Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Summary

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Abstract

Regulierung von Chromatin Verdichtung ist ein wichtiger Prozess, der Gen-Expression in den höheren Eukaryotes regelt. Obwohl Chromatin Verdichtung und Genregulation Ausdruck allgemein bei vielen Krankheiten gestört werden, hat eine Locus-spezifische, endogene und reversible Methode zu studieren und steuern diese Wirkmechanismen gefehlt. Um dieses Problem zu beheben, haben wir entwickelt und neue gen-regulierende bifunktionelle Moleküle gekennzeichnet. Ein Bestandteil der bifunktionelle Molekül bindet an ein DNA-Protein-Anker, so dass es zu einem Allel-Spezifische Locus eingestellt werden. Die andere Komponente greift körpereigene zelluläre Chromatin-modifizierende Maschinen, Rekrutierung dieser Proteine zu einem gen des Interesses. Diese kleinen Moleküle, genannt chemischen epigenetische Modifikatoren (CEMs), sind in der Lage, Genexpression und die Chromatin-Umwelt in einer Dosis-abhängigen und reversible Weise zu kontrollieren. Hier zeigen wir ein CEM-Konzept und seine Anwendung auf die Genexpression und Histon Schweif Acetylierung auf ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporter am Oct4 Locus in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) zu verringern. Wir charakterisieren die Führung CEM (CEM23) mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von einer quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR). Während die Kraft dieses Systems auf die Oct4 Locus, konzeptionell nachgewiesen wird, die CEM-Technologie ist modular aufgebaut und kann in andere Zelltypen und an anderen genomic Loci angewendet werden.

Introduction

Chromatin besteht aus DNA umwickelt Octamer histonproteine, die das Kern-Nukleosom-Teilchen bilden. Regulierung von Chromatin Verdichtung ist ein wesentlicher Mechanismus für korrekte DNA-Reparatur, Replikation und Ausdruck^1,2,3. Ein Weg in die Zellen der Verdichtung zu kontrollieren ist durch das Hinzufügen oder Entfernen von verschiedenen Post-translationalen Histon-Tail-Modifikationen. Zwei solche Modifikationen umfassen (1) Lysin Acetylierung, die am häufigsten im Zusammenhang mit Genaktivierung ist, und (2) Lysin-Methylierung, die Genaktivierung oder Unterdrückung, je nach Aminosäure Kontext zugeordnet werden können. Die Zugabe der Acetylierung und Methylierung Marken ist von Histon-Acetyltransferases (Hüte) und Histon-Methyltransferasen (HMTs), bzw. katalysiert, während die Entfernung der Marke durch Histon Deacetylases (HDACs) und Histon-Demethylases (HDMs erfolgt ), bzw.^4,5. Obwohl die Existenz dieser Proteine ist seit Jahrzehnten bekannt, viele Mechanismen wie Chromatin-modifizierende Maschinen arbeitet, um richtig Genexpression regulieren noch festgelegt werden. Da Chromatin Regulationsprozesse Dysregulated bei vielen menschlichen Krankheiten sind, könnten zukünftige therapeutische Anwendungen neue mechanistische Einblicke.

Der Chromatin in Vivo Assay (CiA) ist eine kürzlich beschriebenen Technik, die eine chemische Induktor von Nähe (CIP) verwendet, um Chromatin-modifizierende Maschinen Rekrutierung Steuern zu einem bestimmten Locus-⁶. Diese Technologie wurde genutzt, um eine wachsende Liste von Chromatin Dynamik, einschließlich Histon-modifizierende Proteine, Chromatin Remodelers und Transkription Faktoren^6,7,8,9zu studieren. CIP-basierte Chromatin Anbindehaltung von exogen exprimierten Proteine wurde auch vorbei an CiA nicht veränderten genetischen Loci zu modulieren mittels mit einem deaktivierten gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt CRISPR-assoziierten Protein (dCas9) erweitert ^{10 , 11}. im CiA-System mESCs wurden geändert, um eine GLP-Reporter-gen bei Oct4 Locus, ein höchst ausgedrückt und streng reglementierten Bereich des Genoms mESC zum Ausdruck bringen. Zuvor wurde dieses System um die dosisabhängig und reversible Rekrutierung von exogen ausgedrückt Heterochromatin Protein 1 (HP1), ein Enzym zu beschreiben, die bindet H3K9me3 und breitet sich repressive Markierungen (z.B.H3K9me3) angewandt und DNA Methylierung⁶. Um diese Art von Recruiting-Strategie zu erreichen, sind die mESCs mit einem Plasmid infiziert, die drückt eine FK506-bindendes Protein (FKBP) verbunden mit einem Gal4, die eine DNA-Protein-Anker, der an eine Gal4-Bindung Array stromaufwärts von der GFP-Reporter bindet. Die Zellen sind auch mit einem FKBP-Rapamycin-bindende Domäne (FRB) verbunden mit HP1 infiziert. Wenn die mESCs gering nanomolaren Konzentrationen des CIP ausgesetzt sind, Rapamycin, FRB und FKBP, zusammengeführt in den Target Locus. Innerhalb von Tagen von Rapamycin Behandlung Ausdruck des Zielgens wird unterdrückt, wie Fluoreszenz-Mikroskopie und Flow-zytometrie belegt und Histon Acetylierung sinkt, von ChIP und Bisulfit Sequenzierung gezeigt. Während die Entwicklung und Validierung dieses Ansatzes bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Chromatin Forschung und Regulierung wurden, ein Nachteil ist die erforderliche exogene Ausdruck der Chromatin-modifizierende Maschinen.

Um die Technologie basiert auf Einstellung von nur endogene physiologisch relevanten Enzyme und machen einem modulares System, wir konzipiert und zeichnet sich neuartige bifunktionelle Moleküle, CEMs (Abbildung 1)¹²bezeichnet. Ein Bestandteil der CEMs umfasst FK506, die ähnlich wie Rapamycin, dicht und speziell bindet, FKBP. So werden der CEMs noch Oct4 Locus in der CiA-mESCs eingestellt werden. Die andere Komponente der CEMs ist eine Verbindungsgruppe, die endogenen Chromatin-modifizierende Maschinen bindet. In einer Pilotstudie getestet wir CEMs, die HDAC-Inhibitoren enthalten. Während das Konzept des Verwendens eines Inhibitors HDACs rekrutieren unlogisch erscheint, kann die Inhibitor dennoch HDAC-Aktivität, das Gen des Interesses zu rekrutieren. Dies geschieht durch (1) die HDAC umleiten auf Locus, Freigabe des Enzyms und Erhöhung der Dichte des UN-gehemmte HDACs in der Region und (2) die Aufrechterhaltung HDAC-Hemmung auf dem Lokus, aber Rekrutierung repressiven komplexe, die an die gehemmte HDACs binden, oder (3) eine Kombination aus beidem. In einer früheren Studie zeigten wir, dass die CEMs erfolgreich unterdrücken die GFP-Reporter in einer Zeit-dosisabhängige Weise, sowie in einer Weise konnten, schnell reversibel war (d. h.innerhalb von 24 Stunden)¹². Wir zeichnen die Fähigkeit der CEM-Technologie präsentiert hier Kontrolle Genexpression mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie und die Fähigkeit, um mittels ChIP-qPCR⁶Chromatin-Umgebung zu kontrollieren. Hier beschreiben wir eine Methode für die Verwendung und Charakterisierung der CEMs, die die Anpassung des Systems für zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit Chromatin Biologie erleichtern wird.

Protocol

(1) Linie Zellkultur zur Herstellung von Lentivirus

1. Wachsen frische, niedrig-Passage (weniger als 30 Durchgang) 293T menschlichen embryonalen (HEK) Nierenzellen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle ist Medium (DMEM) base Medien ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Stift / STREP, 2-Mercaptoenthanol in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂. Teilen Sie die Zellen jedes 3-5 d und zuvor werden sie > 95 % Zusammenfluss.
2. Durchgang 293T HEK Zellen mit 18 x 10⁶ / 15 cm Platte (ein 15-cm-Platte für jeden Virus produziert).
   1. Aspirieren Sie für ein 15-cm-Format die alten Medien, fügen Sie 10 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Aspirieren der PBS, und 3 mL 0,05 % Trypsin. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für 8 min bei 37 ° C, Schaukeln und tippen auf halbem Weg durch die Inkubation der Zellen.
      Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, die Zellen in eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
3. Wenn die Zellen 60-80 % Konfluenz am Folgetag erreicht haben, führen Sie eine Polyethylenimine (PEI) Transfektion mit 13,5 µg psPAX2 Plasmid, 4,5 µg des Plasmids pMD2.G, 18 µg Lentivirale kompatibel Lieferung Vektors mit dem gen des Interesses (d.h. , FKBP-Gal4), 108 µL des PEI und 1,8 mL Transfektion Medien.
   1. Vorsichtig mischen Sie die DNA, PEI und Transfektion Medien in einem 15 mL konische Röhrchen, inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 min und die 15-cm-Platte tropfenweise hinzufügen.
      Hinweis: Bitte verwenden Sie geeignete Sicherheit misst und folgen alle institutionellen und Laborverfahren Sicherheit nach diesem Schritt als alle Reagenzien werden einen live-Virus enthalten.
4. Aspirieren Sie nach 16 h der Transfektion und Inkubation in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂die Medien und die 15-cm-Platten fügen Sie vorsichtig frische 293 HEK Medien (im Wasserbad 37 ° C vorgewärmt hinzu). Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂ für 48 h nach der Medienwechsel. Das Virus ist dann reif für die Ernte.

(2) Infektion von Embryonalstammzellen der Maus (mESC) mit Lentivirus

1. Niedrig-Passage (weniger als 35 Durchgang) wachsen, Feeder-freie angepasst CiA mESCs in hoch-Glukose DMEM base Medien ergänzt mit 20 % ESC-Grade FBS, 10 mM HEPES, 1 X NEAA, Pen/Strep, 2 Mercaptoenthanol und 1: 500-Leukämie-Inhibitor Faktor (LIF) in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂.
   Hinweis: LIF wird aus der Überstand der COS-LIF-produzierenden Zellen gewonnen, die im Stapel gesammelt und bei-80 ° c eingefroren
   1. Wachsen Sie Zellen auf Tellern, die preincubated für 1-3 h mit 0,1 % Gelatine in 1 X PBS, und anschließend mit 1 X PBS gewaschen wurden. Füttern Sie die Zellen täglich und teilen Sie sie alle 2-3-d, je nach ihrer Dichte.
      Hinweis: Morphologisch, embryonale Stammzellen (ES) Kolonien klein, rund, und voneinander sollte.
2. Die Passage mESC in ein 12-Well-Plattenformat (100.000 Zellen/na) 1D vor der Infektion.
   1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Aspirieren Sie für Zellen in einem 10-cm-Format gewachsen die alten Medien, fügen Sie 5 mL 1 X PBS Aspirieren der PBS und fügen Sie 1 mL Trypsin 0,25 %. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für 8 min bei 37 ° C, Schaukeln und tippen auf halbem Weg durch die Inkubation der Zellen. Das Ziel dieses Schrittes ist es, die Zellen in eine einzelne Zelle Suspension bekommen.
3. 48 h nach dem Wechsel der Medien von der 293T15-cm-virale Zellen aus Schritt 1.4, Verpackung entfernen und den überstand auf eine 50 mL konische Rohr übertragen.
4. Zentrifugieren des Überstands bei 300 X g für 5 min zu zellenrückstand Pellets.
5. Filtern des Überstands durch einen 0,45-µm-Membran.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, tensidfreien Cellulose-Acetat (SFCA) Membranen zu verwenden, wie einige andere Materialien Virus behalten und Erträge deutlich reduzieren können.
6. Konzentrieren Sie, das Virus mit Ultrazentrifugation, mit Hilfe einer Zentrifuge mit SW32 Rotor, und drehen Sie es mit 20.000 u/min (~ 72.000 X g) 2,5 h bei 4 ° C.
7. Während sich das Virus unter Ultrazentrifugation konzentriert, behandeln Sie der CiA-mESCs in der 12-Well-Platte mit frischen ES Medium mit 5 µg/mL Polybrene.
8. Nach Abschluss der Viruskonzentration sorgfältig Aspirieren den überstand und hängen Sie das Virus Pellet in 100 µL 1 X PBS (Vermeidung von überschüssigen Luftblasen).
9. Fügen Sie das Virus und 1 X PBS zu einem Schlauch 1,5 mL Microfuge. Vortex/Schütteln der Röhre bei 300 x g (oder bei der niedrigsten Einstellung), das Virus vollständig auszusetzen. Spin-down das Rohr in einer Mini-Tischplatte Zentrifuge für 5-10 s um Luftblasen zu entfernen.
10. Geben Sie 30 µL des Virus in jedem ein 12-Well-Platte. Schwenken Sie die Platte und dann Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 X g für 20 min.
    Hinweis: Der Virusmenge hinzugefügt kann abhängig von der viralen Titer variiert werden die umgekehrt mit Lieferung Konstrukt Größe zusammenhängt.
    1. Alternativ Flash das Virus mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c Lagern Allerdings senkt das Einfrieren der Virus viral Titer.
11. Die 12-Well Platte wieder in den Inkubator 37 ° C und wechseln Sie das Medium am nächsten Morgen (~ 16 h) später mit frischen ES Medien (wie in Schritt 2.1 beschrieben).
12. Wählen Sie nach 48 h der Infektion für Zellen, die das virale Plasmid integriert durch Zugabe von geeigneten Antibiotikums (z.B. 1,5 µg/mL von Puromycin, 10 µg/mL Blasticidin, etc.). Ändern Sie die Medien täglich und waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS, wenn die Mehrheit der Zellen schwimmenden/Tote. Halten Sie die Auswahl-Medien auf die Zellen für 72-96 h in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂.

(3) chemische epigenetische Modifikatoren (CEM) s Vorbereitung und Behandlung

1. Suspendieren Sie die pulverisierte CEM in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), ein Lager Konzentration von 1 mM und eine arbeiten-Konzentration von 100 µM.
2. Nachdem die Zellen die Auswahl für 72-96 h unterzogen wurden, die mESCs in einem 12-Well-Format mit 100.000 Zellen/gut aufgeteilt. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO₂ für 24 h danach, bereiten eine Media-Lösung von 100 nM CEM mit ES-Media. Verwenden Sie dieses Medium, um feed der CiA mESC mit 1 mL/gut. Um als Kontrolle dienen, halten Sie eine gut von den Zellen ohne irgendwelche zusätzlichen CEMs.
   1. Wechseln Sie das Medium durch Absaugen von alten Medien und Hinzufügen von 1 mL/auch der frisch zubereiteten CEM-haltige oder CEM-frei ES Medien alle 24 h für die Dauer eines Experiments.

(4) Analyse des Ausdrucks von Mikroskopie und Durchflusszytometrie

1. Nach 48 Stunden CEM Behandlung, Bild, die ohne CEM Behandlung und die Zellen behandelt mit 100 nM CEM mit einem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie repräsentative Bilder mit Phase oder Hellfeld mESC Morphologie bei 20 X Vergrößerung aufzunehmen; die Zellen sollten Runde Kolonien, mit ein paar differenzierte Zellen gebildet haben. Unter dem FITC-Fluoreszenz-Kanal Bild beide Zelle Bedingungen.
2. Isolieren Sie die Kontrolle und CEM-behandelten Zellen für Durchflusszytometrie durch Absaugen der Medien, die Zellen mit 1 mL 1 X PBS waschen, Absaugen der PBS und Hinzufügen von 0,25 mL von 0,25 % Trypsin mit EDTA für 8-10 min.
3. Bestätigen Sie, dass die Zellen nicht mehr in großen Klumpen mit einem Blick in das Mikroskop. Verwenden Sie ein 20 X Vergrößerung. Wenn die Zellen nicht in einer einzelnen Zelle Suspension zu sein scheinen, pipette sanft nach oben und unten mit einer Pipette P1000, voll die Zellen trypsinize.
4. Die Trypsin mit 1 mL frische Medien zu stillen und Aufschwemmen der Zellen mit hoher Geschwindigkeit mit einer serologischen Pipette (oder unter Verwendung eines P1000 Pipette und Spitze) bis die Zellen in einer einzelnen Zelle Suspension sind.
5. Spin-down der Zellen bei 300 X g für 5 min. Aspirat überstand. Mit 1 X PBS waschen und wiederausschleudern der Zellen. Aspirieren des PBS Überstands.
6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 mL FACS-Puffer (1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure [EDTA], 1 X PBS und 0,2 % Rinderserumalbumin [BSA]).
   1. Das Gesamtvolumen der FACS-Puffer werden abhängig, wie viele Zellen vorhanden sind, sollte aber die Konzentration 1.000-3.000 Zellen / µL. die Anzahl der Zellen in 3 Proben und die Konzentration der Zellen im Durchschnitt. Fügen Sie weitere FACS-Puffer, wenn nötig.
7. Führen Sie Durchflusszytometrie > 50.000 Zellen mit den suspendierten Zellen, die Zellen auf dem Eis zu halten, wenn sie nicht analysiert werden. Verwenden Sie einen 530/40 Filter (FITC, AF488, GFP, etc.) für die Aufzeichnung der Änderungen im Ausdruck. Bestimmen Sie die entsprechende fluoreszierende Spannung mit einer unbehandelten Kontrolle Zellprobe und stellen Sie die Spannung zu fluoreszierenden Spitze in der Mitte des Spektrums aufgenommenen Intensität sein. Laufen Sie die Proben mit einer Hülle-Geschwindigkeit von rund 5.000 Zellen/s.
8. Exportieren Sie die Daten und analysieren Sie die FCS-Dateien auf einem Flow Cytometry Programm (d.h., FlowJo) durch Anspritzung zuerst auf forward Scatter vs. Side Scatter für lebende Zellen und dann auf forward Scatter Höhe vs. Bereich für Unterhemden. Dann visualisieren GFP-Channel-Daten auf ein Histogramm den relativen GFP-Ausdruck in die gezielte ermitteln und kontrollieren Populationen.

(5) Analyse von Chromatin von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von qPCR

1. Die mESCs in einer 10-cm-Platte mit 3 Millionen Zellen und 10 mL ES-Media aufgeteilt (eine 10-cm-Platte für jede experimentelle oder Kontrolle Zustand). Fügen Sie am folgenden Tag, 10 mL der CEM-haltige oder CEM-freie Medien. Aspirieren Sie nach 48 Stunden CEM Behandlung die alten Medien. Waschen Sie und Aspirieren Sie die Zellen mit 5 mL 1 X PBS. Als nächstes die Zellen mit 0,25 % Trypsin distanzieren, und Trypsin mit 10 mL ES-Media zu stillen. Zählen und eine Probe von 10 Millionen Zellen pro Zustand zu isolieren.
2. Spin-down jeweils 10 Millionen Zellproben 300 X g für 5 Minuten.
3. Jedes Pellet in 10 mL 1 X PBS aufschwemmen und die Zellen bei 300 X g für 5 min wiederausschleudern.
4. Aufschwemmen jedes Pellet in 10 mL CiA Fix Puffer (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM Ethylenglykol-BIZ [ß-Aminoethyl Äther]-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure [EGTA] pH 8 und 100 mM Natriumchlorid [NaCl]). Fügen Sie 1 mL 11 % Formaldehyd-Lösung und sofort umkehren Sie die Proben 5 x - 10 X. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 10 min.
5. 0,5 mL 2,5 M Glycin hinzugeben. Umkehren Sie die Proben sofort und inkubieren Sie die Probe für 5 min auf Eis.
6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand abgesaugt.
7. Das Pellet in 10 mL CiA spülen 1 Aufschwemmen (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10 % Glycerin, 0,5 % Nonidet p-40 [NP40] und 0,25 % Triton X100). Inkubation der Probe auf dem Eis für 10 min zentrifugieren es 1.200 x g für 5 min bei 4 ° c
8. Das Pellet in 10 mL CiA spülen 2 (10 mM Tris [macht] Aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 und 200 mM NaCl) aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 X g für 5 min bei 4 ° C.
9. Hinzugeben Sie 5 mL CiA Scheren Puffer (0,1 % SDS, 1 mM EDTA und 10 mM Tris, pH 8) entlang der Seiten des konischen Rohres Salz abwaschen ohne Unterbrechung das Pellet vorsichtig. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 X g für 3 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie die Waschschritt.
10. Aufschwemmen Sie das Pellet in 90 µL der CiA Scheren Puffer und frischen Protease-Inhibitoren (verwenden Sie eine Mischung aus Leupeptin, Chymostatin und Pepstatin A zusammen bei 10 mg/mL jeweils in DMSO zu 1.000 x-Stammlösung, wodurch eine Endkonzentration von 10 µg/mL aufgelöst). Fügen Sie 10 µL Beschallung steigernde Nanodroplets und dabei alles auf Eis^13,14.
11. 100 µL der Lösung in ein Glasrohr und Röhrchen Sie die.
12. Die Proben für 3,5 min beschallen (ermittelt anhand der Zell-Linie und die Anzahl der Zellen). Um eine Überhitzung der Proben, Proben zu verarbeiten 2-min-maximale Taktzeiten übersteigt die gesamte beschallungsdauer 2 min.
    Hinweis: Die fokussierte Ultrasonicator hier verwendete Funktionen mit hoher Frequenz (500 kHz). Laufen Sie die Maschine, bei einer akustischen Leistung von 55 w. Die Dauer der Beschallung sollte von jedem einzelnen Lab vorgegeben werden.
13. Übertragen Sie jede Probe beschallten Chromatin zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Drehen Sie die Rohre bei 8.000 X g für 2 min bei 4 ° C.
14. Die Schur Effizienz analysieren und die relative Menge des Chromatins zu quantifizieren, folgen Sie Kit Chiphersteller Protokoll.
    Hinweis: Die DNA-Konzentration spektralphotometrisch bestimmen (z. B.mit einem DNA-Nanodrop Instrument), und laufen ~ 200 ng DNA auf einem 1 % Agarose-Gel um sicherzustellen, dass das Chromatin, etwa 200-500 Basenpaaren (bp) in der Größe beschallt wird.
15. Immunopräzipitation durchführen und das Chromatin zu isolieren, Kit Chiphersteller Protokoll folgen.
    Hinweis: Für die Immunopräzipitation Proben mit höheren DNA-Konzentrationen den Elution Puffer bei 37 ° C warm und eluieren Proben 2 X mit 30 µL Elution Buffer (Spinnerei für 1 min jedes Mal).
16. Um qPCR durchzuführen, laden Sie die Reagenzien in einem 384-Well-Platte. Fügen Sie 5 µL 2 x asymmetrische Cyanin-Farbstoff-master-Mix, 2,5 µM jedes Primer, Wasser und 0,1 - 10 ng DNA für jede Reaktion.
    1. Design Primer um 50-100 bp Amplifikate und CT-Werte verstärken werden zu einem Haus-halten-gen, Intracisternal Typ A Partikel (IAP) normalisiert.
       Hinweis: Weitere qPCR Methoden finden Sie in der Kit-Hersteller Protokoll. Die Grundierung verwendet, um die Oct4 Lokus war: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Die Kontrolle Grundierung set Ziel IAP gewöhnt war: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. Basierend auf den Primer und das gewünschte Produkt, die qPCR mit 40 Zyklen einer annealing Temperatur von 60 ° C für 1 min laufen.
       Hinweis: Die resultierenden Daten war quantitated mit der Delta-Delta Ct Vergleiche zwischen Proben, mit CiA:Oct4 über IAP normalisiert. Die endgültige Analyse-Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von dreifacher experimentellen Proben mit dem Fehler als die Standardabweichung vom Mittelwert dargestellt angezeigt.

Representative Results

Wir vor kurzem CEMs entwickelt und gezeigt, dass diese Technologie zur Regulierung der Genexpression und Chromatin Umwelt an einen Ort der Reporter in einer Dosis-abhängigen und reversible Weise angewendet werden kann. In Abbildung 1ist ein Modell des potenziellen Kunden CEM, CEM23, dargestellt. HDAC-Maschinen ist, die Reporter-Locus von HDAC-Inhibitor rekrutiert, die in diesem Fall der GFP-Reporter an die Oct4 Locus eingefügt ist.

Wir wollten das CEM-System bei den Oct4 Locus in CiA mESCs charakterisieren. Weil die Zellen GFP Ausdrücken, war es möglich, den Ausdruck des Reporters mit Fluoreszenz-Mikroskopie schnell zu visualisieren. Die Zellen wurden abgebildet, nach 48 Stunden nach der Behandlung mit 100 nM CEM23, zusammen mit unbehandelten Zellen. Die Phasenbilder zeigen gesunde mESCs, was wichtig ist, da ungesunde oder differenzierte mESCs eine unspezifische GFP Unterdrückung hindeuten würde. Die Fluoreszenzbilder zeigen einen hellen GFP-Ausdruck in der Kontrollzellen und eine reduzierte GLP Ausdruck in mESCs mit CEM23 behandelt. Repräsentative Bilder sind in Abbildung 2dargestellt.

Um die Veränderungen in der GFP Expression zu quantifizieren, wurde Durchflusszytometrie verwendet. Wieder, der CiA-mESCs behandelt wurden, mit 100 nM CEM23 für 48 Stunden. Experimentelle Zellen mit CEM23 und Kontrolle Zellen behandelt wurden Durchflusszytometrie, mit > 100.000 Zellen pro Probe vorbereitet. Konsequent, beobachteten wir eine > 30 % Abnahme der GFP exprimierenden Zellen unter denen mit CEMs behandelt. Eine repräsentative Histogramm ist in Abbildung 3dargestellt.

Sobald Anzeichen für CEM-induzierte GFP Gen Ausdruck Abnahme gezeigt wurde, haben wir für Änderungen in der Chromatin-Umgebung mit ChIP getestet. Ein wichtiger Faktor für die Vorbereitung von Proben für ChIP ist das Ausmaß der Chromatin-Beschallung. Um die Proben als stimmig und richtig geschert wie möglich haben, wurden 10 Millionen Zellen für 3,5 Minuten zu Chromatin zwischen 200 und 500 bp in Größe (Abbildung 4) beschallt. Weil wir die Hypothese, dass der repressiven CEMs binden an und Rekrutierung von HDAC Proteine und repressiven komplexe, der Reporter, testeten wir für Änderungen in Histon Schweif Acetylierung. Histon 3 Lysin 27 Acetylierung (H3K27ac) wird häufig auf die transkriptionelle Startsite (TSS) von Genen gefunden. Wir für H3K27ac ChIP mit einem Antikörper durchgeführt und dann eine qPCR mit Grundierung Sets upstream und downstream von der TSS durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine 48-Stunden-Behandlung mit 100 nM CEM23 sank das Niveau der H3K27ac an den Target Locus im Vergleich zu Kontrollzellen nicht mit CEMs behandelt (p < 0,01, zweiseitigen Student t-Test mit drei biologischen repliziert, Abbildung 5).

Abbildung 1 : CEMs binden an die CiA:Oct4 Locus durch Anwerbung für die FKBP und Haltegurt endogenen epigenetische Mechanismen. Das Modell des CEM Systems zeigt Gal4-FKBP als Protein-DNA-Anker. Die FK506 Teil des CEM bindet an FKBP und HDAC-Inhibitor Rekruten endogenen HDAC Proteine um GFP zu unterdrücken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 2 : Fluoreszenzbilder von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) mit einer CiA:Oct4 - GFP Reporter. Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder zeigen einen Rückgang der GFP Ausdruck auf CEM Behandlung. Der obere Bereich zeigt Phase und fluoreszierende Bilder von mESCs mit unbehandelten Medien gewachsen. Die Bodenplatte zeigt Phase und Leuchtstofflampen von der mESCs behandelt mit 100 nM CEM23 für 48 Stunden. Adaptiert mit Erlaubnis von ACS synthetische Biologie¹²Bilder. Copyright (2018) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 3 : Flow Cytometry Analysis quantitates eine verminderte Expression von GFP in mESCs bei CEM23 Behandlung. mESCs ohne CEM23 (blau) wurden im Vergleich mit mESCs behandelt mit 100 nM CEM23 für 48 Stunden (rot). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 4 : Beschallung von Chromatin ist einheitlich, und ein Abstrich ist sichtbar zwischen 200 und 500 BP. Um ChIP-qPCR durchzuführen, war das Chromatin von mESCs beschallt. Jede Probe bestand aus ca. 10 Millionen Zellen, die für 3,5 Minuten beschallt wurden, um ebenso geschert Chromatin Proben zwischen 200 und 500 bp Länge zu produzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 5 : CEM23 Behandlung führt zu einen Rückgang der H3K27ac bei der CiA-Lokus. ChIP-qPCR wurde durchgeführt, um Veränderungen in der Chromatin-Umgebung testen. Nach einer 48-Stunden-Behandlung mit 100 nM CEM23, wurde eine Abnahme der H3K27ac bei CiA:Oct4 beobachtet (**p < 0,01, zweiseitigen Student t-Test mit drei biologische repliziert. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Discussion

