core ondersteuning subsidie aan de UNC-Lineberger uitgebreide Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Corning 10-013CV
NEAA Gibco 11140-050
HEPES (for tissue culture) Corning 25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol) Gibco 21985-023
FBS Atlantic Biologicals S11550 Individual lots tested for quality
Covaris tubes ThermoScientific C4008-632R
Covaris caps ThermoScientific C4008-2A
PEI (polyethylenimine) Polysciences 23966-1
Transfection media (Opti-mem) Gibco 31985070
Virus centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Virus filter membrane Corning 431220
Polybrene Santa Cruz Biotechnology SC134220
0.25 % Trypsin Gibco 25200-056 with EDTA
0.05 % Trypsin Gibco 25400-054 with EDTA
Puromycin InvivoGen ant-pr
Blasticidin InvivoGen ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) Roche 4913914001
H3K27ac antibody Abcam ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit Active Motif 53040
Sonicator Covaris E110
Ultracentrifuge Optima XPN-80
SW-32 centrifuge rotor Beckman Coulter 14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets Beckman Coulter 130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney Clontech 632180
PBS Corning 46-013-CM
BSA Fisher BP9700
EGTA Sigma E3889
EDTA Fisher S311-100
NaCl Fisher S271-1
Glycerol Fisher G33-1
Tris Fisher BP152
NP40 Roche 11754599001
Triton MP Biomedicals 807426
Glycine Fisher BP381-500
TE buffer Fisher BP2474-1
HEPES (for ChIP) Fisher BP310-100
Gelatin Sigma G1890
Flow cytometer, Attune NxT Thermo Fisher A24858
FKBP-Gal4 plasmid Addgene 44245
psPAX2 plasmid Addgene 12260
pMD2.G plasmid Addgene 12259
Nanodroplets MegaShear N/A
DNA Nanodrop Thermo Fisher ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin) Calbiochem/EMD 108975
Protease Inhibitors (Chymostatin) Calbiochem/EMD 230790
Protease Inhibitors (Pepstatin) Calbiochem/EMD 516481
CiA:Oct4 mESC The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells The kind gift of J. Wysocka

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Tags

Bioengineering kwestie 139 chemische biologie bifunctionele moleculen chemische geïnduceerde nabijheid chromatine verordening gene repressie histone deacetylase epigenetica chemische epigenetische parameters systemen voor continue emissiemeting
Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarella, A. M., Wang, T. A.,… More

Chiarella, A. M., Wang, T. A., Butler, K. V., Jin, J., Hathaway, N. A. Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers. J. Vis. Exp. (139), e58222, doi:10.3791/58222 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter