Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie
Summary
Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.
Abstract
Het doel van de methode die wordt voorgesteld is om te laten zien, voor de eerste keer, van de transplantatie van pasgeboren thymi in de voorste oog kamer van isogene volwassen muizen voor in vivo longitudinale real-time bewaking van thymocytes´ dynamiek binnen een gevacuoliseerd Thymus segment. Na de transplantatie kan laser scanning microscopie (LSM) via het hoornvlies in vivo noninvasive herhaalde beeldvorming op het niveau van de cellulaire resolutie. Nog belangrijker is, de aanpak wordt toegevoegd aan eerdere intravital T-cel rijping imaging modellen de mogelijkheid voor continue progenitor cel werving en rijpe T-cel egress opnames in hetzelfde dier. Extra voordelen van het systeem zijn de transparantie van het geënte gebied, toelaat macroscopische snelle controle van de geïmplanteerde weefsels, en de toegankelijkheid van het implantaat waardoor gelokaliseerd naast systemische behandelingen. De belangrijkste beperking wordt het volume van het weefsel dat past in de beperkte ruimte van de kamer van de ogen die voor kwab trimmen eist. Integriteit van orgel wordt gemaximaliseerd door de ontrafeling van de thymus kwabben in patronen die eerder functioneel voor volwassen T-cel-productie te zien. De techniek is potentieel geschikt voor het ondervragen van een milieu van medisch relevante vragen met betrekking tot de functie van de thymus autoimmuniteit, immunodeficiëntie en centrale tolerantie; processen die mechanistically slecht gedefinieerde blijven. De fijne dissectie van mechanismen begeleiden thymocyte migratie, differentiatie en selectie moet leiden tot nieuwe therapeutische strategieën gericht op ontwikkeling T-cellen.
Introduction
Intrathymic differentiatie van de T-cel en T-cel populaties selectie vormen belangrijke processen voor de ontwikkeling en het onderhoud van cel-gemedieerde immuniteit in gewervelde dieren1. Dit proces omvat een complexe opeenvolging van strak georganiseerde evenementen, waaronder de aanwerving van progenitoren uit de bloedbaan, celproliferatie en migratie, differentiële expressie van membraaneiwitten en massale geprogrammeerde celdood voor subsets selectie. Het resultaat is de release van volwassen T-cellen reactieve tot een ruim spectrum van vreemde antigenen tijdens het weergeven van geminimaliseerde reacties op zelf-peptides, welke eind-up koloniseren de perifere lymfoïde organen van de afzonderlijke2,3. Afwijkende thymocyte selectie van het repertoire van de αβTCR leidt tot auto-immune ziekte of onbalans immuun4 die voornamelijk voortvloeien uit gebreken tijdens de processen van de voorloper van de negatieve of positieve selectie, respectievelijk.
Directionele migratie van thymocytes over de zwezerik is intrinsiek op alle stadia van T-cel rijping en het is bedoeld als een reeks van gelijktijdige of opeenvolgende meerdere stimuli, met inbegrip van chemokines, lijm, en de lijm extracellulaire matrix (ECM) eiwit interacties3,5. De studie van vaste weefsels heeft verricht kritische informatie over de patronen van meningsuiting voor de trekkende signalen van de thymocyte in de gedefinieerde serie microenvironments5,6, terwijl ex vivo studies is gebleken dat twee bekende trekkende gedrag van thymocytes in twee histologisch vlakken van het orgel: slow stochastic bewegingen in de cortex en snelle, beperkte beweeglijkheid in de medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. verhoogde trekkende tarieven correleren met serie positieve selectie13 en negatieve selectie wordt geassocieerd met kruipende gedrag ondersteunen de hypothese dat de kinetiek van de reis door de zwezerik juiste bepaalt rijping van de thymocytes. Ondanks hun relevantie blijven de topologie van thymocyte-stromale cellen interacties en de dynamiek van de beweeglijkheid van de thymocyte over orgel microenvironments tijdens de rijping van de T-cel vaag.
De meeste ex vivo studies tot dusver verrichte omvatten foetale of reaggregate serie orgel culturen14,15, weefsel segmenten of intact serie kwab explantaten waar thymocyte bewegingen worden gevisualiseerd door twee-foton laser scannen microscopie (TPLSM)8, een intravital beeldvormende techniek met een beperkte maximale afstand werken en imaging diepte van 1 mm overeenkomstig het weefsel onderzocht16. In tegenstelling tot de moeizame serie orgel-culturen die afhankelijk van uitgebreide incubatie keer aan formulier 3D-structuren zijn, zowel de serie segment techniek en de intact serie kwab aanpak vergunning gecontroleerd invoering van bepaalde deelverzamelingen van vooraf met het label thymocytes in een inheemse weefsel het platform omgeving. Echter, aangezien de doorbloeding is afwezig in deze modellen, ze zijn duidelijk beperkt voor het bestuderen van het recruitment proces van zwezerik afwikkeling progenitoren (TSPs) naar de thymus parenchym of de dynamiek van de serie egression van volwassen T-cellen.
In vivo modellen voor de studie van de serie T-rijping celfysiologie in muizen bevatten de transplantaties van fragmenten of gehele orgaan lobben geplaatst ofwel binnen de nier capsule17 of intradermaal18. Hoewel deze opties hun nut toonde te ondervragen systemische functionele engraftment van het weefsel, beperkt de positie van de serie transplantaten diep binnen het dier of gedekt door ondoorschijnend weefsellagen hun gebruik voor in vivo onderzoek van implantaten door TPLSM.
De voorste kamer van het oog voorziet in een gemakkelijk toegankelijke ruimte direct toezicht van een geënte weefsel op grond van de transparantie van de cornea lagen. Voordeel is de basis van de kamer gevormd door de iris rijk aan bloedvaten en autonome zenuwuiteinden, waardoor snelle revascularisatie en reinnervation van protheses19,20. Dr. Caicedo heeft deze anatomische ruimte met succes gebruikt voor het onderhoud en longitudinaal onderzoek naar alvleesklier eilandjes in de afgelopen21. Hier, laten we zien dat deze strategie vormt niet alleen een geldige benadering van thymocytes dynamiek binnen de structuur van de native orgel te studeren, maar ook uniek toelaat om uit te breiden de in vivo longitudinale opnamen naar de studie van voorlopercellen werving en rijpe T-cel egression stappen in muis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege het belang van het rijpingsproces van de T-cel voor individuele immuun competentie4 en de vermoedelijke gevolgen van voorloper cel dynamiek op volwassen T-cellen geproduceerd door de thymus2,3, hebben uitgebreide inspanningen geïnvesteerd om alternatieven te ontwikkelen voor de aanpak van de momentopname klassieke vaste weefsel.
Hoewel weefsel segmenten en andere explantaten duidelijk superieur zijn op …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) en R21ES025673 (AC), en door de beste/2015/043-subsidie (Consellería de Educació, cultura ik esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanje) (EO). Auteurs bedanken het team van de verzonden van de Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanje en Alberto Hernandez at Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanje voor hun hulp bij de video filmen en bewerken.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?. Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