Hier beschrieben wir die neu entwickelte CEM-System zur Regulierung der Genexpression und Chromatin-Umgebung auf ein bestimmtes Gen in einer Dosis-abhängigen Weise angewendet wird. Wir bieten eine genaue Methode zur Untersuchung der Dynamik bei der Regulierung der Genexpression durch die gezielte Rekrutierung von bestimmten endogenen Chromatin regulatorische Proteine beteiligt. Dies ist eine sehr modulare Technologie, die angewendet werden können um zu untersuchen, wie verschiedene Protein - und Chromatin-modifizierende komplexe Arbeiten im Konzert, der Chromatin-Umgebung richtig zu regulieren, um zu studieren, wie diese Prozesse werden Dysregulated, mit der profitieren Sie von Gen Spezifität zu erreichen.

Hier wurden drei Möglichkeiten demonstriert, um Veränderungen in der Chromatin Struktur und gen-Expression mit neuer Technologie zu visualisieren. Nach Störung der spezifische gezielte Loci mit CEMs konnten Änderungen in Echtzeit, Genexpression durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Dann könnten Veränderungen im Gen Ausdruck Niveaus mit Durchflusszytometrie an definierten Endpunkten mehr quantitativ gemessen werden. Zu guter Letzt wurden Änderungen an posttranslationale epigenetischen Markierungen auf Chromatin von ChIP geprüft. insbesondere in diesem Fall H3K27ac. Wir haben nicht HDAC Rekrutierung mit ChIP-qPCR wegen der Vielfalt der HDACs getestet, die zusammen auf einen einheitlichen Nenner agieren. Es ist wahrscheinlich, dass eine heterogene Bevölkerung von HDAC Enzyme eingestellt wurde, und daher es technisch schwierig wäre, sie alle von ChIP zu testen. Ein zuvor veröffentlichtes Werk haben wir bewiesen, dass die direkte Rekrutierung von HDAC3 durch eine GAL4-Fusion ähnliche Tätigkeit auf Gen-Ausdruck und Chromatin-Modifikation durch ChIP¹²verursacht. Wenn ein nicht-fluoreszierende Reporter moduliert wird, können Änderungen in der Genexpression auch durch (1) eine RNA Expressionsanalyse mit Reverse Transkriptase qPCR oder (2) Proteinexpression mit westliche Beflecken oder bildgebenden und Durchführung von Durchflusszytometrie mit gemessen werden fluoreszierende Sekundärantikörper.

In Bezug auf aktuelle CIP-basierte Techniken wie die CiA System¹²hat diese CEM-Technologie den Vorteil der Rekrutierung endogener epigenetischer Modulators, das Zielgen. Umleitung der Maschinerie der Zelle schafft mehr physiologisch relevanten Mittel modulieren Ausdruck. Exogen master Enzyme, wie Hüte und Transkriptionsfaktoren, zum Ausdruck zu bringen, könnte dazu führen, dass Nebenwirkungen von ihren erhöhten Ausdruck, vor allem beim nicht aktiv rekrutiert, um den gen-Locus.

