Real Time In Vivo Tracking af thymocytter i det forreste kammer i øjet ved Laser Scanning mikroskopi
Summary
Målet med protokollen er at vise langsgående intravital real-time tracking af thymocytter ved laser scanning mikroskopi i thymic implantater i mus øjet forkammeret. Gennemsigtigheden af hornhinden og vascularization af graften giver mulighed for uafbrudt optagelse stamfader celle rekruttering og modne T-celle udgang.
Abstract
Formålet med metoden fremlægges er at vise, for første gang, transplantation af nyfødte thymi i forreste øjet kammer af isogene voksne mus i vivo langsgående real-time overvågning af thymocytes´ dynamik inden for en vaskulariserede thymus segment. Efter transplantation giver laser scanning mikroskopi (LSM) gennem hornhinden i vivo noninvasive gentagne imaging på cellulære resolution niveau. Vigtigere, føjer fremgangsmåde til tidligere intravital T-celle modning imaging modeller mulighed for kontinuerlig stamfader celle rekruttering og modne T-celle egress optagelser i samme dyr. Yderligere fordele ved systemet er gennemsigtigheden af de podede område, tillader det makroskopiske hurtig overvågning af det implanterede væv, og adgangen til implantatet giver mulighed for lokaliseret ud over systemiske behandlinger. Den største begrænsning er volumen af væv, der passer i de reduceret plads øjet kammerets, som kræver for lap trimning. Orgel integritet er maksimeret ved at dissekere thymus lapper i mønstre tidligere vist sig at være funktionelle for modne T-celle produktion. Teknikken er potentielt velegnet til at afhøre en milieu af lægeligt relevante spørgsmål relateret til thymus funktion, der omfatter autoimmunitet, immundefekt og central tolerance; processer, som fortsat er mekanisk dårligt defineret. Den fine dissektion af mekanismer vejledende thymocyte migration, differentiering og udvalg bør føre til nye terapeutiske strategier rettet mod udviklingslandene T celler.
Introduction
Intrathymic T-celle differentiering og T-celle delpopulation udvalg udgør centrale processer til udvikling og vedligeholdelse af celle-medieret immunitet i hvirveldyr1. Denne proces indebærer en kompleks sekvens af stramt organiserede begivenheder, herunder ansættelse af stamfaderen fra blodbanen, celleproliferation og migration, differentierede udtryk af membranproteiner, og massive programmeret celledød for delmængder udvalg. Resultatet er udgivelsen af modne T-celler reaktiv til en rigelig spektrum af udenlandske antigener mens der vises minimeret svar til self-peptider, som ender op koloniserer de perifere lymfoide organer af individuelle2,3. Afvigende thymocyte udvalg af αβTCR repertoire fører til autoimmun sygdom eller immun ubalance4 der hovedsageligt stammer fra defekter under processerne af negative eller positive forløber udvalg, henholdsvis.
Retningsbestemt migration af thymocytter i thymus er iboende til alle faser af T-celle modning og det er planlagt som en serie af samtidige eller sekventiel flere stimuli, herunder kemokiner, selvklæbende, og de selvklæbende ekstracellulære matrix (ECM) protein interaktioner3,5. Studiet af faste væv har gjort vigtige oplysninger vedrørende mønstre af udtrykket for thymocyte vandrende stikord i definerede thymic microenvironments5,6, mens ex vivo undersøgelser har afsløret to fremherskende vandrende opførsel af thymocytter i to histologisk særskilte områder af orglet: langsom stokastiske bevægelser i cortex og hurtig, begrænset motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. øget vandrende satser korrelerer med thymic positive valg13 og negative valg er forbundet med kravlende adfærd støtter den hypotese, at kinetik af rejsen gennem thymus bestemmer korrekt modning af thymocytter. Trods deres relevans fortsat topologi af thymocyte-stromale celle interaktioner og dynamikken i thymocyte motilitet på tværs af orgel microenvironments under T-celle modning er uklare.
De fleste ex vivo undersøgelser udført til dato inkluderer føtal eller reaggregate thymic orgel kulturer14,15, væv skiver eller intakt thymic lobe explants hvor thymocyte bevægelser er visualiseret ved to-foton laser scanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital imaging teknik med begrænset maksimalt arbejde afstand og imaging dybde af 1 mm i overensstemmelse med vævet undersøges16. I modsætning til de besværlige thymic orgel kulturer, som afhænger af udvidede inkuberingstider til at danne 3D-strukturer, både thymic skive teknik og intakt thymic lap tilgang tillader kontrolleres indførelsen af særlige delmængder af forud mærket thymocytter i en native væv arkitektur miljø. Men, da blod flow er fraværende i disse modeller, de er klart begrænset til at studere rekrutteringsprocessen af thymus afregning stamfaderen (TSPs) til thymus parenkym eller dynamikken i thymic egression af modne T-celler.
In vivo modeller for studiet af thymic T-celle modning fysiologi i mus omfatter grafts fragmenter eller hele orgel lapper placeret enten inde i nyre kapsel17 eller intradermalt18. Selv om disse muligheder viste deres nytte at afhøre systemisk funktionel engraftment af væv, begrænser placeringen af thymic grafts dybt i dyret eller dækket af lag af uigennemsigtige væv deres brug i vivo undersøgelse af implantater af TPLSM.
Den forreste kammer i øjet giver en let tilgængelig plads til direkte overvågning af podede væv i kraft af gennemsigtighed af cornea lag. Fordel er bunden af salen dannet af iris rig på blodkar og autonome nerveender, muliggør hurtig revaskularisering og reinnervation grafts19,20. Dr. Caicedo har med held brugt denne anatomiske plads til vedligeholdelse og langsgående undersøgelse af pancreas Holme i de sidste21. Her, vi viser, at denne strategi udgør ikke kun en gyldig tilgang for at studere thymocytter dynamikken i native organ strukturen, men også unikt tillader for at udvide i vivo langsgående indspilninger i studiet af stamfader rekruttering og modne T-celle egression trin i musen.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af betydningen af T-celle modning processen for individuel immun kompetencevurdering4 og den formodede virkning af forløber celle dynamics på modne T-celler produceret af thymus2,3, er omfattende indsats blevet investeret at udvikle alternativer til den klassiske faste væv snapshot tilgang.
Selvom væv skiver og andre explants er klart overlegen i at gengive væv arkitektur end encellelag eller saml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) og R21ES025673 (AC), og den bedste/2015/043 grant (Consellería de Educació, cultura jeg esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Forfattere takke sendte holdet på Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien og Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien for deres hjælp med video filme og redigere.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?. Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