Während dieser Artikel die Funktionalität dieses neuartigen Systems mit CEMs bestehend aus HDAC-Inhibitoren beschreibt, können mehrere andere Inhibitoren oder Protein Personalvermittler anstelle der HDAC-Inhibitor synthetisiert werden. Um Genaktivierung zu erreichen, können Hut Inhibitor- oder HDMT Inhibitor-basierte CEMs synthetisiert werden. Um zu unterdrücken und dann overexpress dasselbe gen, ist es möglich, die Zellen mit einer repressiven CEM zu behandeln, waschen Sie sie mit regelmäßigen Medien, und fügen Sie eine aktivierende CEM. Dies würde für ein sauberes System, die Dynamik der Rekrutierung von repressiven und aktivierende komplexe zur gleichen genomic Region studieren ermöglichen. Bei der Gestaltung der zukünftigen CEMs mehrere Merkmale müssen berücksichtigt werden, einschließlich der Zelle Permeabilität, Hemmer Potenz, Struktur und hemmenden Kinetik. Linker Abstand zwischen FK506 und Personalvermittler Glyko-wird die Durchlässigkeit der CEMs, sowie die Position des eingestellten Proteins beeinflussen. Beim Vergleich von zwei CEMs, die unterschieden sich nur in Linker Länge war die CEM mit der kürzeren Linker effektiver¹². Während es nicht direkt hier getestet wurde, ergibt sich die höhere Wirksamkeit der größere Durchlässigkeit der Zelle. Wichtig ist auch die Inhibitoren mit chemischen Strukturen zu Änderung ohne Unterbrechung des Teils, der aktiven Seite des Ziels bindet die Wahl. Die Wirksamkeit und Spezifität galten auch durch die Auswahl von Inhibitoren mit eine hohe Wirksamkeit und Spezifität für eine bestimmte Klasse von Proteinen. Die Kinetik der Hemmung kann Einfluss auf die Wirksamkeit der CEMs. CEMs bestehend aus Inhibitoren mit langsamen ein-/ Preise tendenziell weniger effektiv.

Eine Einschränkung der aktuellen CEM-Technologie ist die Anforderung eines Arrays Gal4-Bindung an den Target-gen-Locus. CEMs, einer anderen Region als der Lokus Oct4 CiA rekrutieren, können alle Hunderter von veränderter Gal4 vorgelagerten Aktivierung Sequenz (UAS) Linien der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung verwendet werden. Eine Möglichkeit, das System modularer gemacht werden, ist durch den Einbau einer deaktivierten Cas9 (dCas9) mit chemischen epigenetische Enzym Rekrutierung^10,11,15. Dieses Protein Nuclease-Toten aus dem CRISPR-Cas9-System wird immer noch in jeder beliebigen Region des Genoms eine Anleitung RNA (gRNA soll) rekrutiert werden, aber es wird nicht geschnitten, die DNA. Mit einer dCas9-FKBP-Fusion, die FKBP-Komponente wird der CEMs, wo die dCas9 eingestellt ist, rekrutieren die Leichtigkeit und Flexibilität potentielle Zielgene erhöht. Stellen Sie sich mit dieser Technologie zu krankheitsrelevanten Genen als ein therapeutisches Potenzial oder ein Mittel, um reversibel und zeitlich Krankheitsmechanismen auf dem Chromatin-Niveau studieren Ziel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (for tissue culture)	Corning	25-060-Cl
BME (2-Mercaptoethanol)	Gibco	21985-023
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	Individual lots tested for quality
Covaris tubes	ThermoScientific	C4008-632R
Covaris caps	ThermoScientific	C4008-2A
PEI (polyethylenimine)	Polysciences	23966-1
Transfection media (Opti-mem)	Gibco	31985070
Virus centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Virus filter membrane	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
0.25 % Trypsin	Gibco	25200-056	with EDTA
0.05 % Trypsin	Gibco	25400-054	with EDTA
Puromycin	InvivoGen	ant-pr
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye)	Roche	4913914001
H3K27ac antibody	Abcam	ab4729
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit	Active Motif	53040
Sonicator	Covaris	E110
Ultracentrifuge	Optima	XPN-80
SW-32 centrifuge rotor	Beckman Coulter	14U4354
SW-32 Ti centrifuge buckets	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 Human Embryonic Kidney	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
BSA	Fisher	BP9700
EGTA	Sigma	E3889
EDTA	Fisher	S311-100
NaCl	Fisher	S271-1
Glycerol	Fisher	G33-1
Tris	Fisher	BP152
NP40	Roche	11754599001
Triton	MP Biomedicals	807426
Glycine	Fisher	BP381-500
TE buffer	Fisher	BP2474-1
HEPES (for ChIP)	Fisher	BP310-100
Gelatin	Sigma	G1890
Flow cytometer, Attune NxT	Thermo Fisher	A24858
FKBP-Gal4 plasmid	Addgene	44245
psPAX2 plasmid	Addgene	12260
pMD2.G plasmid	Addgene	12259
Nanodroplets	MegaShear	N/A
DNA Nanodrop	Thermo Fisher	ND1000
Protease Inhibitors (Leupeptin)	Calbiochem/EMD	108975
Protease Inhibitors (Chymostatin)	Calbiochem/EMD	230790
Protease Inhibitors (Pepstatin)	Calbiochem/EMD	516481
CiA:Oct4 mESC	The kind gift of G. Crabtree
Lif-1C-alpha - producing Cos cells	The kind gift of J. Wysocka